DIRECCIÓN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES VALIDACIÓN DE MÉTODOS

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1 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 1 de 35

2 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 2 de 35 DIRECTORIO MVZ Enrique Sánchez Cruz Director en Jefe del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria MVZ. Hugo Fragoso Sánchez Director General de Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera QA Mayrén Cristina Zamora Nava Directora del Centro Nacional de Referencia de Plaguicidas y Contaminantes MC Alfredo Arias Ruiz Subdirector de Control y Análisis de Residuos LAE Daniel González Ávila Subdirector de Monitoreo y Evaluación de Calidad IQ Cruz Gudelio Palma Rosas Jefe del Departamento de Validación de Métodos QA Jocelyn Grethel Cedillo Saldaña Analista del Departamento de Validación de Métodos QA Danaé Itze Arvizu Bernal Analista del Departamento de Validación de Métodos QFB Juan José Hernández Soto Analista del Departamento de Validación de Métodos Tecámac, Edo. De México, enero de 2015

3 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 3 de 35 CONTENIDO 1. PROPOSITO 4 2. ALCANCE 4 3. REFERENCIAS 4 4. DESARROLLO VALIDACION DE METODOS CONFIRMACION DE IDENTIDAD REPETITIVIDAD REPRODUCIBILIDAD EXACTITUD, PRECISION Y RECUPERACION LINEALIDAD DEL METODO E INTERVALO DE TRABAJO LIMITE DE DETECCION LIMITE DE CUANTIFICACION ROBUSTEZ ESTIMACION DE INCERTIDUMBRE CRITERIOS DE ACEPTACION DE LOS PARAMETROS DE VALIDACION 35 5 ANEXOS

4 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 4 de PROPOSITO La presente guía describe el proceso y criterios para la validación de métodos analíticos, dirigido hacia laboratorios que coadyuvan con el SENASICA. 2. ALCANCE Esta guía establece los lineamientos para la validación de métodos cromatográficos aplicables a metodologías para la detección, confirmación y cuantificación de residuos de plaguicidas en productos agrícolas. 3. REFERENCIAS [1] Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed, Document No. SANCO/10684/2009. [2] Anteproyecto de Directrices sobre Criterios de rendimiento para métodos de análisis para determinación de residuos de plaguicidas, Comisión de CODEX Alimentarius, CX/PR 14/46/10, Marzo de [3] NMX-CH-140-IMNC-2002, Guía para la expresión de incertidumbre en las mediciones. 4. DESARROLLO 4.1. VALIDACION DE METODOS La validación de métodos analíticos se realiza de acuerdo a las necesidades del laboratorio, que directamente está relacionada con los requisitos de sus clientes. Se debe validar una metodología cuando: a) Antes de introducirlos como métodos de rutina. b) Un método establecido es usado en un laboratorio diferente o con diferentes analistas o instrumentos. c) Cuando cambia alguna de sus condiciones, por ejemplo: cambio en la técnica de extracción. d) Se desarrolla un nuevo método para un problema particular. e) Se revisa un método establecido para incorporar mejoras o ampliarlo hacia un nuevo problema, por ejemplo, cambio de matriz. f) Se debe demostrar la equivalencia entre dos métodos. Para la validación de cada metodología analítica en específico, se debe considerar los puntos del diagrama 1.

5 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 5 de 35 Diagrama 1. Desarrollo de una validación. Establecer el Objetivo de la metodología analítica. Definir el alcance de la metodología analitica. Realizar un estudio de metodologias oficiales y seleccionar la que esté al alcance del laboratorio. Considerando reactivos, material de laboratorio, equipos e instrumentos, instalaciones, etc. Definir el personal involucrado y responsabilidades. Selección de la matriz que se usará en la validación. Definir las características de desempeño del método analítico a estudiar (Parámetros de Validación). Realizar pruebas preliminares de la metodología seleccionada para identificar posibles desviaciones en los resultados obtenidos. NO Resultados satisfactorios en pruebas preliminares? SI En base a las pruebas preliminares planificar el estudio del laboratorio. Establecer las condiciones de operación. Establecer formularios para el registro de los datos experimentales. Establecer los criterios de aceptación. Desarrollo del estudio del laboratorio. Calculo de resultados. Revisión, análisis e interpretación de los resultados. Regla de decisión, confrontación de los resultados obtenidos contra los criterios de aceptación. Se cumplen los criterios de aceptación? NO Conclusión SI

6 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 6 de 35 Los parámetros de Validación que se deben incluir el desarrollo del estudio del laboratorio para una validación son las siguientes: a) Confirmación de identidad. b) Repetitividad. c) Reproducibilidad. d) Exactitud, Precisión y Recuperación (%R). e) Linealidad del método, intervalo de trabajo e intervalo de confianza (sesgo). f) Límite de detección (LD). g) Límite de cuantificación (LC). h) Robustez. i) Incertidumbre CONFIRMACION DE IDENTIDAD La conformación de identidad es establecer que la señal producida en la medición, se atribuye al analito solamente y no a la presencia de algo física o químicamente similar. Este parámetro es la combinación de dos parámetros de validación Selectividad y Especificidad SELECTIVIDAD La Selectividad es la aptitud de un método para determinar exacta y específicamente el analito de interés en presencia de otros componentes en la matriz de la muestra bajo las condiciones establecidas del ensayo. La prueba de selectividad debe realizarse de acuerdo al método que requiera el laboratorio, en el caso de un espectro de masas la información obtenida es comparada en presencia de una interferencia. Es decir se debe evaluar el método cromatografico para determinar si existe un efecto matriz y este se realiza analizando distintos blancos de la matriz de interés, con el fin de encontrar diferencias significativas y así poder eliminarlas ESPECIFICIDAD La especificidad es la aptitud de un método para determinar exacta y específicamente el analito de interés en presencia de otros componentes en la matriz de la muestra bajo las condiciones establecidas del ensayo. Este parámetro se realiza fortificando a concentraciones cercanas al LMR o menores, con el fin de poder predecir posibles interferencias. Ejemplo: Para el compuesto THPI, se buscan las transiciones 79>77, 79>51, 151>80 y 151>79 a una concentración de aproximadamente 5 ng/g en solución, obteniendo el grafico 1.

7 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 7 de 35 Grafico 1, THPI a una concentración aproximada de 5 ng/g. En solución es posible determinar el compuesto, por lo que se realiza una extracción en la matriz de aguacate con una fortificación a una concentración aproximada de 5 ng/g. Por lo que tenemos de resultado el grafico 2. En el cual, se observa que existe un efecto de la matriz, la cual nos causa interferencia y no podemos identificar el analito en matriz (Especificidad).

8 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 8 de 35 Grafico 2, THPI en matriz de aguacate a una concentración aproximada de 5 ng/g. Como se puede observar en el grafico 2, es necesario buscar otras transiciones que no causen interferencia a la concentración requerida. Por lo que nuevamente experimentalmente se obtienen nuevas transiciones 151>80, 151>122.1 y 151> Estas transiciones son evaluadas en la matriz de aguacate a una concentración aproximada de 5 ng/g, ver gráfico 3.

9 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 9 de 35 Grafico 3, THPI en matriz de aguacate a una concentración aproximada de 5 ng/g con otras transiciones. Una vez, que se tienen las condiciones adecuadas del método cromatografico con el analito de interés (Especificidad), se realiza el análisis de distintos blancos de matriz para poder ver posibles interferencias debidas a la variedad de matriz o la madurez de la misma (Selectividad).

10 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 10 de REPETITIVIDAD Cuando se realiza una medición de una magnitud intervienen factores como pueden ser el método y forma de ejecutar la medición, los técnicos que realizan la medición, las condiciones ambientales, defectos instrumentales o el paso del tiempo; entre otros. Todos estos factores provocan un cierto grado de desviación en la estimación del valor de la magnitud debido al desconocimiento o falta de control de la influencia de estos en el proceso de medida. La repetición es esencial para obtener estimaciones confiables del método, tomando en cuenta las variaciones en las condiciones de operación que se esperan durante la rutina diaria en la que se lleva a cabo el método. La repetitividad es la evaluación de la proximidad entre los resultados obtenidos (precisión) en el método analítico bajo las mismas condiciones de trabajo; es decir, mismo analista, mismo instrumento en una escala de tiempo corta. La repetitividad se evalúa con una prueba estadística llamada Xi cuadrada que sirve para evaluar la distribución de los resultados de porcentaje obtenidos en el método de análisis bajo las mismas condiciones de trabajo. El criterio de aceptación para esta prueba es: X 2 calculada< X 2 tablas (1) Calculado con la siguiente fórmula: [ ] Dónde: X 2 = ji cuadrada n= número de mediciones de la muestra S 2 = varianza de la muestra = varianza poblacional y representa la variabilidad del método (2) [ ] (3) ( ) (4) Dónde: N = número total de mediciones k= número de pruebas = Gran media = Varianza por prueba gl= grados de libertad n= número de mediciones de la muestra k= número de pruebas ( )( ) (5) Ejemplo: Se obtienen los datos de porcentaje de recobro de la prueba de repetitividad con Siete niveles por septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate

11 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 11 de 35 Intervalo de trabajo (%R) Repeticiones Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Nivel 6 Nivel 7 a 83,82 108,41 95,38 112,58 104,07 90,93 107,30 b 105,81 98,85 98,80 103,71 100,20 91,75 100,07 c 80,54 104,52 88,73 97,42 106,34 101,36 105,47 d 87,71 108,38 97,45 92,89 108,61 90,99 95,92 e 85,88 90,00 108,01 100,79 108,65 102,25 101,51 f 96,14 95,31 103,14 95,69 114,43 93,38 95,39 g 94,77 86,85 104,82 96,38 114,23 102,62 97,71 Se calcula el promedio, desviación estándar; las varianzas y la gran media Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Nivel 6 Nivel 7 Promedio (Xi) 90,67 98,90 99,48 99,92 108,08 96,18 100,48 Desviación estándar (Sj) 8,73 8,65 6,48 6,60 5,16 5,58 4,60 Desv. Est Cuadrada (Sj^2) 76,20 74,84 41,95 43,60 26,66 31,18 21,19 Gran media 99,10 Tomando en cuenta lo siguiente se determinan los grados de libertad N = 49 n = 7 k= 7 Se sustituye la ecuación (3): gl=(7-1)(7-1)=36 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )( ) Se resta el valor individual menos la gran media y se eleva al cuadrado, enseguida se suma las diferencias, teniendo los siguientes resultados Intervalo de trabajo Repeticiones Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Nivel 6 Nivel 7 a 233,65 86,64 13,86 181,74 24,65 66,78 67,28 b 44,97 0,06 0,09 21,24 1,22 54,06 0,93 c 344,48 29,33 107,57 2,83 52,36 5,09 40,61 d 129,77 86,07 2,73 38,58 90,49 65,73 10,12

12 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 12 de 35 e 174,85 82,80 79,45 2,84 91,27 9,93 5,79 f 8,75 14,35 16,30 11,63 235,07 32,74 13,78 g 18,75 150,07 32,66 7,42 228,90 12,38 1,94 Suma 3034,59 Se realiza la división Se calcula Buscando el valor de X2 con un nivel de significancia del 95% con 36 grados de libertad en tablas: X 2 calculada< X 2 tablas 9.05 < REPRODUCIBILIDAD Cuando se evalúa la precisión bajo condiciones de trabajo diferentes a las de repetitividad, se obtiene la reproducibilidad; con la cual se determina si existe algún efecto en los resultados de porcentaje de recobro por algún factor mediante un análisis de la varianza para un factor con efectos aleatorios. El criterio de aceptación para decir que el método es reproducible es la prueba estadística F de Fisher es que debe cumplirse que: F calculada < F tablas. (6) A continuación se desglosan las fórmulas empleadas para los cálculos de reproducibilidad: (7) ( ) (8) ( ) (9) k= número de pruebas n= número de mediciones por prueba = Gran media = promedio por prueba F cal = F de Fisher calculada ( ) ( ) (10) (11)

13 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 13 de 35 Ejemplo: Se obtienen los datos de porcentaje de recobro de tres pruebas de reproducibilidad con siete niveles por septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate: Repeticiones Primera Prueba (%R1) Segunda Prueba (%R2) Tercera Prueba (%R3) N1a 83,82 97,88 90,74 N1b 105,81 75,64 107,31 N1c 80,54 66,35 110,97 N1d 87,71 97,91 115,30 N1e 85,88 118,77 116,45 N1f 96,14 107,84 85,08 N1g 94,77 93,94 76,44 N2a 108,41 97,16 95,51 N2b 98,85 97,39 93,04 N2c 104,52 103,65 108,06 N2d 108,38 82,10 113,89 N2e 90,00 97,33 91,52 N2f 95,31 98,61 82,71 N2g 86,85 89,50 94,12 N3a 95,38 90,13 75,50 N3b 98,80 100,48 84,30 N3c 88,73 100,06 66,09 N3d 97,45 92,38 74,44 N3e 108,01 88,68 91,01 N3f 103,14 96,96 120,48 N3g 104,82 101,09 113,57 N4a 112,58 97,84 110,15 N4b 103,71 98,39 100,53 N4c 97,42 87,13 98,00 N4d 92,89 95,41 104,07 N4e 100,79 98,17 98,53 N4f 95,69 110,07 106,31 N4g 96,38 111,93 99,45 N5a 104,07 100,04 108,37 N5b 100,20 96,96 111,00 N5c 106,34 109,74 103,12 N5d 108,61 111,55 95,48 N5e 108,65 100,57 97,77 N5f 114,43 98,65 94,17 N5g 114,23 107,48 104,46

14 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 14 de 35 N6a 90,93 94,85 101,82 N6b 91,75 99,29 86,30 N6c 101,36 100,48 101,63 N6d 90,99 99,81 106,57 N6e 102,25 100,27 108,84 N6f 93,38 101,33 108,09 N6g 102,62 111,64 97,88 N7a 107,30 98,40 103,96 N7b 100,07 100,38 95,19 N7c 105,47 109,52 110,29 N7d 95,92 99,37 92,81 N7e 101,51 100,02 103,81 N7f 95,39 91,84 96,22 N7g 97,71 97,49 94,46 Se calcula los promedios y la gran media de las 3 pruebas de reproducibilidad Se calcula Primera Prueba (%R1) Segunda Prueba (%R2) Tercera Prueba (%R3) Promedio (Xj) 99,10 98,42 98,89 Gran media 98,80 *(( )^2+ ( )^2+( )^2)= 6.01 Se resta el valor individual menos el promedio por cada prueba y se eleva al cuadrado, enseguida se suma las diferencias, teniendo los siguientes resultados Nivel [%R1-Xj]^2 [%R2-Xj]^2 [%R3-Xj]^2 N1a 233,65 0,29 66,54 N1b 44,97 519,05 70,86 N1c 344, ,14 145,74 N1d 129,77 0,26 269,22 N1e 174,85 414,01 308,30 N1f 8,75 88,83 190,83 N1g 18,75 20,02 504,08 N2a 86,64 1,58 11,44 N2b 0,06 1,05 34,28 N2c 29,33 27,39 83,98 N2d 86,07 266,43 225,03 N2e 82,80 1,19 54,34

15 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 15 de 35 N2f 14,35 0,04 262,06 N2g 150,07 79,56 22,81 N3a 13,86 68,70 547,22 N3b 0,09 4,24 213,03 N3c 107,57 2, ,87 N3d 2,73 36,40 598,22 N3e 79,45 94,84 62,14 N3f 16,30 2,12 465,76 N3g 32,66 7,15 215,29 N4a 181,74 0,33 126,73 N4b 21,24 0,00 2,69 N4c 2,83 127,50 0,80 N4d 38,58 9,02 26,77 N4e 2,84 0,06 0,13 N4f 11,63 135,87 54,99 N4g 7,42 182,52 0,31 N5a 24,65 2,62 89,85 N5b 1,22 2,12 146,57 N5c 52,36 128,24 17,85 N5d 90,49 172,42 11,68 N5e 91,27 4,63 1,26 N5f 235,07 0,05 22,32 N5g 228,90 82,05 30,98 N6a 66,78 12,73 8,59 N6b 54,06 0,77 158,72 N6c 5,09 4,25 7,47 N6d 65,73 1,95 58,89 N6e 9,93 3,43 98,96 N6f 32,74 8,45 84,66 N6g 12,38 174,82 1,03 N7a 67,28 0,00 25,65 N7b 0,93 3,86 13,69 N7c 40,61 123,24 129,80 N7d 10,12 0,91 36,97 N7e 5,79 2,56 24,13 N7f 13,78 43,31 7,15 N7g 1,94 0,86 19,68 SUMA = 13562,492820

16 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 16 de 35 Se calcula Sustituyendo ( ) Tomando en cuenta lo siguiente se determinan los grados de libertad n = 49 k= 3 Por lo tanto, en tablas el valor de F (2,144,0.5) es de Se obtiene lo siguiente ( ) F calculada < F tablas < Por lo tanto al cumplirse el criterio de aceptación se concluye no existe influencia alguna y por lo tanto el método es reproducible EXACTITUD, PRECISION Y RECUPERACION EXACTITUD El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia. La exactitud se refiere a una estimación del valor verdadero que determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado y se puede determinar por la recuperación de las pruebas de repetitividad como de reproducibilidad. El estudio del comportamiento de esta estimación está dado por la t de student para evaluar la tendencia Gaussiana de los datos. El criterio de aceptación para la exactitud es el parámetro estadístico t de Student que debe cumplir que la t calculada debe estar en el intervalo del valor ±t (α/2, n-1). A continuación se desglosan las fórmulas para los cálculos de exactitud: t( α/2, n-1) < t calculada < t (1-(α/2),n-1) (12) (13)

17 DIRECCIÓN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 17 de 35 ( ) ( ) (14) ( ) (15) ( ) (16) (17) Ejemplo: Se obtienen los datos de concentración de tres pruebas de reproducibilidad con siete niveles por septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate. Cálculo de Promedio, Desviación estándar, Coeficiente de variación e Intervalo de confianza, mediante los porcentajes de recobro. Identificación Primera Prueba (%R1) Identificación Segunda Prueba (%R2) Identificación Tercera Prueba (%R3) N1a N1a N1a N1b N1b N1b N1c N1c N1c N1d N1d N1d N1e N1e N1e N1f N1f N1f N1g N1g N1g N2a N2a N2a N2b N2b N2b N2c N2c N2c N2d N2d N2d N2e N2e N2e N2f N2f N2f N2g N2g N2g N3a N3a N3a N3b N3b N3b N3c N3c N3c N3d N3d N3d N3e N3e N3e N3f N3f N3f N3g N3g N3g N4a N4a N4a N4b N4b N4b N4c N4c N4c N4d N4d N4d N4e N4e N4e N4f N4f N4f N4g N4g N4g 99.45

18 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 18 de 35 N5a N5a N5a N5b N5b N5b N5c N5c N5c N5d N5d N5d N5e N5e N5e N5f N5f N5f N5g N5g N5g N6a N6a N6a N6b N6b N6b N6c N6c N6c N6d N6d N6d N6e N6e N6e N6f N6f N6f N6g N6g N6g N7a N7a N7a N7b N7b N7b N7c N7c N7c N7d N7d N7d N7e N7e N7e N7f N7f N7f N7g N7g N7g Promedio Promedio Promedio Desv. Est Desv. Est Desv. Est CV CV CV IC(µ) [-] IC(µ) [-] IC(µ) [-] IC(µ) [+] IC(µ) [+] IC(µ) [+] Intervalo ( ) n = 147 Gran media = Desv. Estándar total = Hipotesis (µ o ) = 98 t (calculada) = La exactitud del método es del 98% t (0.975, 146) = ± t Calculada PRECISION La precisión en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad estimada sirve para conocer la dispersión de los resultados del método analítico como una desviación típica a diferentes magnitudes dentro del intervalo de trabajo; donde se obtiene el coeficiente de variación del método; que se puede expresar como un intervalo de aceptación de %R mínimo - %R máximo. Las fórmulas para calcular la varianza para el método de repetitividad (Sr 2 ) es: (12)

19 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 19 de 35 Si 2 = Desviación estándar N=número de mediciones por nivel La fórmula para calcular la desviación de las medias (Sd 2 ) es: n=número de pruebas = Desviación de las medias La fórmula para calcular la varianza entre analistas (S L 2 ) es: =desviación de las medias =varianza para el método de repetitividad (13) La fórmula para calcular la varianza de reproducibilidad (S R 2 ) es: Varianza entre analistas =varianza para el método de repetitividad La fórmula para calcular la precisión en condiciones de repetitividad (Sr) es: =varianza para el método de repetibilidad (14) (15) (16) La fórmula para calcular la precisión en condiciones de reproducibilidad (S R ) es: = varianza de reproducibilidad La fórmula para calcular el límite de repetitividad (r) es: La fórmula para calcular el límite de reproducibilidad (R) es: (17) Ejemplo: Se obtienen los datos de concentración de tres pruebas de reproducibilidad con siete niveles por septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate. (18) (19)

20 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 20 de 35 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Nivel 6 Nivel 7 Conc. De Nivel (ug/ml) 0,0051 0,0071 0,0087 0,0103 0,0258 0,0515 0,1030 0,0043 0,0077 0,0083 0,0116 0,0268 0,0468 0,1105 0,0054 0,0070 0,0086 0,0107 0,0258 0,0472 0,1030 0,0041 0,0074 0,0077 0,0100 0,0274 0,0522 0,1086 Primera prueba 0,0045 0,0077 0,0084 0,0096 0,0280 0,0468 0,0988 0,0044 0,0064 0,0094 0,0104 0,0280 0,0526 0,1045 0,0049 0,0068 0,0089 0,0099 0,0295 0,0481 0,0982 0,0049 0,0062 0,0091 0,0099 0,0294 0,0528 0,1006 0,0050 0,0068 0,0077 0,0100 0,0255 0,0483 0,1004 0,0039 0,0069 0,0086 0,0100 0,0247 0,0506 0,1024 0,0034 0,0073 0,0086 0,0089 0,0279 0,0512 0,1117 Segunda prueba 0,0050 0,0058 0,0079 0,0097 0,0284 0,0509 0,1014 0,0060 0,0069 0,0076 0,0100 0,0256 0,0511 0,1021 0,0055 0,0069 0,0083 0,0112 0,0251 0,0516 0,0937 0,0048 0,0063 0,0087 0,0114 0,0274 0,0569 0,0995 0,0046 0,0067 0,0065 0,0112 0,0277 0,0521 0,1058 0,0055 0,0066 0,0072 0,0103 0,0283 0,0442 0,0969 0,0057 0,0076 0,0057 0,0100 0,0263 0,0520 0,1122 Tercera prueba 0,0059 0,0080 0,0064 0,0106 0,0244 0,0545 0,0944 0,0059 0,0065 0,0078 0,0101 0,0250 0,0557 0,1056 0,0043 0,0058 0,0103 0,0109 0,0240 0,0553 0,0979 0,0039 0,0066 0,0097 0,0102 0,0267 0,0501 0,0961 Se calcula el promedio y desviación estándar por prueba para cada nivel de concentración Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Promedio Desv. Est. Promedio Desv. Est. Promedio Desv. Est. Primera prueba 0, , , , , , Segunda prueba 0, , , , , , Tercera prueba 0, , , , , , Nivel 4 Nivel 5 Nivel 6 Promedio Desv. Est. Promedio Desv. Est. Promedio Desv. Est. Primera prueba 0, , , , , , Segunda prueba 0, , , , , , Tercera prueba 0, , , , , , Nivel 7 Promedio Desv. Est. Primera prueba 0, , Segunda prueba 0, , Tercera prueba 0, ,006622

21 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 21 de 35 Se calcula la gran media, desviación estándar, varianza de repetibilidad, desviación de las medias, varianza entre analistas, varianza de reproducibilidad, precisión en condiciones de repetibilidad y precisión en condiciones de reproducibilidad, límite de repetibilidad y límite de reproducibilidad para cada nivel. Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Gran media 0, , , , Desv. Estd. (medias) 0, , , , Varianza de repetibilidad (Sr^2) 2,4393E-07 1,6887E-07 5,1906E-07 2,0591E-07 Desviación de las medias (Sd^2) 1,7851E-13 8,5549E-14 8,0826E-13 1,2719E-13 Varianza ente análistas (SL^2) -8,1311E-08-5,6289E-08-1,7302E-07-6,8636E-08 Varianza de reproducibilidad (SR^2) 1,6262E-07 1,1258E-07 3,4604E-07 1,3727E-07 Precisión en condiciones de repetibilidad (Sr) 0, , , , Precisión en condiciones de reproducibilidad (SR) 0, , , , repetitividad ( r ) 0, , , , Reproducibilidad ( R ) 0, , , , Gran media Nivel 5 Nivel 6 Nivel 7 Desv. Estd. (medias) 0, , , Varianza de repetibilidad (Sr^2) 0, , , Desviación de las medias (Sd^2) 9,6044E-07 4,4371E-06 1,3574E-05 Varianza ente análistas (SL^2) 2,7673E-12 5,9063E-11 5,5279E-10 Varianza de reproducibilidad (SR^2) -3,2015E-07-1,479E-06-4,5246E-06 Precisión en condiciones de repetibilidad (Sr) 6,4029E-07 2,9581E-06 9,0498E-06 Precisión en condiciones de reproducibilidad (SR) 0, , , repetitividad ( r ) 0, , , Reproducibilidad ( R ) 0, , , , , , Se grafica la precisión en condiciones de repetibilidad (Sr) vs. Concentración y por regresión lineal se obtiene la ecuación que describe el comportamiento de la precisión en el intervalo de trabajo. Conc (ug/ml) Sr 0, , , , , , , , , , , , , ,

22 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 22 de 35 Pendiente 0, Ordenada 0, R^2 0, Sr= 0,033*Concentracion (ug/ml) Se grafica la precisión en condiciones de reproducibilidad (SR) vs. Concentración y por regresión lineal se obtiene la ecuación que describe el comportamiento de la precisión en el intervalo de trabajo. Conc (ug/ml) SR 0, , , , , , , , , , , , , , Pendiente 0, Ordenada 0, R^2 0, SR= 0,027*Concentracion (ug/ml) Se calcula el coeficiente de variación tanto de la precisión de repetibilidad como reproducibilidad para cada nivel de concentración. El coeficiente de variación del método es de 9,60 Conc (ug/ml) CV( r ) CV ( R ) 0, ,60 7,84 0, ,78 4,72 0, ,32 6,79 0, ,41 3,60 0, ,80 3,10 0, ,09 3,34 0, ,58 2,92 Cuando se determinan las condiciones que garantizan repetibilidad y reproducibilidad, es decir cuando se mide siempre igual, se tiene un método normalizado RECUPERACION (%R) El porcentaje de recuperación o porcentaje de recobro es un parámetro que se basa en la eficiencia del método de extracción para cada Analito de una muestra fortificada intencionalmente,

23 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 23 de 35 es decir, permite ver el rendimiento del método en cuanto al proceso de extracción y la cantidad de analito existente en la muestra original. Se obtiene a partir de las pruebas de repetitividad y reproducibilidad, y se utiliza la siguiente fórmula para su cálculo: Nota: El porcentaje de recobro es característico para cada plaguicida. Ejemplo: Se obtienen los datos de concentración de prueba de repetitividad con siete niveles por septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate. (20) Conc adicionada (ug/ml) Conc Calculada (ug/ml) %R Identificación N1a N1b N1c N1d N1e N1f N1g N2a N2b N2c N2d N2e N2f N2g N3a N3b N3c N3d N3e N3f N3g N4a N4b N4c N4d N4e N4f N4g N5a N5b N5c N5d N5e N5f N5g N6a N6b N6c N6d N6e N6f N6g N7a N7b

24 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 24 de 35 N7c N7d N7e N7f N7g LINEALIDAD DEL METODO E INTERVALO DE TRABAJO LINEALIDAD DEL METODO Se conoce como linealidad a la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo de trabajo, de mostrar una respuesta que sea proporcional a la cantidad del analito de estudio. La linealidad del método se determina mediante 7 muestras con 7 niveles de fortificación en matriz. Estas curvas de calibración en matriz son preparadas en diferentes turnos y analistas. Los criterios de aceptación para la linealidad en matriz son: A continuación se desglosan las fórmulas empleadas para los cálculos: r 2 > 0.98 (21) Residual < ± 20% (22) (23) (24) (25) [ ( ) ] (26) (26) ( ) (27) ( ) ( ) (28) (29)

25 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 25 de 35 Donde: B=Pendiente de la recta de los datos experimentales. A=Ordenada al origen de la recta de los datos experimentales. r 2 = Coeficiente de correlación al cuadrado de los datos experimentales. =Desviación estándar insesgada. S bo = Desviación estándar de la ordenada al origen. S b1 = Desviación estándar de la pendiente. n = número de datos. CV y/x = Coeficiente de variación de la regresión. Ejemplo: Se obtienen los datos de concentración de prueba de Linealidad, con siete niveles por septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate. Identificación Conc.(Fort/Estd. Int.) Resp. (Fort/Estd. Int.) X^2 Y^2 XY (X-Y)^2 N1a N1b N1c N1d N1e N1f N1g N2a N2b N2c N2d N2e N2f N2g N3a N3b N3c N3d N3e N3f N3g N4a N4b N4c N4d N4e N4f N4g N5a N5b N5c N5d N5e N5f N5g N6a N6b N6c N6d N6e N6f

26 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 26 de 35 N6g N7a N7b N7c N7d N7e N7f N7g SUMATORIA Pendiente (B) = Ordenada (A) = R^2 = El intervalo lineal es (ug/ml): a INTERVALO DE TRABAJO Es el intervalo entre el nivel más bajo y más alto de concentración que ha sido demostrado que puede ser determinado con la precisión y exactitud requeridas para una determinada matriz. Se determina como la concentración mínima cuantificable o límite de cuantificación hasta la concentración máxima fortificada para cada Analito. Cada nivel del intervalo de trabajo debe cumplir con los criterios de %R y CV obtenidos de la prueba de repetitividad y reproducibilidad para cada Analito. En cambio, el intervalo lineal es el intervalo de concentraciones del Analito en donde el comportamiento del Analito tiene una tendencia de y=mx+b y debe de cumplir el criterio de r 2 > 0.98 y el Residual < ± 20% LIMITE DE DETECCION (LD) El límite de detección es la concentración mínima del Analito en una muestra, que puede ser detectada por un método analítico, pero no necesariamente cuantificada bajo condiciones experimentales establecidas LIMITE DE CUANTIFICACION (LC) El límite de cuantificación es la concentración mínima de la sustancia de interés que puede ser cuantificada de manera confiable. (30) ( ) (31) 4.9. ROBUSTEZ Medida de la capacidad de un procedimiento analítico para no ser afectado por variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros del método y que provee una indicación de su fiabilidad durante su uso habitual. La robustez de un método analítico permite identificar aquellas variables que provocarán cambios significativos y que deberían ser controladas más estrictamente.

27 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 27 de 35 Ejemplo: La temperatura, la presión, humedad relativa, factores químicos, tiempo de proceso etc. Para el parámetro de robustez se usa el método de Youden, se utiliza una tabla de combinaciones la cual está diseñada para 7 variables o menos de ocho diferentes mediciones. En la siguiente tabla (3A) los valores nominales marcados por el método se designan con mayúscula y las variaciones correspondientes con minúsculas. En la combinación No. 1 está compuesta con todas las variables y con los valores máximos, mientras los demás están variados. Los resultados obtenidos en cada prueba se denominan: s, t, u, v, w, x, y, z. Factores Combinación A/a A A A A a a a a B/b B B b b B B b b C/c C c C c C c C c D/d D D d d d d D D E/e E e E e e E E E F/f F f f F F f f F G/g G g g G g G G g Resultados s t u v w x y z Resultados: (%) s t u v w x y z Valores Sustitución 4 menos 4 combinaciones de s a la z S A = 1/4 (s+t+u+v) - 1/4 (w+x+y+z) = (A-a) (32) S B = 1/4 (s+t+w+x) - 1/4 (u+v+y+z) = (B-b) (33) S C = 1/4 (s+u+w+y) - 1/4 (t+v+x+z) = (C-c) (34) S D = 1/4 (s+t+y+z) - 1/4 (u+v+w+x) = (D-d) (35) S E = 1/4 (s+u+x+z) - 1/4 (t+v+w+y) = (E-e) (36) S F = 1/4 (s+v+w+z) - 1/4 (t+u+x+y) = (F-f) (37) S G = 1/4 (s+v+x+y) - 1/4 (t+u+w+z) = (G-g) (38) Para calcular la desviación estándar de las variables S rob = (39) Donde d = (valor nominal variación) PASOS Escribir los factores del análisis

28 DIRECCIÓN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 28 de 35 Escribir en forma de columna los factores del análisis (valores nominales), las variaciones y el factor. Calcular la desviación estándar de los valores nominales le llamaremos s met. Sustituir 4 menos 4 combinaciones de s a la z. Ejemplo: (ecuaciones 1 a la 7) o VA= 1/4 (s+t+u+v) - 1/4 (w+x+y+z) = (A-a) Calcular la desviación estándar de los (S rob ), usando la ecuación No. 39. Criterio de aceptación: S rob < S met Ejemplo: Factores Combinaciones Agitación vortex (seg) Muestra (gr) Agitación manual (seg) Sonicar (seg) Resultados s t u v w x y z Resultados: (%) s t u v w x y z Valores SA= 1/4 ( ) - 1/4 ( ) = ( ) = 3.5 SB= 1/4 ( ) - 1/4 ( ) = (95-100) = -5 [Esta es la mayor variación] SC= 1/4 ( ) - 1/4 ( ) = ( ) = -4.5 SD= 1/4 ( ) - 1/4 ( ) = ( ) = 0.5 Desviación Estándar de las variables: = (A-a) 2 + (B-b) 2 + (C-c) 2 + (D-d) 2 = ( ) 2 + (95-100) 2 + ( ) 2 + ( ) 2 = S rob = S rob =7.59 Sustitución: Srob= 7.59 Criterio de aceptación: Srob < Smet 7.59 > 6.8

29 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 29 de 35 No puede ser un método estándar, las condiciones propuestas Como se observó la cantidad pesada de muestra si influye entonces no se considera en la desviación estándar de las combinaciones (Srob), para que siga siendo como el método establecido, se sigue la ecuación 39. = ( ) 2 + ( ) 2 + ( ) 2 = S rob = S rob =5.71 Sustitución: Srob= 5.71 Criterio de aceptación: Srob < Smet 5.71 < 6.8 Puede quedar como un método estándar, bajo las condiciones propuestas, sin considerar la variación en el pesado de la muestra (+0.1g). Es decir, con un incremento del peso de muestra el método no es robusto ESTIMACION DE INCERTIDUMBRE La estimación de incertidumbre se debe realizar de acuerdo al método definido en la norma NMX- CH-140-IMNC A continuación se muestra el Diagrama No. 2, donde se indican los paso para estimar la incertidumbre.

30 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 30 de 35 Diagrama 2. Pasos para estimar la Incertidumbre.

31 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 31 de 35 a) DEFINIR EL MENSURANDO Y En la cuantificación de residuos de plaguicidas el mensurando es la concentración del analito de interés (C A ). b) ESTABLECER EL MODELO FISICO Para el modelo físico, es necesario tener claro el proceso que se realiza durante la cuantificación de plaguicidas. Es decir, cual es la ecuación que se utiliza para determinar la concentración del mensurando. A continuación se anexa la ecuación que describe el mensurando y este está relacionado con el equipo cromatografico (Respuestas Cromatograficas, la regresión lineal del mensurando y el facto de dilución durante su proceso de extracción). ( ) ( ) ( ) (40) c) IDENTIFICAR LAS MAGNITUDES DE ENTRADA Xi Las magnitudes de entrada, se pueden visualizar en el modelo físico, es decir son las variables que se pueden medir durante el proceso de extracción y cuantificación. ( ) (41) d) ESTABLECER EL MODELO MATEMATICO Para el modelo matemático se realiza el modelo de propagación de incertidumbre utilizando una serie de Taylor de primer orden e) IDENTIFICAR LAS FUENTES DE INCERTIDUMBRE Estás provienen de los diversos factores involucrados en la medición, por ejemplo: Los resultados de la calibración del instrumento. La incertidumbre del patrón o del material de referencia. La repetitividad de las lecturas. La reproducibilidad de las mediciones por cambio de observaciones, instrumentos u otros elementos. Características del propio instrumento, como resolución, histéresis, deriva, etc. Variaciones de las condiciones ambientales. La definición del propio mensurando. El modelo particular de la medición. Variaciones en las magnitudes de influencia.

32 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 32 de 35 f) CUANTIFICAR LA VARIABILIDAD DE CADA FUENTE Y ASOCIARLE UNA DISTRIBUCION I. Evaluación tipo A: La Incertidumbre de una magnitud de entrada Xi obtenida a partir de observaciones repetidas, se estima con base en la dispersión de los resultados individuales. II. Evaluación tipo B: Las fuentes de incertidumbre tipo B son cuantificadas usando información externa u obtenida por experiencia. Estas fuentes de información pueden ser: Certificados de Calibración. Manuales del instrumento de medición, especificaciones del instrumento. Normas o literatura. Valores de medición anteriores. Conocimiento sobre las características o el comportamiento del sistema de medición. III. Distribución de Probabilidad Normal Los resultados de una medición repetida afectada por una ó más magnitudes de influencia que varían aleatoriamente, generalmente siguen en buena aproximación una distribución normal. También la incertidumbre indicada en certificados de calibración se refiere generalmente a una distribución normal. ( ) (44) Ejemplo: En un certificado del plaguicida Dieldrin, marca: AccuStandard Inc, con número de catálogo: P-037NB-100, Lote: AG-AC, reporta una pureza del 99,1%. Por otra parte el certificado especifica que la concentración analítica certificada es igual a la pureza por la concentración preparada. La incertidumbre calculada de este producto es ±2%, donde este es el valor de la incertidumbre expandida U. La incertidumbre expandida U es uc(y)*k, donde k es el factor de cobertura a un 95% de nivel de confianza (k=2). El certificado reporta k=2 y U=±2%, sustituyendo valores en la ecuación anterior tenemos: ( ) Cuando se desea estimar la incertidumbre estándar de la media, se realiza con la siguiente ecuación: ( ) (45)

33 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 33 de 35 Ejemplo: Se tiene una pipeta volumétrica de 5 ml, se desea conocer el volumen verificado y su incertidumbre. Para ello se realiza una prueba de pesado en una balanza bajo condiciones de temperatura constante. El resultado del volumen total de agua de la pipeta es depositado dentro de un vaso de precipitado de 50 ml, obteniendo los siguientes resultados: Volumen Nominal 5 ml Calculamos el promedio: Volumen actual (ml) (peso del agua /densidad) ( ) Calculamos la desviación estándar: ( ) ( ) Por lo tanto, sustituyendo valores en ecuación 45 y considerando que la t de student tiende a 1 cuando el número de datos es igual o mayor a 10. ( ) IV. Distribución de probabilidad Rectangular En una distribución rectangular cada valor en un intervalo dado tiene la misma probabilidad, o sea la función de densidad de probabilidad es constante en el intervalo. ( ) (46) V. Distribución de Probabilidad Triangular Como una distribución rectangular, para una magnitud de entrada Xi que tiene una distribución triangular con los límites a+ y a-. ( ) (47) g) OBTENER LA INCERTIDUMBRE ESTANDAR xi La cuantificación de la incertidumbre estándar para cada fuente de entrada se realiza de acuerdo al inciso f). Por lo que cada fuente de incertidumbre es determinada de manera

34 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 34 de 35 individual y esta para cada fuente de entrada está determinada principalmente por la siguiente ecuación: ( ) ( ) ( ) ( ) (48) Es decir, las fuentes de incertidumbre principales son debidas principalmente para cada fuente de entrada por la incertidumbre de calibración, la incertidumbre de operación y la incertidumbre de resolución. h) CALCULAR LA INCERTIDUMBRE ESTANDAR COMBINADA u(c) Una vez que se tienen cuantificadas todas las fuentes de entrada y el desarrollo del modelo matemático (ecuación 42 y 43) empleando el modelo físico (ecuación 40), se procede a sustituir resultados. Es importante mencionar que se van a tener distintas incertidumbres combinadas que están relacionadas con las magnitudes de las fuentes de entrada. i) CALCULAR LA INCERTIDUMBRE EXPANDIDA U La incertidumbre combinada u(c) representa un intervalo centrado en el mejor estimado del mensurando que contiene el valor verdadero con una probabilidad p de 68% aproximadamente, bajo la suposición de que los posibles valores del mensurando siguen una distribución normal. Generalmente se desea una probabilidad mayor, lo que se obtiene expandiendo el intervalo de incertidumbre por un factor k, llamado factor de cobertura. El resultado se llama incertidumbre expandida U (ecuación 44). Factor cobertura de probabilidad k = % k = % k = 3 99%

35 Clave: GVM Revisión: 00 Fecha de emisión: 01/2015 Página 35 de CRITERIOS DE ACEPTACION PARA LOS PARAMETROS DE VALIDACION 5. ANEXOS