EFECTOS DE LAS ENZIMAS DE MACERACIÓN EN TINTO Y DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA EN FRÍO SOBRE LA ELABORACIÓN DE UN VINO FRUTAL, COLOREADO Y REDONDO

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1 LUMLEY, EFECTOS DE LAS ENZIMAS DE MACERACIÓN Y DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA EN FRÍO, PÁG. 1 EFECTOS DE LAS ENZIMAS DE MACERACIÓN EN TINTO Y DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA EN FRÍO SOBRE LA ELABORACIÓN DE UN VINO FRUTAL, COLOREADO Y REDONDO Marie de LUMLEY, Jefe de Producto Enzimas, Laboratoire SARCO, filial de investigación de la sociedad LAFFORT, BP 17, Bordeaux Cedex marie.delumley@laffort.com Resumen La maceración es una etapa esencial para la extracción de los compuestos fenólicos durante las vinificaciones en tinto. El objetivo del estudio era evaluar los efectos de la maceración prefermentativa en frío (MPF) con o sin enzimas sobre la extracción de los compuestos fenólicos para producir un vino tinto frutal, coloreado y redondo. Las experimentaciones han permitido demostrar que ciertas preparaciones enzimáticas específicas para la extracción en tinto permiten optimizar esta fase de maceración prefermentativa en frío incluso sustituirla completamente obteniendo unos vinos que tienen unas cualidades sensoriales superiores con respecto a sólo la MPF. INTRODUCCIÓN La maceración es una etapa clave de la vinificación en tinto, ya que es gracias a ella que se transmiten al vino las cualidades de la uva, y en particular el color, la estructura y los aromas. Con el fin de optimizar esta fase crítica de extracción, se han puesto a punto numerosos procedimientos: Calentamiento de la vendimia, tanques rotativos o sombrero sumergido, sistemas de aspersión de los orujos, maceración pre o post fermentativa, en caliente o en frío, tantas soluciones proyectadas en función de los periodos, de los modos o de las necesidades para liberar las moléculas buscadas (Sacchi, et al., 2005). Actualmente, la biotecnología nos ofrece la posibilidad de utilizar las enzimas, catalizadores naturales y extremadamente eficaces, para acelerar y amplificar las reacciones (Canal- Llaubères, 2000). En efecto, las pectinesterasas y las poligaracturonasas intervienen naturalmente en la maduración de las frutas (Touzani et al., 1994) ; hidrolizan los compuestos pécticos haciendo de esta forma que las paredes celulares se ablanden, que las frutas maduren y se puedan consumir. Utilizadas en un principio para la clarificación, las enzimas a través de un planteamiento empírico se han ido aplicando poco a poco a la extracción. Con la ayuda de la evolución de los conocimientos, tanto a nivel del sustrato como de su modo de acción, han aparecido unos conceptos de uso cada vez más selectivos y en particular a nivel de la extracción y de la maceración en tinto (Ducruet et al., 1997 ; Ducruet et al., 2000). Las moléculas extraídas, de hecho, son diferentes por su localización en las bayas y por su solubilidad en el medio acuoso o alcohólico (Amrani-Joutei, 1993 ; Figure 1). En efecto, se distinguen 3 tipos principales de maceración: maceración prefermentativa (en medio acuoso) fermentación alcohólica (aumento creciente del contenido de etanol) maceración post-fermentativa (en fase hidroalcohólica) En función de la madurez, las acciones mecánicas o térmicas, los tiempos y la temperatura de maceración, estas moléculas son liberadas en mayor o menor cantidad (Cambas, 1971). La maceración libera esencialmente en el mosto por difusión compuestos fenólicos de los hollejos (antocianos y taninos; Figura 1) que desempeñan un papel esencial en el color y en la estructura de los vinos tintos, pero también precursores y aromas varietales así como polisacáridos. Estos últimos a causa de su interacción con los taninos participan en la redondez de los vinos. Los trabajos de tesis de Khalid Amrani-Joutei demostraron que los antocianos y los taninos son liberados principalmente durante los primeros días de maceración luego, la extracción continúa REVISTA INTERNET DE VITICULTURA Y ENOLOGÍA, 2007, Nº7/1

2 LUMLEY, EFECTOS DE LAS ENZIMAS DE MACERACIÓN Y DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA EN FRÍO, PÁG. 2 durante la fermentación alcohólica. Ha sido demostrado que la intensidad colorante es máxima al cabo de 8 días de maceración. En medio acuoso, se observa un pico de extracción de antocianos después de 12h de maceración. Para los taninos de los hollejos, se observa un pico a las 18h de maceración que prosigue a lo largo de la vinificación. Durante esta fase, la acción de ciertas actividades enzimáticas, llamadas de extracción, permiten facilitar la liberación selectiva de algunos taninos asociados a la membrana media (Ver Figuras 1 y 2). En medio hidroalcohólico, los antocianos son extraídos principalmente después de 18h de maceración mientras que los taninos, de los hollejos y sobre todo de las pepitas, son liberados durante toda la maceración. Tanino unidos a la membrana vacuolar Taninos libres granulosos Taninos unidos a la pared celular Taninos libres aglomerados Figura 1. Localización de los taninos en la célula de los hollejos de la uva. Corte de célula vegetal observada al microscopio electrónico. (Amrani-Joutei, 1993). Lámina media interna Pared pectocelulósica Fragilización de la pared por perforación por parte de las pectinasas Figura 2. Efecto de las enzimas pectolíticas sobre las paredes celulares de la uva. Corte de pared de célula vegetal observada mediante microscopio electrónico (Amrani-Joutei, 1993). La enología actual representa un verdadero reto: el viticultor debe sacar provecho de lo mejor de su materia prima, conservar la tipicidad de su terroir y vender su vino, por tanto proponer unos productos que gusten a los consumidores. El mercado evoluciona y los nuevos consumidores buscan ahora los llamados vinos "seductores", verdaderos concentrados de aromas especialmente de fruta fresca, agradables de beber, redondos, coloreado, suaves. Por consiguiente, el contenido y la calidad de los compuestos fenólicos (antocianos y taninos) y de los polisacáridos no son los mismos que los buscados para la elaboración de los vinos

3 LUMLEY, EFECTOS DE LAS ENZIMAS DE MACERACIÓN Y DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA EN FRÍO, PÁG. 3 estructurados. En efecto, estos compuestos desempeñan un papel esencial en la percepción organoléptica de los vinos tintos: estructura, redondez, carnosidad, pero también amargor, astringencia, sequedad. Parece también que influyen sobre la percepción de los aromas afrutados, especialmente los taninos que cuando están presentes en cantidades elevadas o están poco maduros tienen la tendencia a cubrir la percepción del afrutado de los vinos. En la búsqueda de la elaboración de estos vinos afrutados modernos de tipo «primeurs» en onda con el mercado, la maceración prefermentativa en frío (MPF), tanto para los vinos de guarda como para los vinos de consumo rápido, goza de las preferencias de los vinificadores ya que esta técnica permite obtener vinos coloreados y aromáticos, aunque en este último punto no estén todos de acuerdo (Parenti et al., 2004 ; Parley, 1997). Pero no tiene que convertirse en algo sistemático: la MPF necesita un buen estado sanitario y una buena madurez fenólica y tecnológica y sigue estando asociado a unas cepas naturalmente aromáticas. Se realiza generalmente a unas temperaturas entre 8-15 C durante 1-5 días y es necesario seguir ciertas reglas para preservar todo aquello que viene extraído: - Es importante controlar el inicio de la fermentación alcohólica para evitar desviaciones organolépticas y contaminaciones por parte de microorganismos. Se recomienda añadir las levaduras enológicas al inicio de la maceración. - Utilización de enzimas destinadas a extraer los compuestos fenólicos y los aromas más rápidamente para limitar los tiempos de encubado y facilitar la rotación de los tanques. - Temperatura de maceración de C, desde algunas horas hasta algunos días, que va acompañada de una fermentación alcohólica a bajas temperaturas para los tintos (máximo 26 C). En efecto, los aromas de tipo fruta fresca parecen ser moléculas sensibles al calor y con temperaturas demasiado elevadas se corre el riesgo de favorecer la extracción de aromas a confitura, fruta cocida, etc. - Los tiempos de maceración y de encubado deben ser cortos y los fenómenos oxidativos controlados (limitar las oxidaciones violentas y las trituraciones) para evitar la extracción de notas vegetales especialmente si la madurez no es óptima. MATERIALES Y MÉTODOS Protocolos de experimentación Las experimentaciones fueron llevadas a cabo en la bodega experimental de LAFFORT sobre la misma parcela de Merlot, cerca de Burdeos ("Région d appellation Graves de Vayres"). La vendimia fue recogida manualmente y en cajas numeradas repartidas uniformemente por la parcela con el fin de obtener una vendimia homogénea. En la fase de recepción, la vendimia fue despalillada, estrujada moderadamente, sulfitada con 5 g/hl y luego enzimada (preparación purificada y concentrada), en el caso de las modalidades con enzimas, durante el llenado de los tanques de 210 litros. Las modalidades fueron realizadas por duplicado, protegidas de la oxidación con CO 2 y adicionadas de levadura a la mañana siguiente con la misma cepa de levadura. La maceración prefermentativa en frío fue llevada a cabo durante 48 h a 13 C. Las acciones mecánicas (homogeneizaciones, remontados) se limitaron a solamente la aireación de los mostos. La fermentación alcohólica duró 10 días, al cabo de los cuales el vino fue prensado a 0,5 bares. Sólo los mostos yema fueron utilizados para los ensayos. Las fermentaciones malolácticas se concluyeron 4 semanas después de la inoculación directa de bacterias. Los vinos fueron trasegados 2 veces, sulfitados (25 mg/l de libre) y luego embotellados y conservados todos en las mismas condiciones. Análisis de los vinos Se realizó el seguimiento de la cinética de extracción (color y DO280 nm) a partir del inicio de la fermentación alcohólica cada dos días y luego cada 3 meses. Los análisis del color fueron efectuados durante dos años después del embotellado. Los perfiles polifenólicos de los vinos fueron determinados para cada modalidad al final de la fermentación maloláctica. Los grados de polimerización medios fueron determinados en los vinos acabados por cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC) después de la despolimerización de los taninos mediante reacciones de tiolisis (Kennedy et al., 2006).

4 LUMLEY, EFECTOS DE LAS ENZIMAS DE MACERACIÓN Y DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA EN FRÍO, PÁG. 4 RESULTADOS PRÁCTICOS Resultados de los parámetros clásicos Antes de la fecha de cosecha, la madurez de la vendimia de la parcela de Merlot fue controlada regularmente. Los análisis de los parámetros clásicos (ph, acidez, grado) fueron medidos en el encubado, en el descube, después de la fermentación maloláctica, después del embotellado y a continuación una vez al año (Tabla 1). Tabla 1. Media de los parámetros clásicos medidos en los vinos acabados a partir del final de la fermentación maloláctica. Preparación de Preparación de Testigo sin Análisis enzimas de enzimas de enzima con maceración maceración MPF (sin MPF) con MPF Grado Alcohólico Volumétrico 12,7 ± 0,05 12,9 ± 0,01 12,9 ± 0,03 (en % vol.) Acidez volátil (g/l H 2 SO 4 ) 0,22 ± 0,02 0,22 ± 0,03 0,27 ± 0,03 ph 3,42 ± 0,06 3,36 ± 0,02 3,41 ± 0,01 Estos resultados muestran que los tres vinos fueron vinificados de forma homogénea. Las enzimas no tienen una influencia significativa sobre los parámetros clásicos de los vinos. La composición polifenólica de los vinos fue determinada en diferentes fases de la vinificación. Están presentados sólo los análisis del final de la fermentación maloláctica (Tabla 2). Tabla 2. Análisis de precisión efectuados al final de la fermentación maloláctica. Preparación de Testigo sin Análisis enzimas de enzima con maceración MPF (sin MPF) IC Intensidad colorante (Vinos acabados final de FML) Preparación de enzimas de maceración con MPF 8,9 11,8 (+32%) 11,7 (+32%) DO280 nm (Vinos acabados final de FML) (+16%) 50 (+16%) Turbidez en NTU (Vinos acabados final de FML) 44,6 14,2 11,9 Grado de polimerización medio (DPm) 5,4 ± 0,9 6,9 ± 0,1 8,4 ± 0,8 Fenoles polimerizados (mg/l) (42%) 622 (43%) Antocianos totales (mg/l) (+10%) 559 (+17%) Antocianos polimerizados (mg/l) Antocianos monoméricos (mg/l) (+24%) 49 (+32%) (+9%) 510 (+16%) Los resultados muestran diferencias significativas a nivel de la intensidad colorante y de la D0 280 nm con + 32 % y +16 % respectivamente para los vinos enzimados en relación al testigo (MPF) mientras que la maceración prefermentativa en frío con enzima no permite extraer más compuestos fenólicos que el vino tratado con sólo la enzima. Son por tanto las actividades de la preparación enzimática las que han permitido extraer de los hollejos una mayor cantidad de compuestos fenólicos y quizás también los compuestos más difíciles de extraer con sólo la maceración.

5 LUMLEY, EFECTOS DE LAS ENZIMAS DE MACERACIÓN Y DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA EN FRÍO, PÁG. 5 Los compuestos fenólicos a continuación fueron analizados con mayor precisión por cromatografía líquida de altas prestaciones y se determinaron los grados medios de polimerización para cada modalidad. Todos los análisis confirman las diferencias entre los vinos enzimados y los vinos obtenidos con sólo la maceración prefermentativa en frío sin enzimas (testigo). Los vinos tratados con la preparación enzimática comparados con el testigo presentan unos polifenoles más polimerizados (+ 42 %), más antocianos totales (de +10 % a +17 %) que confirma el resultado obtenido para la intensidad colorante, unos antocianos más polimerizados (de +24 % a +32 %), y también más antocianos monoméricos (de + 9 % a +16 %). Perfiles polifenólicos 10 DPm Degré de polymérisation moyen Preferencia en la cata Témoin avec MPF Enzyme seule (sans MPF) Enzyme avec MPF Testigo(MPF) Enzima Enzima+MPF Los resultados obtenidos por lo que respecta los grados medios de polimerización (DPm) de los taninos muestran también diferencias a nivel de las longitudes de las cadenas de taninos. Los vinos tratados con una preparación enzimática tienen unos DPm más importantes con respecto a sólo la maceración en frío, lo que parece indicar que las moléculas extraídas por tratamiento enzimático son diferentes o bien que se polimerizan más rápidamente porque son extraídas muy pronto. Es interesante señalar un aumento de este DPm para la modalidad enzima+ MPF. Estos vinos estuvieron descritos sensorialmente por un panel de expertos y el vino preferido estuvo correlado con un grado de polimerización de 8. Este resultado corrobora la hipótesis según la cual taninos con unos DPm<5 presentan notas amargas, unos DPm entre 5 y 10 corresponden a vinos muy suaves y agradables mientras que para unos DPm>11, los vinos son descritos como astringentes y duros. La utilización de enzimas de maceración comparada con solamente la maceración prefermentativa permite obtener más compuestos fenólicos polimerizados (antocianos y taninos) y por tanto mejor estabilizados. Por otro lado, se observó una diferencia muy significativa a nivel de turbidez lo que demuestra una clarificación más importante de los vinos enzimados en relación al testigo sin enzima. Este fenómeno se verificó también en los zumos de prensa procedentes de mostos tratados con enzimas que contenían menos azúcares residuales (0.8 g/l) respecto a los procedentes de mostos no tratados (2.1 g/l). Estos vinos tratados por tanto quedan limpios más rápidamente que los vinos no enzimados.

6 LUMLEY, EFECTOS DE LAS ENZIMAS DE MACERACIÓN Y DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA EN FRÍO, PÁG. 6 CONCLUSIÓN Estos ensayos han permitido mostrar el efecto positivo de una preparación enzimática específica para la maceración sobre la extracción, con respecto a sólo la maceración prefermentativa en frío. La preparación enzimática permite extraer más compuestos fenólicos que sólo la maceración en frío y estas moléculas parecen mejor estabilizadas en los vinos enzimados (taninos y antocianos más polimerizados). Los resultados de polimerización de los taninos fueron comparados con los resultados obtenidos con la cata. Parece existir un efecto sinérgico de la enzima con la maceración prefermentativa en frío. Este vino fue calificado como más equilibrado y aromático, especialmente a nivel de las notas de frutos rojos, y más redondo en boca. Ahora queda caracterizar de forma más precisa las moléculas extraídas (tipos de taninos y de antocianos, polisacáridos). Estos ensayos muestran que en las condiciones de vinificación de estos vinos modernos frutales y coloreados, una preparación enzimática específica para la maceración permite reducir los tiempos de MPF e incluso suprimir esta etapa siempre preservando e incluso mejorando las características analíticas y sensoriales. Se preferirá por tanto un protocolo con una maceración prefermentativa en frío a C durante 48 h con enzimas respecto a una maceración más larga (y por tanto más costosa) y a temperatura más baja sin enzima en la que el efecto a nivel gustativo no ha sido nunca claramente demostrado. BIBLIOGRAFÍA 1. Sacchi, K. L., Bisson, L. F., Adams, D. O A review of the effect of winemaking techniques on phenolic extraction in red wines. American Journal of Enology and Viticulture, 56 (3), Canal-Llaubères, R. M., Les enzymes et leur application en œnologie. Ed. Ferret, Bordeaux dans Produits de traitement et auxiliaires d élaboration des moûts et des vins, Touzani, A., Muna, J. P., Doneche, B Effet du pool enzymatique exocellulaire de Botrytis cinerea sur les cellules de vitis vinifera. Application à la pellicule du raisin. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin , Ducruet, J., Dong, A. N., Canal-Llauberes, R. M., Glories, Y Influence des enzymes pectolytiques sélectionnées pour l'oenologie sur la qualité et la composition des vins rouges. Revue Française d'œnologie, (166), Ducruet, J., Glories, Y., Canal-Llauberes, R. M Étude de l'influence d'une préparation enzymatique de macération sur le vin et le raisin rouge. Revue des Œnologues, 27 (97) Amrani-Joutei, K Localisation des anthocyanes et des tanins dans le raisin. Etude de leur extractibilité. Thèse de doctorat ès sciences, Université de Bordeaux II. 7. Cambas, A Les facteurs de dissolution des composés phénoliques au cours de la vinification. Thèse de doctorat de 3 e cycle, Université de Bordeaux II. 8. Parenti, A., Spugnoli, P., Calamai, L., Ferrari, S., Gori, C Effects of cold maceration on red wine quality from Tuscan Sangiovese grape. European Food Research and Technology, 218, 4, Parley, A The Effect of Pre-Fermentation Enzyme Maceration on the Extraction and Stability of colour in Pinot noir wine. PhD Thesis, University of Lincoln. 10. Kennedy, J. A., Ferrier, J., Harbertson, J. F., des Gachons, C. P Analysis of Tannins in Red Wine Using Multiple Methods: Correlation with Perceived Astringency. Am. J. Enol. Vitic., 57(4),