Mecanismos de Resistencia. Lic en Bioquímica-Lic en Biotecnología-2016
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- Luis Miguel Morales Redondo
- hace 6 años
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1 Mecanismos de Resistencia Lic en Bioquímica-Lic en Biotecnología
2 1945. Discurso de aceptación del Premio Nóbel: Sir Alexander Fleming previene sobre el peligro de la resistencia: No es difícil obtener microbios resistentes a la penicilina en el laboratorio, exponiéndolos a concentraciones que no son suficientes para matarlos; y lo mismo puede suceder en el organismo Alexander Flemming Resistencia antimicrobiana Resistencia antimicrobiana: es la pérdida completa o relativa del efecto antimicrobiano contra un microorganismo previamente Sensible Incremento de la CIM Se considera que un microorganismo es resistente a una droga cuando las concentraciones de ésta, necesarias para inhibirlo, son superiores a la concentración que puede alcanzar en el sitio de la infección 2
3 Expertos pertenecientes al Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades (ECDC) y los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de EE.UU definieron una terminología internacional normalizada que permita describir los perfiles de resistencia adquirida por los microorganismos. MDR se define a aquel microorganismo resistente al menos un agente en tres o más categorías antimicrobianos. XDR se define a aquel microorganismo resistente al menos un agente en todos menos dos o menos categorías antimicrobianos (es decir, los microorganismos son susceptibles a sólo uno o dos categorías). PDR se define a aquel microorganismo resistente a todos los agentes antimicrobianos en todas las categorías (es decir, no hay agentes probados como susceptibles de ese organismo). 3
4 Resistencia antimicrobiana En todas las poblaciones bacterianas siempre está presente una población de mutantes resistentes naturales (frecuencia de mutación ) El número de mutantes resistentes aumenta con el inóculo bacterias sensibles Bacterias bacterias resistentes Bajo la presión del antibiótico la subpoblación sensible es inhibida y las mutantes resistentes pueden sobrevivir y transformarse en la población dominante (selección) Los antibióticos seleccionan la bacteria resistente 4
5 Bases genéticas de la resistencia Natural Codificada cromosómicamente. No varía de una bacteria a otra en la misma especie. Ej.:Enterobacterias resistentes a penicilina Adquirida Resistencia cromosómica: Alteración estructural del DNA cromosómico MUTACIÓN Resistencia extracromosómica: Adquisición de DNA extracromosómico EVENTOS GENÉTICOS DE LA RESISTENCIA Bacteria Sensible Bacteria Resistente Mutación XX Transferencia genética Bacteria Resistente 5
6 Surgimiento de la resistencia Década de los 60: Se observan casos de resistencia en todas las regiones del mundo. Entre 1979 y 1987: 0.02% de las S. pneumoniae son resistentes a la penicilina. Década del 80 aparece la resistencia a cefalosporinas En el 2008: En los Estados Unidos ~40% de las S. pneumoniae es resistente a las penicilina. Transferencia del gen vana de E. faecalis a S. aureus 6
7 Resistencia adquirida a los antimicrobianos MECANISMOS Producción de enzimas inactivantes que convierten a la droga activa en producto inerte Β-lactamasas Pencilina Enzimas adenilantes Estreptomicina, Aminoglucósidos Enzimas acetilantes Cloranfenicol, Aminoglucósidos Cambios de permeabilidad celular al medicamento Cambios en los canales porínicos de la membrana externa (quinolonas y Betalactámicos Cambios en la concentracion de cationes del LPS (aminoglucosidos y Betalactámicos Cambio estructural de la zona de acción del medicamento Alteración Prot P10 (30 S ribosomal) Estreptomicina Alteración de las pbp (Betalactámicos) Metilación ribosomal (macrólidos) Alteración de ADN girasa Eliminación mediante bomba de eflujo Desarrollo de vías metabólicas alternativas Síntesis de una enzima resistente Capacidad para usar ácido fólico preformado, no requieren PABA Producción incrementada de PABA 1. Inactivación enzimática de la droga -Hidrólisis (Beta lactamasas) - Modificación química Es el principal mecanismo de resistencia frente a los betalactamicos. Las betalactamasas hidrolizan el anillo betalactamico y por tanto inactivan el antibiótico antes de su unión con las PBP. 7
8 Modificación química Cloranfenicol: Acción de la cloranfenicol- acetil- transferasa 2. Cambios en el sitio blanco Cambio de PBP (Penicilinas, Cefalosporinas) Subunidad ribosomal 30S (Estreptomicina, Tetraciclina) Subunidad ribosomal 50S (por mutación en la proteina (L4 o L12); metilación del ARN 23S, en Eritromicina Enzimas ADN girasa Quinolonas ARN polimerasa Rifampicina 8
9 3. Disminución de la permeabilidad de la membrana Naturaleza de la membrana externa Gram negativa: Resistencia intrínseca a ATM hidrofóbicos (macrólidos, ciprofloxacina, levofloxacina) Disminución en la síntesis de porinas: Afecta la entrada de ATM hidrofílicos (beta-lactámicos, aminoglucosidos, glucopeptidos) 4. Sistemas de Eflujo La bacteria es capaz de expulsar el ATB mediante un mecanismo de transporte activo que consume ATP 9
10 BOMBAS DE EFLUJO 5. Vías metabólicas alternativas Variante de DHFR, Trimetroprim Variante de la dehidropteroato sintetasa, Sulfametoxazol 10
11 Fuente: Todar K. Todar s Online Textbook of Bacteriology En línea en: 11
12 Bases genéticas de la resistencia adquirida Alteración estructural del DNA cromosómico MUTACIÓN Resistencia cromosómica Adquisición de DNA extracromosómico Resistencia extracromosómica (epidémica o infecciosa) Plásmidos de Resistencia conjugativos ( R) Características Infecciosidad Resistencia a varias drogas a la vez Plásmidos de Resistencia no conjugativos ( r ) (se transfieren por tansducción) Mecanismos genéticos de la resistencia ATM Mutaciones cromosómicas puntuales: Eventos de ocurrencia espontánea, persistente que se transmite por herencia Son de difícil detección Son de baja frecuencia Resistencia a una sola droga Diseminación vertical (Mutaciones) 12
13 Mecanismos genéticos de la aparición y diseminación de la resistencia ATM Adquisición de nuevos genes - Transformación - (poca importancia clínica) - Transducción - (DNA plasmídico incorporado a un fago y transferido a otra bacteria) - Conjugación - (Plásmidos R) - Transposición - (plásmido a plásmido; plásmido a cromosoma) PLASMIDOS R Transportan genes de resistencia a los antibióticos, y con frecuencia varios genes de resistencia son transportados por un único plásmido R Determinante R agrupación de genes de resistencia del plásmido R (complejo de transposones) Factor de transferencia de resistencia región con genes involucrados en la transferencia de resistencia mediante conjugación Diseminación horizontal (Plásmidos) Mapa genético de plásmido de resistencia R conjugativo 13
14 Transmisión del factor R ENTEROBACTERIACEAE Neisseria gonorreae Haemophilus influenzae Grupo Vibrio Pasteurella pestis Grupo Pseudomonas Conjugación 14
15 Transferencia inter-microbiana de plásmidos que contienen genes de resistencia ocurre por conjugación, transformación y transducción 15
16 Plásmidos de resistencia no conjugativos Son elementos genéticos autorreplicantes Residencia estable en el huésped Espectro de resistencia menor Menor tamaño Se transfieren por transducción (fago) Presentes en Gram negativas y Gram positivas MECANISMOS DE RESISTENCIA EN ATB BETA- LACTAMICOS 1) PRODUCCION DE BETA-LACTAMASAS 2) ALTERACION DE (PBP) - Reducción en la afinidad en las PBP pre-existentes - Pérdida o aumento en la cantidad de PBP - Aparición de PBP nuevas (ej PBP 2a) 3) ALTERACION DE PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA EXTERNA 4) EFLUJO 16
17 Penicilinasa (ß Lactamasa) La producción de βlactamasas plasmídicas (TEM-1, TEM-2 y SHV-1) por bacterias gramnegativas es el principal mecanismo de resistencia bacteriana a los antibióticos betalactámicos. Producción de enzimas (betalactamasas) Es el principal mecanismo de resistencia frente a los betalactamicos, especialmente en G-negativos (también pueden producirlas G-positivos y anaerobios). Las betalactamasas hidrolizan el anillo betalactamico y por tanto inactivan el antibiótico antes de su unión con las PBP. Su producción puede estar mediada por plásmidos o puede estar cromosómicamente codificada. En el primer caso, pueden ser transferibles y los inhibidores de betalactamasas suelen inactivarlas; Ej las producidas por S. aureus sensible a la meticilina. 17
18 Producción de enzimas (betalactamasas) Microorganismos con betalactamasas de origen cromosómico como Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Citrobacter spp., Serratia spp., son inducibles; es decir aumenta su producción tras la exposición a betalactamicos, especialmente cefalosporinas y no son sustrato de los inhibidores de las betalactamasas. Hay muchos tipos de betalactamasas en función de los betalactamicos que hidrolizan. El uso (y abuso) de los antibióticos durante décadas ha favorecido la evolución de estas enzimas hacia una nueva generación, las llamadas BLEE, que son capaces de hidrolizar las cefalosporinas de tercera generación y el monobactamico aztreonam Gramnegativos productores de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) Las BLEE confieren resistencia a las cefalosporinas de espectro extendido (por ej. ceftriaxona, cefotaxima y ceftazidima), al aztreonam y a oximinobetalactámicos relacionados. 1983: Primera documentación de betalactamasas plasmídicas capaces de hidrolizar las cefalosporinas de espectro extendido. Derivadas de mutaciones de genes plasmídicos para TEM-1, TEM-2 o SHV-1 que extienden el espectro de antibióticos betalactámicos sensibles a hidrólisis por esas enzimas. Fuente: 18
19 Significación clínica de las BLEE Las BLEE se encuentran en Klebsiella, E. coli, Enterobacter, Proteus, Citrobacter, Pseudomonas Los plásmidos responsables de la producción de BLEE frecuentemente portan genes que codifican resistencia a otras clases de medicamentos (aminoglicósidos). Factores de riesgo Pacientes en estado crítico Hospitalización prolongada (11-67 días) Dispositivos médicos invasivos Tratamiento ATM intensivo Fuente: AMINOGLUCOSIDOS Modificación del sitio blanco ribosomal Hidrólisis enzimática (estearasa) Alteración de los sistemas de producción energética, cierra los canales iónicos, de modo que el ATB no puede ingresar al citoplasma 19
20 Evaluación de la susceptibilidad a un antibiótico En el laboratorio se puede estudiar la susceptibilidad a antimicrobianos que presentan bacterias aisladas desde una muestra biológica... La susceptibilidad a antimicrobianos, junto con la identidad de la bacteria aislada y factores del hospedador constituyen las bases para la elección de una terapia antimicrobiana adecuada Definiciones Concentración inhibitoria mínima (CIM) Corresponde a la menor concentración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano luego de 18 a 24 horas de incubación. Concentración bactericida mínima (CBM ) Corresponde a la menor concentración capaz de matar un 99,9% la población bacteriana. 20
21 Antibiograma por dilución Técnica de referencia en los estudios clínicos de susceptibilidad Entrega un resultado cuantitativo, ya que permite determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM). Se puede realizar en medio líquido (dilución en caldo) o en medio sólido (dilución en agar). Método complejo y de alto costo. Lectura del CIM replicador Steers Dilución seriada en caldo CIM Dilución seriada en agar CIM de cepas 4 a 11: 2 CIM de cepas:1 y2: 4 CIM cepa 3: 8 Antibiograma por difusión Técnica de Kirby-Bauer Es el método más usado Es práctico y sencillo de realizar e implementar Permite analizar un gran número de antibióticos al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones Entrega un resultado cualitativo (bacteria sensible o resistente) Disco 21
22 Difusión en agar 22
23 Test de Sensibilidad antibiótica Disk Diffusion Test Determination of MIC Str Tet Ery Tetracycline (µg/ml) MIC = 2 µg/ml Chl Amp E- test 23
24 Asociaciones de antimicrobianos. Técnica del tablero de ajedrez En el eje de las X se coloca concentraciones crecientes del antimicrobiano A, de menor a mayor concentración. Las columnas poseen las mismas concentraciones. En el eje de las Y se colocan las concentraciones del antimicrobiano B. Las filas poseen las mismas concentraciones FIC Az= 128/128 =1 FIC Am= 1/32 = 0,03125 ƩFIC= 1,03 FIC Az= 32/128 = 0,25 FIC Am= 4/32 = 0,125 ƩFIC = 0,375 Indiferencia: 0,5 < X 4 Sinergismo: X 0,5 Antagonismo: X > 4 Sinergismo parcial: 0,5 < X < 1 Detección genotípica Tomado de Juan Alberola. Fac de medicina y odontologia 24
25 Qué utilidad tienen la pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos? Instaurar un tratamiento antibiótico correcto al paciente. Seguimiento y confirmación de tratamientos empíricos. Epidemiología. Utilidad diagnóstica. Impacto económico del aumento de cepas resistentes Debido a la resistencia, los países destinan millones de dólares cada año a la contención y tratamiento de las infecciones. Esos gastos no sólo afectan al sector de la salud, sino a toda la economía. Causas del incremento de los gastos: Laboratorios y servicios de rayos X adicionales Tratamientos alternativos más costosos Estancias más prolongadas en los hospitales Procedimientos más complejos para el control de las infecciones Deterioro de la calidad de vida Incremento de la cobertura de los seguros privados Incremento de los gastos generales de los servicios de salud Incremento del costo de la vigilancia epidemiológica Aumento de la carga de la familia de la persona infectada Incremento de los gastos de las compañías donde trabajan los pacientes debido al ausentismo 25
26 Carga provocada por las enfermedades Las infecciones resistentes aumentan el tiempo de hospitalización de los pacientes y las tasas de mortalidad. Incremento del 5.02% en el riesgo de mortalidad por infección con Enterobacter resistente a las cefalosporinas. S. aureus resistente vs. S. aureus sensible a la meticilina: 20.1% vs. 6.7% de mortalidad relacionada con infecciones de heridas quirúrgicas. Hasta el 30-40% de las personas son portadores asintomáticos de S. aureus y 70-80% of S. aureus es resistente a las penicilinas. MRSARM-AH vs. SARM-AC Enterococos son Cocos grampositivos anaeróbicos facultativos, comensales del intestino humano: E. faecalis (90-95%) y E. faecium (5-10%). Algunos Enterococos son íntrinsecamente resistentes a los β-lactámicos (algunas penicilinas y prácticamente todas las cefalosporinas), así como aminoglicosidos. En las dos últimas décadas han surgido cepas particularmente virulentas resistentes a la vancomicina (conocidas como ERV) Pseudomonas aeruginosa resistentes a múltiples medicamentos: Se triplica la mortalidad y la duración de la estancia en el hospital aumenta 1.7 veces. Significación clínica del ERV Factores de riesgo relacionados con los hospitales Admisión en una U Cuidados Intensivos Proximidad a pacientes con ERV Duración de la hospitalización Múltiples ingresos en la unidad Alimentación enteral Factores de riesgo relacionados con los medicamentos Cantidad, tipo y duración de la terapia ATM Uso de vancomicina Uso de cefalosporina de tercera generación Antibióticos antianaeróbicos (clindamicina) Fluoroquinolonas (como el ciprofloxacina) Preparaciones pre-operatorias de colon La mayoría de las infecciones con ERV pueden tratarse con antibióticos que no sean la vancomicina. Las personas colonizadas con ERV (las bacterias están presentes, pero no aparecen síntomas de infección) generalmente no necesitan tratamiento. 26
27 Factores que influyen en el desarrollo y diseminación de la resistencia 27
28 Factores que influyen en el desarrollo y diseminación de la resistencia Urbanización acelerada Contaminación y degradación ambiental Reservorios animales Cambios demográficos Epidemia de SIDA Crecimiento del comercio y los viajes internacionales Papel de la pobreza Acceso a medicamentos sin receta Alimentos para animales Productos de limpieza antibacterianos Medicamentos falsificados Urbanización acelerada Se espera que en Asia y África la población urbana se duplique y llegue a ser de alrededor de 3.4 miles de millones en El crecimiento de una población más allá de sus recursos trae como resultado el hacinamiento y una deficiente higiene y saneamiento. Debido a la deficiente higiene y saneamiento, aumenta la prevalencia de las enfermedades. Aislados de E. coli de zonas urbanas de Nigeria mostraron una resistencia antimicrobiana considerablemente mayor que los de zonas rurales y suburbanas del SO de Nigeria. 28
29 Contaminación ambiental Contaminación fecal del suministro de agua provocada por fugas en tanques sépticos o por el escurrimiento de estiércol desde los campos. Las heces contenidas en el agua hacen que patógenos humanos o animales entren en contacto con bacterias potencialmente resistentes. Esa agua se utiliza para beber o para regar los campos. Aumento de niveles de contaminación atmosférica por ozono Más microorganismos se incorporan al agua de beber debido al incremento de las lluvias y del escurrimiento. Mayor riesgo de transferencia de la resistencia. Reservorios animales Definición: Enfermedad en animales que pueden transmitirla a los humanos en condiciones de contacto cercano y/o cuando se produce una mutación genética del patógeno. Reservorios animales comunes: cerdos aves, vida silvestre acuática Patógenos: Influenza, enfermedad de Lyme, virus Ebola Cómo ocurre la transferencia? Influenza: Virus RNA con un reservorio aviar El virus se replica en el tracto intestinal de las aves acuáticas. El virus se disemina en las poblaciones de aves mediante el contacto con las heces. Intermediario entre las aves y los humanos: el cerdo Los cerdos sirven de hospederos a virus de las aves y los seres humanos. Los humanos entran en contacto con cerdos infectados con influenza y adquieren la enfermedad. Págin6 29
30 Epidemia de SIDA y cambios demográficos Las personas que viven con VIH / SIDA, los jóvenes y los ancianos tienen una menor capacidad natural para combatir las infecciones. Más pacientes inmunocomprometidos en una población Se hace más fácil la transmisión y la diseminación de las infecciones Son mayores las probabilidades de surgimiento y diseminación de la resistencia Globalización del comercio y los viajes Debido a la globalización, los microbios viajan más rápido y más lejos; ninguna región escapa a sus efectos. La RAM es más marcada en los países en desarrollo. Los organismos comensales RAM generalmente son parte de la flora intestinal normal de los habitantes de países en desarrollo. La migración urbana, los deficientes sistemas de alcantarillado y el hacinamiento estimulan la diseminación de la RAM. La mayoría de las cepas tifoideas resistentes a múltiples medicamentos de los Estados Unidos provienen de 6 países en desarrollo. 30
31 Cría de animales El uso de dosis subclínicas de antibióticos en los alimentos para animales propicia el desarrollo de microorganismos resistentes, tales como Campylobacter, Salmonella, E. coli y Enterococcus faecium. El uso de antibióticos en animales crea reservorios de resistencia. Los humanos consumen carne roja o de ave contaminada con organismos resistentes. La ingestión de bacterias RAM modifica la microbiota intestinal normal. Posible adquisición de una infección resistente RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS Acuicultura Como ocurre en la cría de animales, frecuentemente se usan antibióticos en la acuicultura, las granjas comerciales y el cultivo de mariscos para prevenir las infecciones. Mecanismos de diseminación de organismos resistentes a los antibióticos: Traslado de peces y por consiguiente de las bacterias antibióticas que ellos portan de un entorno a otro Los alimentos no consumidos por los peces y las heces, ambos conteniendo antibióticos, se depositan en el fondo del criadero junto con los sedimentos naturales. Los antibióticos se lixivian del sedimento y viajan a sitios distantes. Contaminación de los criaderos de peces con aguas no tratadas que contienen flora intestinal normal y patógenos. 31
32 Diseminación de gen de resistencia antimicrobiana debido a la aplicación de estiércol en los campos agrícolas La liberación de altas concentraciones de antibióticos y genes de resistencia en los ecosistemas naturales es un evento reciente en términos evolutivos. Afecta la estructura y la actividad de las poblaciones microbianas ambientales. Dado que los microorganismos ambientales son la fuente original de los genes de resistencia adquiridos por patógenos humanos, estos cambios son relevantes para el futuro de la salud humana. Los genes de resistencia a antibióticos tienen las mismas plataformas genéticas (plásmidos, integrones) y están presentes en los patógenos humanos, en ambientes prístinos y en las poblaciones (humanos y animales) que están aisladas y no han estado en contacto con antibióticos. Esto indica que, una vez que están integrados en los elementos de éxito de genes de transmisión, los genes de resistencia a antibióticos pueden persistir y propagarse incluso en ausencia de antibióticos. 32
33 Transferencia entre humanos y sus animales domésticos Productos de limpieza antibacterianos Generalmente los jabones antibacterianos contienen triclosán. No se ha demostrado que proporcionen ninguna protección contra las infecciones. Los productos de limpieza antibacterianos generalmente contienen compuestos de amonio cuaternario. Se han utilizado durante décadas. En los hogares donde su uso es elevado se ha observado un incremento de la resistencia. Es necesario continuar investigando esos compuestos: es posible que su uso frecuente estimule la RAM. 33
34 Acceso a medicamentos sin receta En muchos países en desarrollo es fácil obtener antibióticos en los hospitales, farmacias sin receta Características de los medicamentos sin receta que contribuyen a la RAM: Calidad subestándar Dosis subterapéuticas Automedicación inapropiada Es fácil obtener antibióticos sin receta en las nuevas farmacias de Internet o en las de servicio por correo. Existen pocas regulaciones para monitorear las ventas de medicamentos por Internet. Es difícil imponer restricciones a la venta de esos medicamentos debido a las características de Internet y de las ventas internacionales. Medicamentos falsificados y de calidad subestándar Los ATM parecen ser los productos más falsificados en los países en desarrollo. Los medicamentos para la tuberculosis, la malaria y el VIH son los más comunes. Pero también se falsifican antibióticos 'antiguos : penicilina, tetraciclina, cotrimoxazol, cloramfenicol. Un estudio realizado por la OMS en 7 países africanos encontró que entre 20-90% de los antimaláricos eran falsos. La ineficacia de muchas de las leyes en vigor en los países en desarrollo facilita la venta de medicamentos falsificados. Además, en muchos casos las condiciones de almacenamiento y transporte en esos países conducen a la degradación y la pérdida de la eficacia de los medicamentos. Holograma auténtico del artusenato Copia en una hoja de plata Falsificación Fuente: Aldhous, P. Nature,
35 Pobreza Factores que dificultan la prevención de las infecciones: Insuficiente consumo de calorías y nutrientes Deficiente higiene y saneamiento Hacinamiento Factores que dificultan el control de las infecciones: Falta de acceso a las instalaciones de salud Falta de acceso a los medicamentos Falta de instrucción acerca de los antimicrobianos Falta de dinero para comprar los medicamentos del ciclo completo de tratamiento Mientras más sean las infecciones, mayores serán las probabilidades de que la RAM aparezca y se disemine. Qué podemos hacer? LAS PERSONAS Higiene personal Informar a los demás acerca del problema LOS HOSPITALES Perfeccionar el control de las infecciones hospitalarias Poner en vigor las regulaciones de los comités de protección al paciente LOS MEDICOS Indicar los medicamentos correctamente Instruir a los pacientes acerca del uso correcto de los antibióticos Recopilar más información sobre el alcance de la resistencia LOS GOBIERNOS Incrementar el acceso a medicamentos apropiados en todos los países Revitalizar las innovaciones en la esfera de los antibióticos Revitalizar las innovaciones relacionadas con tecnologías de diagnóstico rápido Revitalizar las vacunas dirigidas a organismos RAM 35
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38 Los antimicrobianos por si solos no hacen milagros ni son mágicos, simplemente colaboran en el tratamiento del proceso infeccioso. Pueden dejar de curar!! Muchas gracias!!! 38
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