GUIA DE MÉTODOS DE ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
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- Montserrat Murillo Rojas
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1 UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA ESCUELA DE QUIMICA FACULTAD DE CIENCIAS INSTRUMENTAL ANALITICO GUIA DE MÉTODOS DE ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA Caracas 2013 Profa. Rosa Amaro Prof. Luis Gómez Prfa. Yosmery Vita Prof. María A. Alvarez
2 TABLA DE CONTENIDO Contenido Prólogo. 3 Determinación de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C.. 5 Determinación de cafeína en refresco (PEPSI) 6 Determinación de cafeína, acetaminofén y/ó acido acetilsalicílico en analgésicos 8 2
3 PRÓLOGO La cromatografía líquida de alta eficiencia, es una técnica analítica que presenta un amplio campo de aplicación. En particular, la cromatografía de reparto en fase inversa, empleada en el laboratorio de instrumental analítico, es aplicable a la determinación de sustancias orgánicas presentes en fármacos, productos de alimentación y de la industria química, contaminantes de diferentes tipo así como en sustancias bioquímicas y otras presentes en muestras forenses y médicas. Establecer las condiciones en el Sistema HPLC 1. Emplear eluentes grado HPLC. 2. Filtrar los eluentes a utilizar y luego desgasificar por un tiempo aproximado de 10 min mediante ultrasonido, ó 3 min mediante burbujeo con He. 3. Seleccionar el eluente (puro o mezclas de ellos) a utilizar en la separación. 4. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo contrario si se va emplear mezcla de eluente colocar programación de los mismos. 5. Purgar el equipo empleando el eluyente seleccionado, mediante la apertura de la válvula de la bomba (solo dar dos vueltas). Colocar el flujo en un valor de 5 ml/min (botón designado como 2/flow), presionar enter (para dejar este valor como preestablecido) y presionar el botón pump para encender la bomba. Dejar el proceso de purga por 5 min aproximadamente. 6. Colocar el flujo en 0,2 ml/min y luego cerrar la válvula. De esta manera se hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a la bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1 ml/min hasta llegar a 1 ml/min. 7. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra a analizar y los patrones para la cuantificación. Optimización de las condiciones de separación y análisis La optimización de las condiciones de separación de los componentes (Composición, flujo y presión de la fase móvil) se realiza con la solución de muestra. Para comenzar, se seleccionan las condiciones intermedias de polaridad de la fase móvil, flujo y presión. Se inyecta la muestra y de acuerdo al cromatograma obtenido se ajustan las condiciones (una a una) para obtener la mejor separación en el menor tiempo de análisis. Razone el cambio de condiciones y consulte a su preparador o profesor antes de proceder a modificar las condiciones del análisis, para evitar demoras en la realización de la práctica así como el consumo de fase móvil. Recuerde que el cambio de condiciones requiere la purga del sistema, antes de la próxima inyección. Una vez conocidas las condiciones de separación, se procede a inyectar las soluciones patrones y las de muestra. Equipo El equipo de cromatografía que se encuentra en el laboratorio de Instrumental analítico tiene las siguientes características: Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia, marca Jasco Modelo L Terniary gradient, Bomba Jasco PU-2080 plus HPLC, Desgasificador Populaire. Detector: UV/Vis 2075 plus ( Fotomultiplicador) Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μl 3
4 Columna de acero Inoxidable (fase estacionaria: C18); Longitud: 250 mm; Diámetro interno: 4.6 mm; y Tamaño de partícula del soporte: 5 μm. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN UNA PASTILLA DE VITAMINA C. Objetivos General: Determinar el contenido de ácido ascórbico en pastillas de vitamina C usando la técnica de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC). Específicos: Adiestramiento en el manejo de equipos de cromatografía líquida de alta eficiencia. Aplicar el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtración y desgasificación de los mismos. Ajustar los parámetros instrumentales, que permitan obtener una buena separación de los picos en la muestra de vitamina C. Analizar cuantitativamente el contenido de ácido ascórbico mediante el uso de curva de calibración externa. Determinar la precisión del análisis y compararla con la dispersión de la composición en el lote de producción del fármaco. Parte Experimentales Condiciones Experimentales - Volumen de inyección 10μL - Detección a 254 nm - Flujo y presión a optimizar - Fase móvil a optimizar (usualmente: 50 mm de KH 2 PO 4 ) Esquema 1. Preparación de la curva de calibración. Se prepara una madre de 200 ppm de acido ascórbico. Se prepararan por dilución cuatro patrones de 5, 10, ppm Se inyectan al HPLC bajo condiciones óptimas y grafique los valores de área de pico en función de la concentración 4
5 Esquema 2. Preparación de la muestra Se pesa y pulveriza una pastilla pesar g Disolver en agua, filtra en papel y enrasar a 100 ml. Diluir: 0,40 ml en 25 ml Filtrar (< 45 um) e inyectar al cromatógrafo Nota: - Realizar el procedimiento para tres pastillas (concentración promedio y dispersión en el lote de pastillas). Para una de las pastillas realizar el procedimiento por triplicado (concentración promedio en la pastilla y precisión del procedimiento de análisis). Referencias - Principios de Análisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001 Editorial Mc Graw Hill. - Rubinson K, Rubinson J, Análisis Instrumental. Prentice Hall, España, Pág Año Cavazos R, N. A.; Rivera Z, L.; Torres de Navarro, E. Determinación de fósforo y cafeína en bebidas de cola. Educación química. V.12, pág , año DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN REFRESCO (PEPSI) Justificación El consumo de refrescos es importante a nivel mundial. Se piensa que los refrescos de cola son bebidas relativamente inofensivas y que un excesivo consumo de estos productos no causa más daño que caries dental y un aumento de peso, debido al alto contenido de azúcar. Un refresco contiene ácido fosfórico, cafeína y nuez de cola entre sus componentes principales, estas sustancias pueden llegar a causar diferentes trastornos al organismo. El fósforo está relacionado con el calcio tanto en la nutrición humana como en la absorción de este mineral. La cafeína, por su parte, es la droga psicotrópica de mayor consumo en el mundo. Es un compuesto alcaloide (del grupo de las xantinas) que actúa como estimulante en los humanos. La cafeína produce vasoconstricción; presenta efectos a nivel de los sistemas cardiovasculares, respiratorios y gastrointestinales. Adicionalmente, actúa a nivel de los músculos esqueléticos, del flujo sanguíneo renal, la glucogenólisis y de la lipólisis. El consumo en cantidades muy grandes puede provocar una intoxicación. Sus síntomas son insomnio, nerviosismo, excitación, cara rojiza, aumento de la diuresis y problemas gastrointestinales. En algunas personas los síntomas aparecen consumiendo cantidades muy pequeñas, como 250 mg por día. Más allá de un gramo al día puede producir contracciones musculares involuntarias, desvaríos, arritmia cardiaca, y agitaciones psicomotrices. Los síntomas de 5
6 la intoxicación con cafeína son similares a los del pánico y de ansiedad generalizada. La *LD 50 estimada de la cafeína es de 10 g, cuyo equivalente es de un promedio de 51 tazas de café. Objetivos General: - Determinar el contenido de cafeína en un refresco (PEPSI) por HPLC. Específicos: - Ajustar las condiciones experimentales para la determinación de la cafeína en el refresco. - Determinar el contenido de cafeína en la muestra problema aplicando el método de calibración absoluta. - Determinar la exactitud y la precisión de los resultados analíticos obtenidos a través del método aplicado. Parte Experimentales Condiciones Experimentales - Volumen de inyección 10μL - Detección a 254 nm - Flujo y presión a optimizar - Fase móvil a optimizar (usualmente: 60% agua, 40% metanol) Preparación de la curva de calibración. Se prepara una madre de 2000 ppm de cafeína. Preparar por dilución patrones de 10, 20, 30, 40 y 50 ppm Inyectar bajo condiciones óptimas de presión y flujo y graficar los valores de área de pico vs concentración Preparación de la muestra Desgasificar la muestra con ultrasonido por 15 min o una corriente de He por 3 min. Diluir la muestra (4 veces), filtrar < 45 um e inyectar al cromatógrafo 6
7 DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA, ACETAMINOFÉN Y/Ó ACIDO ACETILSALICÍLICO EN ANALGÉSICOS. Justificación Los analgésicos son medicinas que reducen o alivian los dolores de cabeza, musculares, artríticos y muchos otros achaques y dolores. Existen muchos tipos diferentes de analgésicos y cada uno tiene sus ventajas y riesgos. Algunos tipos de dolor responden mejor a determinadas medicinas que a otras. Además, cada persona puede tener una respuesta ligeramente distinta a un analgésico. La cafeína es una sustancia bastante conocida por todos pero de la que en realidad, se ignoran muchos aspectos que pueden influir en la actividad física. La cafeína ha sido consumida por el hombre desde hace siglos. Constituye la sustancia psicoactiva más empleada en el mundo y se encuentra naturalmente en las hojas de té, los granos de café y en el cacao. La cafeína es un estimulante directo y moderado del sistema nervioso central y también estimula el corazón y el sistema cardiovascular. La combinación del acetaminofén y la cafeína tienen como finalidad obtener un sinergismo en cuanto al efecto analgésico. La cafeína se ha usado durante muchos años como adyuvante analgésico. Sin embargo, los efectos analgésicos adyuvantes de la cafeína no han sido seriamente investigados desde un pool de análisis que se realizaron en 1984 y que demostraron que la cafeína reduce la cantidad de acetaminofén que se necesita para conseguir el mismo efecto en aproximadamente un 40%. Investigaciones in-vitro e in-vivo han proporcionado alguna evidencia de que la cafeína puede tener acciones antinociceptivas por medio del bloqueo de los receptores de la adenosina, inhibición de la síntesis de la ciclo-oxigenasa-2, o por cambios en estados de emoción. Pero esta acción sólo se tiene en cuenta en algunos casos. Esto sugiere que las actuales dosis usadas de analgésico y cafeína pueden influir en los efectos analgésicos adyuvantes de la cafeína. Ensayos clínicos sugieren que la cafeína en dosis mayores de 65mg puede ser provechosa para el aumento de la analgesia, sin embargo, excepto para el dolor de cabeza, los beneficios son ambiguos. En este experimento se determinará el contenido de la cafeína, acetaminofén y/o acetilsalicílico presente en analgésicos disponibles comercialmente, usando la técnica de curva de calibración externa. Para ello se estudiarán los efectos que tiene el cambio de la composición de la fase móvil sobre la separación de los componentes de una mezcla patrón de estos compuestos y se realizará un estudio cualitativo para determinar que componentes están presentes en la muestra para su posterior estudio cuantitativo. 7
8 Objetivos. General: - Determinar el contenido de cafeína, acetaminofén y/ó acido acetilsalicílico en fármaco usando la técnica de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC). Específicos: - Optimizar las condiciones de análisis para la mezcla de componentes en el fármaco - Determinar cuantitativamente los componentes el fármaco mediante curva de calibración externa. - Comparar la precisión del análisis y la precisión del lote de pastillas. Parte Experimental Condiciones Experimentales - Volumen de inyección: 10 μl - Detección a 254 nm - Flujo y presión a optimizar - Soluciones para preparar las fase móviñ: - Solución A: 1000 ml de una solución acuosa al 1% ácido acético - Solución B: 1000 ml de una solución de Metanol grado HPLC al 1% ácido acético (El ácido acético se emplea para igualar la fuerza iónica de las fases y no define la polaridad de las mismas). Análisis Cualitativo Procedimiento: - Prepare soluciones madres de 1000 mg/l de cada patrón. Para ello se disuelve el sólido correspondiente en 40,0 ml de la solución B y se enrasa a un volumen 100,0 ml usando la solución A. - Prepare por dilución soluciones patrón: Prepare 25 ml de soluciones estándares que contengan: a) 10 mg/l de acetaminofén; b) 300 mg/l de acetilsalicílico; y c) 60 mg/l de cafeína. Use la fase móvil A para enrasar cada una de ellas. - Prepare 50 ml de una solución estándar que contenga la mezcla de: 10 mg/l de acetaminofén, 300 mg/l de acetilsalicílico y 60 mg/l de cafeína. Use la fase móvil A para realizar el enrase. - Prepare la solución de muestra de acuerdo al procedimiento descrito en las practicas anteriores Efecto de la composición de fase móvil sobre la separación Estudie el efecto del efecto de las fases móviles de la tabla sobre la separación de los tres componentes en la muestra en estudio. Fase Móvil % A (H 2 O/Hac) % B (CH 3 OH/Hac)
9 a- Inyecte la solución patrón mezcla de los componentes, filtrando previamente < 45 um y emplee la fase móvil de polaridad intermedia, así como el flujo y presión intermedios. b. De acuerdo al cromatograma obtenido, razone el cambio de la fase móvil que debe utilizar para la separación apropiada de los componentes. c. Empleando la fase móvil apropiada, modifique el flujo y luego la presión para obtener el mejor cromatograma. d- Bajo las condiciones óptimas inyecte las soluciones de cada patrón por separado para identificar cada componente. Análisis Cualitativo en la muestra - Prepare una solución de su muestra desconocida pesando 150 mg y disolviendo en 20 ml de la mezcla B y enrase a un volumen de 50,0 ml usando la solución A. - Para determinar los componentes de mayor concentración diluya 0,1 ml de la solución anterior en un balón aforado de 10 ml usando la solución A. Inyecte la solución y obtenga el cromatograma bajo las condiciones óptimas determinadas para la solución patrón mezcla. - Para determinar los componentes de menor concentración de la muestra tome una alícuota de 2 ml de la solución anterior y afore a 10 ml en un balón usando la solución A. Inyecte la solución y obtenga el cromatograma bajo las condiciones óptimas determinadas para la solución patrón mezcla. - Compare los tiempos de retención obtenidos para los picos en los cromatogramas de su muestra de analgésicos e identifique los compuestos presentes en ella. Nota: Filtre las soluciones de muestra < 45 um antes de inyectarlas al cromatógrafo. Curva de calibración. Prepare cuatro patrones multicomponentes en balones de 10,0 ml o 25,0 ml y afore con Solución A Compuesto Intervalo de concentración Acetaminofen 5-20 ppm Ácido acetilsalicílico ppm Cafeína ppm Inyecte cada solución y grafique los valores de área de pico en función de la concentración. Compruebe la linealidad de la curva. Análisis de la muestra Pese y pulverice tres pastillas por separado Pese 0,1500 g de cada una de ellas y disuelva por separado en 40,0 ml de la solución B. Enrase a 100,0 ml usando la solución A Diluya cada una de las soluciones (0,1 ó 0,2 ml en 10 ml) para determinar los componentes de alta o baja concentración, respectivamente Filtre 5 ml de las muestras con un 9 filtro de celulosa o nylon de 0,45 um e e inyecte al cromatógrafo por separado
10 Nota. Realice el procedimiento por triplicado para una de las pastillas,. El reporte se realiza como: - Promedio del análisis de las tres pastillas: Masa de componente por tableta (mg por tableta) Masa de componente / masa de pastilla (en las unidades que correspondan) - Promedio del triplicado de análisis para una pastilla Masa de componente por tableta (mg por tableta) Masa de componente / masa de pastilla (en las unidades que correspondan) - Discuta si la dispersión de la composición en el lote difiere de la precisión del análisis. Referencias - Principios de Análisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001 Editorial Mc Graw Hill. - Rubinson K, Rubinson J, Análisis Instrumental. Prentice Hall, España, Pág Año e/es_1225/sinopsis099.html# ttp:// 10
- Matraces aforados de 25, 100, y ml.
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