HBc IgM. Principio de la Prueba. Propósito de uso. Introducción. Figura 1. Principio de la Prueba

Transcripción

1 HBc IgM 0459 S inmunosupresión, o debido a la supresión de esterorides o interferón. Por lo tanto, la evaluación del anti-hbc es una herramienta útil para el diagnóstico y el control de la hepatitis B. La prueba ayuda a diferenciar entre la hepatitis B aguda o la infección crónica reactivada, y entre la enfermedad crónica asintomática o la remisión persistente. Principio de la Prueba La prueba ImmunoComb II HBc IgM es un ensayo inmunoenzimático de fase sólida (EIA), basado en el principio de la inmunocaptura. La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones ( dientes ). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior anti-hbc de conejo ( Interno) punto inferior anticuerpos de cabra anti-igm humano. La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa. Al comienzo de la prueba, las muestras de suero o plasma se prediluyen a 1:50 y se agregan al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo. El Peine luego es insertado en los pocillos de la fila A. El IgM humano es capturado por los anticuerpos anti-igm en los puntos inferiores de los dientes del Peine (Figura 1). En la fila B, el IgM anti-hbc capturado en los puntos inferiores de los dientes, y el anti-hbc de conejo fijado en los puntos superiores ( Interno), reaccionan con el HBcAg. En la fila C, el HBcAg unido reacciona con el anticuerpo anti-hbc de conejo marcado con fosfatasa alcalina (). En las próximas dos filas, los componentes no unidos son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reacciona con los componentes cromogénicos. Los resultados pueden observarse como puntos azul grisáceo en la superficie del diente del Peine. Código: Formato: 3 x 12 Pruebas α IgM humano anticuerpos humanos IgM Captura de anticuerpos; 60 min Para Diagnóstico in vitro únicamente Propósito de uso El kit ImmunoComb II HBc IgM es una prueba rápida para la detección cualitativa de anticuerpos IgM contra el antígeno core de la Hepatitis B (HBc) en suero o plasma humano. Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit. HBcAg recomb. conjugado α-hbc Reacción HBcAg anticuerpo; 2 min Unión del conjugado anti-hbc; 20 min Introducción El vírus de la hepatitis B (HBV) pertenece a una nueva familia de vírus de ADN llamados Hepadnaviridae. Se caracteriza por un marcado hepatotropismo y un singular medio de replicación a través de un mecanismo de transcripción inversa. El virión completo, o partícula Dane, consiste de una molécula de ADN circular protegida por un antígeno nucleocáspide/nuclear (HBcAg) y rodeada por un envoltorio de lipoproteína conocido como antígeno de superficie (HBsAg). El HBsAg también se encuentra en la sangre en forma de partículas incompletas esféricas o filamentosas no infecciosas. Un componente menor del nucleocáspide HBV, el antígeno HBe (HBeAg), también puede detectarse en la sangre durante la fase replicativa del virus. El vírus de la hepatitis B es un vírus ubicuo de distribución global. Las principales rutas de trasmisión viral son horizontales, a través de la contaminación sexual y parenteral, y vertical, a través de la trasmisión prenatal de la madre infectada al feto. Las consecuencias clínicas de la infección de HBV varían entre las totalmente inaparentes (70% de los casos) a la hepatitis ictérica aguda. La mayoría de los pacientes se recuperan completamente seis meses después del comienzo de la enfermedad. Una pequeña proporción de la población infectada (< 1.5%) puede desarrollar hepatitis fulminante, a menudo con consecuencias fatales. En una proporción sustancial (hasta 10%) de los pacientes adultos, el HBV puede persistir, progresando eventualmente hasta la hepatitis crónica con desarrollo final de cirrosis y hépatocarcinoma. Los portadores crónicos de hepatitis B (200 millones en todo el mundo) constituyen la principal reserva del virus y contribuyen a la diseminación de la enfermedad. Altos títulos (> 1:1000) de anticuerpos IgM contra HBcAg aparecen durante la fase aguda de la infección de HBV, al mismo tiempo que el IgG y el aumento de transminasa. Ya que el IgM anti-hbc declina rápidamente, altos títulos de este anticuerpo son evidencia de una infección aguda de HBV. También pueden observarse niveles detectables de IgM anti-hbc en enfermedades crónicas en casos ocasionales de reactivación de HBV como resultado de la sustrato cromogénico Figura 1. Principio de la Prueba Reacción enzimática de color; 10 min El kit incluye un (IgM anti-hbc) y un Negativo, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de ésta, el diente usado con el debe mostrar 2 puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el Negativo debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy ténue o la ausencia del mismo. El punto superior debe también aparecer en todos los demás dientes, a fin de confirmar que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada de manera correcta. Contenido del Kit Peines El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes, un diente para cada prueba (Figura 2). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas: punto superior anti-hbc de conejo ( Interno) punto inferior anticuerpos de cabra anti-igm humano Figura 2. Peine ImmunoComb II Interno Anti IgM-humano /S13/OR/CE 1

2 Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante. Bandejas de Desarrollo El kit contiene 3 bandejas de desarrollo cubiertas con papel de aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Los contenidos de cada fila son los siguientes: Fila A Diluyente de la muestra Fila B HBcAg recombinante diluído Fila C Anticuerpo anti-hbc de conejo marcado con fosfatasa alcalina Fila D Solución de lavado Fila E Solución de lavado Fila F Solución de sustrato cromogénico conteniendo 5-bromo-4-cloro-3 indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) Figura 3. Bandeja de Desarrollo 1 frasco (tapa roja) de 0,2 ml de plasma humano diluido, inactivado con calor, positivo para anticuerpos IgM anti-hbc. Negativo 1 frasco (tapa verde) de 0,2 ml de plasma humano diluido, inactivado con calor, negativo para anticuerpos anti-hbc. Diluyente de la muestra 1 botella de 20 ml de solución buffer fosfato. Perforador para perforar el papel aluminio que cubre los pocillos de la Bandeja de Desarrollo. Seguridad y Precauciones El contiene HBsAg. Manejar como potencialmente infeccioso, aunque haya sido inactivado con calor. Todos los materiales de origen humano usados en la preparación del kit pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos a HBsAg, así como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C. Ya que ningún método puede garantizar por completo la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirúrgicos y ropas de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No use la pipeta aspirando con la boca. Deseche todas las muestras, Peines usados*, Bandejas de Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use el kit después de la fecha de caducidad. Almacenamiento y estabilidad del kit El kit es transportado entre 2-8 o C. Durante el transporte el kit debe mantenerse entre 30 o C por cortos períodos de tiempo, no excediendo un total de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no se ha dañado durante el transporte." Almacene el kit en su caja original de 2-8 o C. No congele el kit. Después de abrir el kit por primera vez, los componentes deben ser almacenados de 2-8 o C. El desempeño del kit después de abrirlo por primera vez es estable hasta la fecha de expiración del Kit, cuando se almacena de 2-8 o C. Después del primer uso, el peine y la bandeja no deben ser usados por más de tres veces. Manejo de las Muestras Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a temperaturas de 2 a 8 C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por más de 7 días, congélelas a 20 C o a temperaturas más bajas. Después de descongelar las muestras de suero, centrifúguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test. Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario Pipetas de precisión con puntas desechables con capacidad de 10 µl, 25 µl y 490 µl Tijeras Cronómetro de laboratorio o reloj Microtubos Preparación de la Prueba Lleve todos los componentes, bandejas de desarrollo, peines, reactivos y muestras a temperature ambiente y realice la prueba a temperature ambiente (22-26 C). Preparación de la Bandeja de Desarrollo 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37 C por 20 minutos, o deje a temperatura ambiente (22-26 C) por 3 horas. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, para ser desechado como desecho biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo; rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen. Preparación del Peine Precaución: Para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el Peine. 2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o una parte. Para utilizar parte del Peine: a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las muestras y los controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el número del código del kit, "52", para permitir la identificación de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o córtelo con tijeras (ver Figura 4) para separar el número requerido para las pruebas (Nro. de pruebas más dos controles). c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el empaque (con un clip, por ejemplo) para mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas de 2 a 8 C para su uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Fraccionamiento del Peine Instrucciones de la Prueba Predilución de Muestras y es 1. Para cada muestra y control, vierta 490 µl de diluyente de la muestra en un microtubo. 2. A cada microtubo agregue 10 µl de una muestra o del o del Negativo suministrados con el kit. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución. Captura de anticuerpo (FIla A de la Bandeja de Desarrollo) 3. Pipetee 25 µl de una muestra prediluída. Perfore la cubierta de aluminio de un pocillo de la fila A con la punta de la pipeta o el perforador y vacíe la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle la solución vaciando y rellenando el pocillo. Deseche la punta de la pipeta. 4. Repita el paso 3 para las otras muestras prediluídas y los dos controles prediluídos. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o control. * A menos que sea archivado para consulta posterior /S13/OR/CE 2

3 5. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los pocillos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces. b. Deje el Peine en la fila A por 60 minutos. Programe el reloj. Hacia el final de los 60 minutos, perfore el papel aluminio en la fila B usando el perforador. No abra más pocillos de los necesarios. c. Al cumplirse los 60 minutos, saque el Peine de la fila A. Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente. Reacción Antígeno Anticuerpo (Fila B) 6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila B. Mezcle como en el paso 5a. Programe el reloj para 2 minutos. Perfore el papel aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido como en el paso 5c. Unión del Conjugado (Fila C) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle. Programe el reloj para 20 minutos. Perfore el papel aluminio de la fila D. Después de 20 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Primer Lavado (FIla D) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Agite: retire e inserte vigorosamente el Peine en los pocillos por al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces agitando en el trascurso de 2 minutos: mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila E. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Segundo Lavado (Fila E) 9. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente durante dos minutos, como en el paso 8. Mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. Reacción de Color (Fila F) 10. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Programe el reloj para 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el Peine. Detención de la Reacción (Fila E) 11. Inserte el Peine de nuevo en la fila E. Después de 1 minuto, retire el Peine y deje secar al aire. Almacenamiento de las Partes No Usadas del Kit Bandeja de Desarrollo Si no usó todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo, puede almacenarla para ser utilizada posteriormente: Selle los pocillos usados con una cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la Bandeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Kit Vuelva a colocar la(s) Bandeja(s) de Desarrollo, Peine(s), perforador, diluyente de la muestra, controles, diluyente de la muestra e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperatura de 2 a 8 C. Resultados de la Prueba Validación A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5): 1. El debe producir dos puntos en el diente del Peine. 2. El Negativo debe producir un punto superior ( Interno). El punto inferior debe no aparecer o aparecer ténuemente, sin afectar la interpretación de los resultados. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior ( Interno). Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados no son válidos y las muestras y controles deben ser reexaminados. Interpretación Cualitativa de los Resultados Interpretación Visual Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de la muestra con la del punto inferior del diente del. (Figura 6). Un punto con una intensidad mayor que o igual a la del indica un resultado positivo. Un punto con una intensidad levemente menor que la del debe ser considerado como un resultado indeterminado, y una segunda muestra debe ser examinada una semana después. La ausencia del punto o su presencia con menor intensidad indica un resultado negativo. Resultado Negativo Figura 6. Resultados de la Prueba Muestra Resultados s Documentación de los Resultados Debido a que el color que aparece en el Peine es estable, los Peines pueden ser archivados para consulta posterior. Limitaciones Al igual que otras pruebas ideadas para ser usadas como diagnósticos in vitro, los resultados de esta prueba deben ser evaluados en relación a todos los síntomas, historia clínica y otras pruebas de laboratorio del paciente. Características del Ensayo* El desempeño de el kit ImmunoComb II HBc IgM ha sido evaluado sobre un total de 776 muestras. Los resultados son resumidos en la Tabla 1. Tabla 1. Resultados de la Prueba Prueba de Referencia ImmunoComb II HBc IgM Negativo 75 0 Negativo Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los siguientes reultados: Sensibilidad 100 % Especificidad 99.5 % Repetibilidad Diez peines escogidos al azar de diferentes partes de un lote de producción. Un suero positivo fue probado 12 veces en estos 10 peines. Todas las veces el suero positivo fue detectado. Reproducibilidad Tres muestras positivas para HBc IgM fueron analizadas en peines tomados de tres diferentes lotes de producción. En todos los casos, todas las muestras positivas fueron detectadas. Reacción cruzada No se encontró reacción cruzada con muestras positivas para hepatitis tales como Antígeno de Superficie del virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, HIV-1, HIV-2, HBc IgG, HAV, Rubéola, Toxo, HTLV, CMV y para enfermedades autoinmunes tales como Factor Reumatoideo. Interferencia No se observó interferencia con muestras hemolisadas (hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipémicas (Colesterol hasta mg/dl; Triglicéridos hasta mg/dl) y bilirrubina alta (hasta 20 mg/dl). Negativo Figura 5. Validación de la Prueba Resultados Inválidos * Datos detallados disponibles /S13/OR/CE 3

4 Bibliografía Cohen BJ The IgM antibody response to core antigen of hepatitis B virus. J Med Vir 3: Follett EAC Diagnosis of hepatitis B infection. In: Hugh Y, McMillan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. Marcel Dekker, New York. pp Herrera JL Serological diagnosis of viral hepatitis. S Med J 87: Hollinger FB Hepatitis B virus. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds. Raven Press, New York. pp Kiyasu PK, Caldwell SH Diagnosis and treatment of the major hepatotropic viruses. Am J Med Sci 306: Krugman S, Overby LR, Mushawar IK, Ling C-M, Frösner GG, Deinhart F Viral hepatitis, type B: studies on natural history and prevention re-examined. N Engl J Med 300: Lander JJ, Gitnick GL, Gled LH, Aach RD Anti-core screening of transfused blood. Vox Sang 34: Liang TJ, Jeffers LJ, Reddy KR, et al Viral pathogenisis of hepathocellular carcinoma in the United States. Hepatology 18: Robinson WS Hepadnaviridae and their replication. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds. Raven Press, New York. pp Swenson PD Hepatitis viruses. In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp Leyenda de los símbolos CARD PLATE CONTROL + CONTROL - PERFORATOR ImmunoComb tarjeta Bandejas de Desarrollo positivo negativo Perforador Consulte las instrucciones de uso Atención,ver instrucciones de uso IVD Producto sanitario para diagnóstico in vitro Limite de temperatura Σ n Contenido suficiente para n ensayos Fabricante REF DIL LOT Representante autorizado en la Comunidad Europea Número de catálogo Diluyente de la muestra Código de lote Fecha de caducidad Número de serie Version: /S13/OR/CE (04/2008) /S13/OR/CE 4

5 Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba Preincubación de la Bandeja de Desarrollo: 3 hrs. a temperatura ambiente, o 20 minutos a 37ºC Tomar y prediluir muestras y controles Agregar muestras y controles prediluídos a la fila A. Mezclar Sacar el Peine del empaque Insertar el Peine y mezclar en la fila A. Incubar Perforación de la fila B Absorber líquido adherido a los dientes Insertar el Peine y agitar en la fila B. Incubar Luego de mezclar/agitar y incubar en las filas C,D y E Resumen del Procedimiento de la Prueba Reacción de color en la fila F Resultados Las instrucciones abreviadas abajo son para los usuarios experimentados en el uso del kit ImmunoComb II HBc IgM. (para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo) 1. Dejar que todos los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente y realizar la prueba a temperatura ambiente. 2. Prediluir 10 µl de cada muestra y control con 490 µl de diluyente de la muestra. 3. Verter 25 µl de cada muestra y control prediluídos en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo y mezclar. 4. Insertar el Peine en la fila A y continuar como se describe en la Tabla 1: Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba Paso Fila Proceda como sigue 1 Captura de anticuerpos A Mezcle; incube 60 minutos; absorba. Reacción antígeno-anticuerpo B Mezcle; incube 2 minutos; absorba. Unión del conjugado C Mezcle; incube 20 minutos; absorba. Lavado D Agite; incube 2 minutos; absorba. Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba. Reacción de color F Mezcle; incube 10 minutos. Detención de la reacción E Incube 1 minuto; seque al aire. 2 Manera de romper el Peine /S13/OR/CE 5