puede confirmarse rápidamente en una sola prueba simple.
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- Gerardo Toro Herrero
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1 puede confirmarse rápidamente en una sola prueba simple. Código: Formato: 3 x 6 Versión de las pruebas: 434/E7 El equipo InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es una prueba de confirmación. La prueba permite confirmar un VIH reactivo inicial en suero o plasma humano. Pueden realizarse dieciocho pruebas con un equipo. Introducción El Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente del etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirido (SIDA). Se han distinguido dos tipos, VIH-1 y VIH-2, exhibiendo diferente prognosis y tasa de transmisión. Las rutas mayores de transmisión de VIH son el contacto sexual, la contaminación por sangre o los productos de sangre, y madre-a-recién nacido. El VIH infecta predominantemente los linfocitos CD4 los cuales juegan un papel importante en el sistema inmunológico humano. La disminución progresiva del nivel de CD4 durante el desarrollo de la enfermedad genera una condición de inmunosuprimido, facilitando las infecciones oportunistas con consecuencias fatales. El virus de VIH consiste en una molécula de ARN genómico asociada con una transcriptasa reversa, protegida por una capsula y una envoltura. La envoltura del virus es el blanco mayor para la respuesta humoral de anticuerpos. Por consiguiente, las pruebas de VIH iniciales son altamente sensibles basadas en la detección de anticuerpos contra los antígenos derivados de los componentes de la envoltura (env). Para distinguir las reacciones falsas, un resultado positivo por una prueba HIV pantalla debe ser los reanalizado y confirmado por una prueba de alta especificidad. La confirmación de serologica de una infección de VIH, se realiza con el ensayo Western blot, es basado en la detección diferencial de anticuerpos dirigió contra los antígenos de VIH. El ImmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm emplea cinco antígenos contra HIV recombinantes y sintéticos para la determinación serologica rápida para la determinación de anticuerpos contra VIH. Dos antígenos son proteinas derivadas de pol y gag reactivas con ambos tipos de VIH, tres antígenos son péptidos o proteinas derivadas de env, específicas para VIH - 1 o VIH-2. Los antígenos se posicionan separadamente a concentraciones fijas y libre de antígenos tisulares tejido que comunmuente pueden contaminar las preparaciones de antígenos de lisado viral normalmente usado en el Western blot. Los resultados obtenidos por la prueba ImmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es comparable a los obtenidos por el Western blot. En lugar de ejecutar dos corridas de blot, la reactividad para los anticuerpos VIH tipo 1 o 2 Principio del test La prueba ImmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es un ensayo inmunoenzimático indirecto (EIA). La fase sólida es un peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada peine tiene 6 pares de dientes, con seis puntos de antígeno por par (3 puntos en cada diente). El diente izquierdo de cada par lleva un punto superior sensibilizó con inmunoglobulina human (Control Interno), y dos proteínas p24 (gag) y p31 (pol). El diente derecho tienen tres proteínas derivadas de env gp41, gp120 y gp36. La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F), cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, moviendo el peine de una fila a otra, con un periodo de incubación en cada paso. Para comenzar la prueba, se agrega suero o al diluyente en los pozos de la fila A de la Bandeja de desarrollo. El peine se inserta entonces en los pozos de fila A. Los anticuerpos de Anti-VIH, en caso de estar presentes en las muestras, se unirán específicamente a los antígenos de VIH en los dientes del peine (Figura 1). Los componentes no unidos son eliminados con el lavado en la fila B. En la fila C, el IgG capturado en los dientes y la inmunoglobulina humano en el punto superior (Control Interno), reaccionará con anticuerpos de IgG anti-humanos marcados con fosfatasa alcalina (AP). En las próximas dos filas, los componentes no unidos son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reacciona con componentes cromogénicos. Los resultados son visible como las manchas gris-azules en la superficie de los dientes del Peine. Figure 1. El principio de la Prueba El equipo incluye un Control Positivo (que contiene anticuerpos a VIH-1 y VIH-2) y un Control Negativo que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de ésta, el diente usado con el Control Positivo debe mostrar todas las 6 manchas grisazules y el diente usado con el Control Negativo debe mostrar la mancha del Control interno solamente. Este punto también debe aparecer en los demás dientes para confirmar que la muestra fue agregada, que el kit fucniona apropiadamente y que la prueba fue realizada correctamente. Contenido del Kit Los peines El equipo contiene 3 Peines plásticos. Cada Peine tiene 6 pares de dientes, un par para cada prueba (Figura 2). Ambos dientes de un par llevan los números idénticos. Cada par de dientes se sensibiliza con seis áreas reactivo:
2 Posición Diente izquierdo Diente derecho Superior Inmunoglobulina Recombinante de humana (control interno) env-hiv 1 derivada de la glicoproteina gp120 Medio Proteina Péptido sintético Bajo recombinante p24 derivada de gag del core (reconoce anticuerpos para HIV-1 y HIV-2) Recombinante derivad de la proteina pol p31 (reconoce anticuerpos para HIV-1 y HIV-2 de la transmembrana env de HIV-1 derivada de la glicoproteina gp41 Péptido sintético de la transmembran de env HIV-2 derivada de la glicoproteína gp36 Los Peines se proporcionan en bolsas de aluminio que contienen una bolsa de desecante. Bandejas de Desarrollo El equipo contiene 3 Bandejas de Desarrollo, cubiertos por una la lámina de aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesitados para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consiste en 6 filas (A-F). La fila está dividida en 6 pozos, las otras filas están divididas en 12 pozos cada uno. El contenido de cada fila es como sigue: Fila A Diluyente de la muestra Seguridad y Precauciones Este kit debe ser usado para diagnósticos in vitro solamente Maneje el control positivo como si fuera potencialmente infeccioso, aunque haya sido inactivado Todos los otros materiales de origen humano usados en la preparación de los controles pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos al antígeno de superficie de la hepatitis B, asi como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C. Ya que ningún método de prueba puede garantizar por completo la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas Use guantes quirúrgicos y ropas de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano No use la pipeta aspirando con la boca Deseche todas las muestras, peines usados *, bandejas de desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos biocontaminantes No mezcle reactivos de lotes diferentes No use este kit después de la fecha de caducidad Almacenamiento del Kit Guarde el equipo en su caja original a las 2.8 C. Bajo estas condiciones, el equipo debe permanecer estable hasta la fecha de vencimiento en la etiqueta. No congele el equipo. Manejo de las Muestras Es posible usar suero o plasma en la prueba. Éstas deben ser totalmente separadas de los glóbulos rojos por lo menos con un paso de centrifugación. Fila B Solución de lavado Pueden guardarse muestras durante 72 horas a 2 a 8 C Fila C Anticuerpo de cabra anti-igg humano antes dela prueba. Para guardar por más de 72 horas, maracado con fosfatasa alcalina las muestras deben ser congeladas a -20 C o más frío. Fila D Solución de lavado Después de descongelar los sueros, centrifuguelos. Use Fila E Solución de lavado el sobrenadante. Evite repetidos congelados y Fila Solución de sustrato cromogénico conteniendo descongelados. 5-bromo-4-cloro - 3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) Procedimiento de la Prueba Equipo necesario Pipetas de precisión con puntas desechable y capacidad de 50 ul Tijeras Cronómetro de laboratorio o reloj Preparando la Prueba Ponga todos los componentes, las bandejas de desarrollo, los peines, los reactivos y los sueros a temperatura ambiente y realice la prueba la temperatura ambiente (22-26 C). Preparación de la Bandeja de Desarrollo 1. Incube la Bandeja de desarrollo en una incubadora a las 37 C durante 30 minutos; o deje a temperatura ambiente (22-26 C) Control positivo frasco (tapa roja) de 0,4 ml de plasma humano diluido positivo para anticuerpos anti- VIH-1 y anti-vih-2, inactivado por la adición de b- durante 3 horas. propiolactona y calor. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel Control negativo frasco (tapa verde) de 0.4 ml de plasma humano diluido inactivado con calor, negativo para los anticuerpos a VIH. Perforador---- para perforar el papel de aluminio que cubre los pocillos de la Bandeja de Desarrollo absorbente para ser desechado como desecho biocontaminante al final de la prueba. * A menos que sea archivado para consulta posterior
3 Mezcle los reactivos agitando la Bandeja de desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de desarrollo; rompa la cubierta usando la punta de la pipeta o el perforador, sólo cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen Preparación del peine Precaución: para asegurar funcionando apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Rasgue la cubierta de aluminio del Peine al borde perforado. Retire el Peine. 2. Es posible usar el Peine entero y la bandeja de desarrollo o sólo una parte. Para usar parte de un Peine: a. Determinar cuántos pares de dientes se necesita para analizar las muestras y controles. Se necesita un par para cada prueba. Cada par de dientes tiene el código número" 34" del equipo, para facilitar la identificación de dientes aislados. b. Doble y rompa el Peine verticalmente o cortelo con los tijeras (vea Figure 4) para separar el número requerido de pares de los dientes (Número de muestras que incluyen 2 controles). No separe los dientes apareados. c. Devuelva la porción sin usar del Peine a la bolsa de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre la bolsa herméticamente, por ejemplo con un clip, para mantenelo seco. Guarde el Peine en la caja del equipo original a 2-8 C para usarlo más tarde. Figure 4. Rompiendo el Peine Instrucciones de la Prueba Reacción de Antigeno-Anticuerpo (Fila A de la Bandeja de desarrollo) 1. Tome 50 µl de muestra con la pipeta. Perfore bien la cubierta de aluminio de la fila A de la Bandeja de desarrollo con la punta de la pipeta o con el perforador y vierta la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución de la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. 2. Repita paso 1 para los otros sueros, incluyendo uno para el control Positivo y el control Negativo proporcionado por el equipo. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta de cambio para cada muestra o control. 3. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia usted) en los pozos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pozos varios veces. b. Deje el Peine en la fila A durante exactamente 30 minutos. Ponga el cronómetro. Cerca del fin de 30 minutos, perfore la lamina de la fila B usando el perforador. No abra más pozos de los que necesite. c. Al final de 30 minutos, saque el Peine de fila A. Absorba el líquido adherido de las puntas de los dientes apoyandolos al papel absorbente limpio. No toque l a superficie delantera de los dientes. Primer Lavado (Fila B) 4. Inserte el Peine en los pozos de la fila B. Agite: Vigorosamente retire e inserte el Peine en los pozos durante por lo menos 10 segundos para lograr el lavado apropiado. Repita la agitación varios veces durante el curso de 2 minutos; entretanto perfore la lamina de fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido como en el paso 3c. Unión del Conjugado (Fila C) 5. Inserte el Peine en los pozos de fila C. Mezcle como en paso 3a. Ponga el cronómetro durante 20 minutos. Perfore la lamina de la fila D. Después de 20 minutos, retire el peine y absorba el líquido. Segundo Lavado (lfila D) 6. Inserte el Peine en los pozos de fila que D. Agite durante 2 minutos, como en paso 4. Entretanto perfore la lamina de fila E. Después de las 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido. Tercer Lavado (Fila E) 7. Inserte el Peine en los pozos de fila que E. Agite durante 2 minutos. Entretanto perfore la lamina de fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorbe el líquido. Reacción de color (Fila F) 8. Inserte el Peine en los pozos de la fila F. Coloque el cronómetro por 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el Peine. Detención de la Reacción (Fila E) 9. Inserte el Peine de nuevo en la fila E. Después de 1 minuto, retire el Peine y permita secar al aire. Eliminación de los desechos Deseche las Bandejas de desarrollo usados, las pipeta, el papel absorbente y guantes como desechos biocontaminantes. Almacenamiento de Partes No usadas del Kit Bandeja de Desrrollo Si no uso todos los pozos de la bandeja de desarrollo, usted puede guárdelo para el uso futuro: Selle los pocillos usados con cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la Bandeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Equipo Vuelva a colocar la(s) Bandeja(s) de Desarrollo(s), Peine(s), perforador, controles e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperatura de 2 a 8 C. Resultados de la Prueba Validación Para confirmar que la prueba funciona propiamente y demostrar que los resultados son válidos, lo siguiente tres condiciones deben cumplirse (vea Figura 5): 1. El Control Positivo debe producir seis puntos coloreados gris-azules en el par de dientes del Peine. 2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control interno) en el diente izquierdo del par y ninguna otra punto.
4 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior Control Interno) en el diente izquierdo del par. Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados no son válidos y las muestras y los controles deben ser reexaminados. Todavía, la reactividad para los anticuerpos a VIH- 1/HIV-2 no debe ser considerado como un solo criterio para el diagnóstico de Síndrome de Inmundeficiencia Adquirida (SIDA) o de infección con VIH. La producción de anticuerpos contra HIV puede retardarse luego de la exposición inicial siguiente o suprimirse debido a la condición del inmunocomprometido del paciente, un resultado negativo con esta prueba no debe ser considerado evidencia conclusiva a que el paciente no se ha expuesto o infectado por VIH. Figura 5. Validación de la Prueba Interpretación de los resultados La sola apariencia del Control Interior indica que la muestra correspondiente es negativo para los anticuerpos a VIH-1 o VIH-2. Una muestra con un único circulo aislado, coloreando un punto de antígeno de HIV, o el punto p24 y el p31 sin un punto en el diente derecho, es considerado indeterminado. Una muestra con mínimo dos antígeno de VIH, con puntos incluyendo un gp41 representando o gp36 (vea Figura 2), es definido como VIH-positivo. En estos casos la diferenciación entre VIH-1 y VIH-2 puede obtenerse como sigue: Ausencia del punto gp36 y presencia de gp41 y/o gp120 indica que el espécimen es positivo para anticuerpos HIV-1. Presencia del punto gp36 indica que el espécimen es positivo para los anticuerpos a VIH-2. Los patrones más relevantes de puntos y su interpretación son resumidos en la Tabla 1. Tabla 1. Interpretación de los Resultado Patrón de puntos de HIV Interpretación presentes en Diente Diente Positivo para Izquierdo Derecho P24 y/o p31 Gp41 Ningún punto Gp41 y gp120 HIV-1 P24 y/o p31 Gp36 solamente o HIV-2 con gp41 P24 y/o p31 Gp36 y gp41 y gp120 HIV-2 solamente o coinfección con HIV-1 P24 y/o p31 Ningún punto o gp 120 Ningún punto Gp41 o gp 120 Indeterminado y/o gp36 Ningún punto Ningún punto Negativo Importante: Algún punto débilmente coloreado en un diente debe ser interpretado como reactivo En caso de un resultado indeterminado, recolectar nueva muestra y repetir el test Documentación de Resultados Cuando el color en el Peine es estable, los Peines pueden ser guardados para la documentación. Limitaciones El ImmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es un ensaye suplementario apuntado a confirmar la presencia de anticuerpos a los antígenos de VIH en los sueros inicialmente reactivos. En la ausencia de un criterio aceptado uniformemente para la interpretación de anticuerpo de VIH perfila, la interpretación descrita arriba debe ser considerada como una recomendación. Eficacia de la Prueba * A. Estudio de Multicentro Un estudio del multicentro se llevó a cabo con 559 muestras que incluyen 154 individuos VIH-negativos, 318 VIH-1 pacientes positivos, 35 pacientes positivo por ELISA e indeterminado (Ind.) para VIH-1 por Western Blotl (WB), así como 52 individuos que eran positivos por ELISA y negativo por WB. La población negativa incluyó mujeres embarazadas, personas con enfermedades autoimmune y con hepatitis. Se detallan los resultados en tabla 2. Tabla 2. Estudio en Multicentro a a Resultado Preliminar. b Incluyendo seis WB que sólo despliegan p17 o p55. Las características fueron calculadas, incluyendo sólo los resultados negativos inequivocos y los positivos: Sensibilidad 99.7% Especificidad 100% B. Muestras de Pacientes de Origen Un estudio se llevó a cabo con muestras de individuos de origen africano. La población consistió en 48 individuos VIH-negativos, 51 pacientes infectado con VIH-1, 84 infectados con VIH-2, y 9 coinfectados con ambos VIH-1 y VIH-2. Se detallan los resultados en tabla 3. Tabla 3. Muestras de Origen Africano a Por ELISA y WB b Reactive con el gp36 sólo Los datos, excluyeron los resultados indeterminados, muestrando 100% sensibilidad y especificidad para VIH. Todos los suero positivo VIH-1, incluyendo 5 con el subtipo O, se identificaron correctamente. Entre el VIH-2 positivo 10 sueros mostraron reactyividad cruzada * Datos detallados disponibles
5 contra el gp120, resultando la especificidad del diferencial global de 93.8% Bibliografia Centers for Disease Control Interpretation and use of the Western Blot assay for serodiagnosis of Human Immunodeficiency Virus type 1 infections. MMWR 38 (S-7): 1-4. Dax EM HIV testing and staging, disease progression, and markers. Curr Opinion Infect Dis 6: Groopman JE, Chen FW, Hope JA, Andrews, JM, Swift RL, Benton CV, Sulllivan JL, Volberding PA, Sites DP, Landesman S, Gold J, Baker L, Craven D, Boohes FE Serological characterization of HTLV- III infection in AIDS and related disorders. J Infect Dis 153: Higgins JR, Pederson NC, Carlson JR Detection and differentiation by sandwich enzyme-linked immunosorbent test for human T-cell lymphotropic virus III, lymphadenopathy-associated virus LAV) and acquired immunodeficiency syndrome-associated retroviruslike clinical isolates. J Clin Microbiol 24: Jackson JB, Balfour HH Practical diagnostic testing for human immunodeficiency virus, Clin Microbiol Rev 1: Lacroix M, Penney CL, Dwyer RJ, Stern MD, Bellini F, Dionne G, Tsoukas C A peptide-based microtiter ELISA kit for the detection of antibodies to HIV-1 and to HIV-2, Fifth International Conference on AIDS. Montréal. W.B.P.111. Gnann Jr,JW, McGormick JB, Mitchell S,Nelson JA, Oldstone Synthetic peptide immunoassay distinguishes HIV type 1 and type 2 infections. Science 237: Myers RA, Patel JD, Joseph JM Identifying HIV- 2-seropositive individuals by reevaluating HIV-1 indeterminate sera. J Acquir Immunedef Syndr 5: Sarngadharan MG, Veronese F, Lee S, Gallo RC Immunological properties of HTLV-III antigens recognized by sera of patients with AIDS and AIDSrelated complex and of asymptomatic carriers of HTLV-III infection. Cancer Res 45:4574s-4577s.
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