REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO TESTICULAR Y SU POSIBLE RELACIÓN CON APOPTOSIS DE CÉLULAS GERMINALES MASCULINAS

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1 UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO TESTICULAR Y SU POSIBLE RELACIÓN CON APOPTOSIS DE CÉLULAS GERMINALES MASCULINAS TESIS DOCTORAL FRANZ DOMINIK VILLARROEL ESPÍNDOLA V ALDIVIA- CHILE 2012 RECIBIDO Programa formación Capital Humano Avanzado 11 O IC 2012 }~.P~.... Ingreso N : Destino:....

2 REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO TESTICULAR Y SU POSIBLE RELACIÓN CON APOPTOSIS DE CÉLULAS GERMINALES MASCULINAS Tesis presentada a la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias por FRANZ DOMINIK VILLARROEL ESPÍNDOLA Valdivia - Chile 2012 RECIBIDO Programa Form~d'ÓI'\ t~p\\a\ Humano Avanzado 11 o te 2012 ~ngreso N : ~...,.~.. - Destino:....

3 UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS INFORME DE APROBACIÓN DE TESIS DE DOCTORADO La Comisión Evaluadora de Tesis comunica a la Dra. Ana María Zarraga 0., Director de la Escuela de Graduados de la Facultad de Ciencias que la tesis de doctorado presentada por el candidato FRANZ DOMINIK VILLARROEL ESPÍNDOLA Ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el día 20 de Agosto del 2012, como requisito para optar al grado de Doctor en Ciencias. Y, para que así conste para todos los efectos firman: Profesor Patrocinante de Tesis: Dra. Ilona I. Concha G. Comisión Evaluadora de Tesis: Dr. Marcelo Ratto F. Dr. Juan Carlos Slebe T. Dr. Rodolfo Amthauer M.

4 PUBLICACIONES Y RECONOCIMIENTOS Villarroel-Espíndola, Franz; Mancilla, Héctor; vander Stelt, Karen, Maldonado, Rodrigo; Acuña, Aníbal; Covarrubias, Alejandra; López, Camila; Angulo, Constanza.; Castro, Maite A.; Slebe, Juan Carlos; Durán, Jordi; García-Rocha, Mar; Guinovart, Joan J. and Concha, Ilona I. Muscle glycogen synthase isoform is responsible for testicular glycogen synthesis: glycogen overproduction induces apoptosis in male germ cells. En correcciones para ser enviada a Joumal of Cellular Biochemistry. Adjudica el Premio Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo año Adjudica beca MECESUP UC00606 para realizar pasantía en el extranjero. Laboratorio Dr. Rodríguez-Gil, Universidad Autónoma de Barcelona, España (2011). Adjudica beca MECESUP AUS0704 para realizar pasantía en el extranjero. Laboratorio de Dr. Joan Guinovart, en IRB de Barcelona, España (2010). Adjudica en 2010, beca CONICYT para Financiamiento de Tesis Doctoral (AT ) Adjudica el Premio a la mejor presentación (módulo Ciencias de la Vida), 1er Congreso de Estudiantes de Postgrado Universidad Austral de Chile, Valdivia (2009).

5 PRESENTACIONES A CONGRESO Simposios: 2010 XXI Reunión Anual Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo. Relator Invitado en Simposio: Metabólica de células germinales masculinas. 1-4 de septiembre, La Serena, Chile. Glucógeno testicular: regulación y síntesis. Villarroel, F., Maldonado, R., Durán, J., García, M., Angulo, C., Castro, MA., Guinovart, JJ., Slebe, JC., Concha, II. Instituto de Bioquímica, Universidad Austral de Chile; Instituto de Investigación en Biomedicina (IRB) de Barcelona, España. Ponencias orales: 2011 XXII Reunión Anual Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo. 31 Agosto al 3 Septiembre, Viña del Mar, Chile. La sobreproducción de glucógeno testicular induce degeneración del túbulo seminífero y apoptosis de células germinales masculinas. Villarroel-Espíndola, F., Acuña, A., Corro, N., Maldonado, R., Durán, J., García-Rocha, M., Angulo, C., Castro, MA., Slebe, JC., Guinovart, JJ., Concha, II. Instituto de Bioquímica, Universidad Austral de Chile; Instituto de Investigación en Biomedicina (IRB) de Barcelona, España XXXIII Reunión Anual Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile. 28 de Septiembre al 1 de Octubre, Termas de Chillán, Chillán, Chile. Regulación y síntesis del glucógeno testicular, y su posible participación en degeneración del túbulo seminífero en ratones Knock-in de glucógeno sintasa muscular (MGS). Villarroel, F., Maldonado, R., Mancilla, H., Durán, J., García, M., Angulo, C., Castro, M., Guinovart, J., Slebe, J., Concha, II. Instituto de Bioquímica e Instituto de Química, Universidad Austral de Chile, Instituto de Investigación en Biomedicina (IRB), Barcelona, España.

6 2009 XX Reunión Anual Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo. 2-4 de septiembre, La Serena, Chile. Regulación del metabolismo del glucógeno testicular: Expresión de malina y laforina. Villarroel, F., Mancilla, H., Maldonado, R., Angula, C., Castro, M.A., Slebe, J.C., Concha, I.I. Instituto de Bioquímica, Universidad Austral de Chile. Ponencias en panel: nd IUBMB & 37th FEBS CONGRESS "From Single Molecules to Systems Biology", September 4-9, Sevilla, España. Is glycogen overproduction a degenerative signa! in the seminiferous tubule? Villarroel-Espíndola, F., Mancilla, H., Maldonado, R., Acuña, AL, Durán, J., García-Rocha, M., Castro, MA, Angula, C., Slebe, JC., Guinovart, JJ., and Concha, II. Instituto de Bioquímica, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile; Insituto de Investigación en Biomedicina (IRB) de Barcelona, España XXXIV Reunión Anual Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile septiembre, Valdivia, Chile. Relationship between phosphorylated state of muscle glycogen synthase (MGS) and GSK3~, and hexoses availability in the seminal plasma. Villarroei-Espíndola, F., Slebe, JC., Rodríguez-Gil, JE., Concha, IL Instituto de Bioquímica y Microbiología, Universidad Austral de Chile; Unitat de Reproducció Animal, Universitat Autónoma de Barcelona, España. 36th FEBS CONGRESS "Biochemistry for Tomorrow's Medicine". June 25-30, Torino, Italy. Expression and regulation of muscle glycogen synthase in testis: disruption of seminiferous tubules by glycogen overproduction. F. Villarroei Espíndola, H. Mancilla, R. Maldonado, AL Acuña, C. Torres, J. Durán, M. García Rocha, C. Angula, MA. Castro, JC. Slebe, JJ. Guinovart, II. Concha. Instituto de

7 Bioquímica, Universidad Austral de Chile; Instituto de Investigación en Biomedicina (IRB) de Barcelona, España XXXII Reunión Anual Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile. 22 al25 de Septiembre, Termas de Chillán, Chillán, Chile. Regulación del metabolismo de glucógeno testicular. Villarroel, F., Mancilla, H., Maldonado, R., Angulo, C., Castro, M.A., Slebe, J.C., Concha, I.I. Instituto de Bioquímica, Universidad Austral de Chile. iv

8 FINANCIAMIENTO Proyectos FONDECYT (I.I.C.) y (J.C.S) Proyecto DID-UACh S Austral de Chile) (Dirección de Investigación y Desarrollo, Universidad Dirección de Estudios Postgrados and Escuela de Graduados, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile; Beca CONICYT para estudios de Postgrado (F.V.E) Beca financiamiento tesis doctoral CONICYT AT (F.V.E.) Becas movilidad al extranjero MECESUP UC00606 y AUS0704 (F.V.E). V

9 AGRADECIMIENTOS Quisiera agradecer profundamente el apoyo de la Dra. Ilona Concha, quien me recibió en su laboratorio y me brindó su apoyo, múltiples conversaciones, y la oportunidad de concretar parte de mis sueños. Muchas gracias por sus consejos y sus palabras de aliento en los momentos de flaqueza y desorientación. De igual manera, quisiera agradecer al Dr. Juan Carlos Slebe (UACh), Dra. Maite Castro (UACh); Dr. Joan J. Guinovart (IRB, Barcelona); Dra. Mar García-Rocha (IRB, Barcelona); Dr. Joan-Enric Rodrígez-Gil (UAB, Barcelona) y Ester Guerra (Barcelona), la ayuda incondicional durante el desarrollo de esta tesis, las constantes charlas y lecciones; todas ellas han contribuido en mi crecimiento y formación. Quiero darles las gracias a todos los amigos, compañeros y colegas del laboratorio de Metabolismo Molecular y de Enzimología Molecular, que aportaron con sus sonrisas, conversaciones, historias y experiencias durante el grato desarrollo de esta tesis. Agradecerles a Sandra C. (Sec. Ese. Graduados.), Viviana M. y Marlis C. (Sec. Inst. Bioquímica y Microbiología), Carolina Sánchez (Sec. Guinovart's lab), por su amistad y buena voluntad; sin ellas muchas cosas no habrían ocurrido. A Dios, mi familia y seres amados, a Alex, a mis amigos (Tatiana, Jeroen, Roxana y Claudia), y a mi ángel de la guarda, que sin ellos no sería nada y nada tendría sentido. Finalmente, agradecerle a todas las personas que ayudaron de una u otra manera a la realización de esta tesis: Inst. Bioquímica y Microbiología (UACh); Escuela de Graduados; DID-UACh; y Dirección de Postgrado UACh; FONDECYT; CONICYT y MECESUP. vi

10 ÍNDICE GENERAL Página PUBLICACIONES Y RECONOCIMIENTOS PRESENTACIONES A CONGRESOS FINANCIAMIENTO AGRADECIMIENTOS ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS RESUMEN ABSTRACT ABREVIATURAS V VI VII xii XV xvi xvii xviii l. INTRODUCCIÓN 1.1. Epitelio seminífero y esperrnatogénesis 1.2. Muerte de células germinales y apoptosis 1.3. Síntesis de glucógeno y regulación 1.4. Glucógeno extra-hepático y extra-muscular vii

11 Metabolismo del glucógeno y sistema nervioso central Metabolismo del glucógeno en el testículo 1.5. Apoptosis y glucógeno HIPÓTESIS 3. OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Materiales Reactivos generales Anticuerpos Biología molecular Material biológico Instrumentos y Equipos 4.2. Métodos Cultivo de líneas celulares Ensayo de viabilidad mediante azul de tripán Extracción de RNA total Reacción en cadena de la polimerasa acoplada viii

12 a transcripción reversa (RT-PCR) RT-PCR convencional RT-PCR en tiempo real Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Inmunocitoquímica Análisis histoquímico mediante tinción Ácido periódico y Reactivo de Schiff (PAS) Tricrómico de Massón Hematoxilina-eosina Determinación de actividad glucógeno sintasa Extracción y cuantificación de proteínas totales Separación electroforética de proteínas Transferencia de proteínas a membranas de PVDF Análisis de Western blot Determinación de glucógeno Ensayo de TUNEL Aislamiento de células germinales y células de Sertoli Análisis estadístico ix

13 Diseño experimental con modelos animales RESULTADOS 5.1. Regulación y Síntesis de glucógeno testicular Expresión y actividad de la isoforma muscular de glucógeno sintasa en testículos Expresión de mensajeros vinculados a la regulación de la síntesis y degradación del glucógeno testicular Síntesis de glucógeno en células germinales y somáticas del túbulo seminífero MGS es poliubiquitinada por un complejo malina-laforina en células de Sertoli (línea celular 42GPA9) 5.2. Funciones del glucógeno testicular La sobreproducción de glucógeno induce degeneración del túbulo seminífero y apoptosis de células germinales Glucógeno como una posible etiqueta de apoptosis durante espermatogénesis 90 X

14 6. DISCUSIÓN 6.1. Regulación y Síntesis de glucógeno testicular Expresión y actividad de la isoforma muscular de glucógeno sintasa en testículos Regulación de la síntesis y degradación del glucógeno testicular Síntesis de glucógeno en células germinales y somáticas del túbulo seminífero MGS es poliubiquitinada por un complejo malina-laforina en células de Sertoli (línea celular 42GP A9) 6.2. Funciones del glucógeno testicular La sobreproducción de glucógeno induce degeneración del túbulo seminífero y apoptosis de células germinales masculinas Glucógeno como una posible etiqueta de apoptosis durante espermatogénesis CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFÍA xi

15 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura l. Diagrama esquemático del túbulo seminífero y proceso de espermatogénesis en mamíferos. Figura 2. Vías de activación de la apoptosis. Figura 3. Esquema general de la síntesis y degradación de glucógeno. Figura 4. Regulación general de la enzima glucógeno sintasa Figura 5. Interacciones descritas entre laforina, malina y proteínas que metabolizan glucógeno. 16 Figura 6. Sólo la isoforma muscular de la enzima glucógeno sintasa (MGS) está presente en tejido testicular de ratón. Figura 7. MGS se expresa en tejido testicular de ratón. Figura 8. MGS es activa y responsable de la síntesis de glucógeno testicular Figura 9. Genes asociados al metabolismo del glucógeno se expresan diferencialmente durante el desarrollo testicular. Figura 10. Malina y laforina son expresadas en tejido testicular Figura 11. Malina y laforina son expresadas y sintetizadas en tejido testicular adulto. 54 xii

16 Figura 12. Células de Sertoli son la principal fuente de glucógeno del epitelio seminífero. 58 Figura 13. Malina y laforina forman un complejo activo y regulan la síntesis de glucógeno testicular mediante poli-ubiquitinación de MGS. 63 Figura 14. Mapa génico y caracterización del modelo transgénico Knock-out (KO) de Malina (Epm2b- 1 -). 65 Figure 15. Genes asociados al metabolismo del glucógeno testicular son sobre-expresados en el modelo transgénico Knock-out para malina. 66 Figura 16.- Actividad glucógeno sintasa y contenido de glucógeno testicuar no experimentan cambios en el modelo transgénico Knock-out para malina. 70 Figura 17. Presencia de estructuras tipo poliglucosanos en testículos de ratones Knock-out para malina. 72 Figura 18. Mapa génico y caracterización del modelo transgénico Knock-in (Kin) de MGS superactiva. 76 Figura 19. El modelo transgénico Knock-in para MGS experimenta una reducción en el tamaño tubular de los túbulos seminíferos. 77 Figura 20. La sobre-producción de glucógeno induce desorganización y degeneración de los túbulos seminíferos en el modelo Knock-in para MGS. 78 xiii

17 Figura 21. La sobreproducción de glucógeno intratubular induce apoptosis de células germinales masculinas en el modelo Knock-in para MGS. 82 Figura 22. La ausencia de MGS no altera el desarrollo normal de túbulo seminífero en un modelo transgénico Nestina específico (Cre-Nestina MGS- 1 -). 87 Figura 23. La mayor sintesis y acumulación de glucógeno constituye una señal pro-apoptótica para células germinales masculinas. 88 Figura 24. Células germinales masculinas en apoptosis fisiológicas son intensamente P AS positivas. 92 Figura 25. Glucógeno como una posible etiqueta de apoptosis fisiológica durante espermatogénesis. 93 Figura 26.- Esquema y Modelo general del posible rol del glucógeno testicular en el túbulo seminífero. 109 xiv

18 ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla N l. Genes asociados al metabolismo del glucógeno se expresan diferencialmente durante el desarrollo testicular. 50 Tabla N 2. El modelo transgénico Knock-in para MGS experimenta una reducción en el tamaño tubular de los túbulos seminíferos. 77 XV

19 RESUMEN El glucógeno es la principal fuente de glucosa para muchos procesos biológicos. Sin embargo, esta molécula podría tener otras funciones, incluso tener efectos negativos sobre la célula. La enzima limitante en la síntesis de glucógeno es la glucógeno sintasa (GS). Es codificada por dos genes, GYSI, expresada en músculo (isoforma muscular, MGS) y otros tejidos, y GYS2, expresada mayoritariamente en hígado (isoforma hepática, LGS). La expresión de GS y su actividad han sido ampliamente estudiadas en muchos tejidos. A la fecha, no está claro cuál es la isoforma de GS responsable de la síntesis de glucógeno testicular y el rol de este polímero en el tejido reproductor masculino. Mediante RT -PCR, Western blot e inmuno:fluorescencia, hemos detectado la expresión de MGS, pero no LGS durante el desarrollo en testículos de ratón. Hemos evaluado también, la actividad de la enzima y el glucógeno almacenado a diferentes edades después del nacimiento, demostrando que la actividad GS y los niveles de glucógeno son altos durante los primeros días de desarrollo. Usando RT-PCR e inmunodetección, hemos demostrado también que malina y laforina son expresadas en testículos, enzimas claves para la regulación de la síntesis de glucógeno. Estas proteínas forman un complejo activo que regula a la MGS mediante poliubiquitinación en líneas celulares de células de Sertoli y de células germinales masculinas. Además, la sobreexpresión de PTG (protein targeting to glycogen) en células germinales desencadena apoptosis mediante activación de caspasa3, proponiendo un rol proapoptótico del glucógeno en testículo. Estos hallazgos sugieren que la actividad GS y la síntesis de glucógeno en testículos podría ser altamente regulada y la alteración de este proceso podría ser responsable de apoptosis y degeneración del túbulo seminífero y posible causa de infertilidad. GLUCÓGENO; GLUCÓGENO SINTASA MUSCULAR; ESPERMATOGÉNESIS; APOPTOSIS; MALINA-LAFORINA. xvi

20 ABSTRACT Glycogen is the main source of glucose for many biological events. However, this molecule may have other functions, including those that have deleterious effects on cells. The ratelimiting enzyme in glycogen synthesis is glycogen synthase (GS). It is encoded by two genes, GYSJ, expressed in muscle (muscle glycogen synthase, MGS) and other tissues, and GYS2, primarily expressed in liver (liver glycogen synthase, LGS). Expression of GS and its activity have been widely studied in many tissues. To date, it is not clear which GS isoform is responsible for glycogen synthesis and the role of glycogen in testis. Using RT PCR, Westem blot and immunofluorescence, we have detected expression ofmgs but not LGS in mice testis during development. We have also evaluated GS activity and glycogen storage at different days after birth and we show that both GS activity and levels of glycogen are higher during the first days of development. Using RT -PCR and immunoblotting, we have also shown that malin and laforin are expressed in testis, key enzymes for regulation of GS activity. These proteins forman active complex that regulates MGS by poly-ubiquitination in both Sertoli cell and male germ celllines. In addition, PTG (protein targeting to glycogen) overexpression in male germ cellline triggered apoptosis by caspase3 activation, proposing a proapoptotic role of glycogen in testis. These findings suggest that GS activity and glycogen synthesis in testis could be highly regulated and a disruption of this process may be responsible for the apoptosis and degeneration of seminiferous tubules and possible cause of infertility. xvii

21 ABREVIATURAS AKT: proteína quinasa B AMP: adenosine mono-fosfato AMPK: quinasa dependiente de AMP ATP: adenosine tri-fosfato CAMKII: proteína quinasa dependiente de calmodulina/ca + 2 DMSO: dimetil-sulfóxido EDTA: etanolamina tetra-acetato EGFP: proteína verde fluorescente (enhancer greenjluorescence protein) G6P: glucosa-6-fosfato Glc: glucosa GS: glucógeno sintasa GSK: glucógeno sintasa kinasa Kin: modelo transgénico suplementado (Knock-in model) KO: modelo transgénico carente (knock-out model) LGS/MGS: isoforma hepática o muscular de glucógeno sintasa NaF: fluoruro de sodio PKA: proteína quinasa A xviii

22 PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo poliub: poliubiquitinación/poliubiquitinada PTG: proteína dirigida a glucógeno (protein targeting to glycogen) SDS: dodecil-sulfato de sodio TdT: transferasa terminal de deoxinucleótidos (Terminal deoxynucleotidyl transferase) TEMED: N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina TRJS: tris-(hidroximetil)-aminometano TUNEL: marcaje terminal de ADN usando deoxi-uridina tri-fosfato (Terminal deoxynucleotidyl transferase dutp nick end labeling) UDP: uridina di-fosfato UDPG: Glucosa uridina di-fosfato WT: modelo Silvestre/control (wild-type model) xix

23 1 1.- INTRODUCCIÓN EPITELIO SEMINÍFERO Y ESPERMATOGÉNESIS El epitelio seminífero está constituido esencialmente por dos tipos celulares: un componente somático (células de Sertoli) y otro germinal masculino, dónde encontramos: espermatogonias, espermatocitos, espermátidas y espermatozoides (Figura 1 ). Las células de Sertoli son elementos somáticos del epitelio seminífero. Estas son grandes células triangulares con la base fijada en la membrana basal y el ápice extendido hacia el interior del túbulo mirando al lumen. El citoplasma de estas células, exhibe un elaborado sistema de finos procesos o prolongaciones citoplasmáticas que envuelven las células germinales, excepto a las células troncales primordiales (espermatogonias), las cuales están en estrecho contacto con la membrana basal [Austin & Short, 1972]. La completa función de las células de Sertoli en la espermatogénesis aún es incierta. Indudablemente estas células proveen un soporte mecánico para el desarrollo de las células germinales y juega un rol en la liberación del espermatozoide maduro desde el túbulo y la reabsorción de los "cuerpos residuales" durante la diferenciación de las espermátidas [De Kretser y col., 1971; Sharpe, 1983] y la eliminación de células en apoptosis [Nakanishi & Shiratsuchi, 2004]. Dependiendo de la especie en estudio, se han identificado diferentes clases de espermatogonias en el epitelio seminífero [Austin & Short, 1972]. Las espermatogonias del tipo A se dividen para formar células intermedias y espermatogonias del tipo B, y eventualmente estas últimas espermatozoides; mientras otras permanecen indiferenciadas para servir como células troncales para futuros ciclos de multiplicación y diferenciación

24 2 [De Kretser y col., 1971; Austin & Short, 1972; Amann, 2008]. La última división mitótica de las espermatogonias da origen a los espermatocitos, los cuales entran en división meiótica para originar células haploides o espermátidas. Estos espermatocitos primarios resultan de la división de las espermatogonias del tipo B. A medida que transcurre la meiosis, los espermatocitos primarios se mueven fuera de la membrana basal, hacia la parte central del túbulo seminífero, dando origen a los espermatocitos secundarios. Estos espermatocitos secundarios en la última división meiótica derivan en espermátidas, las cuales experimentan una compleja transformación, sin división celular, hacia espermatozoide; este proceso es también conocido como espermiogénesis, e incluye la aparición de estructuras específicas como el acrosoma y el flagelo. El espermatozoide formado a partir de las espermátidas no es funcionalmente maduro mientras permanece libre en el lumen del túbulo seminífero. Éste debe migrar hasta el epidídimo donde experimenta diferentes cambios estructurales y citoquímicos, tales como, modificación del perfil acrosomal, incremento en la condensación nuclear, eliminación de la "gota" citoplasmática, lo que en síntesis se conoce como "capacitación espermática" [De Kretser y col., 1971; Austin & Short, 1972; Setty & Jehan, 1977; Amann, 2008]. La espermatogénesis en ratas comienza en el cuarto día después del nacimiento, con la transformación de los gonocitos en espermatogonias del tipo A (células troncales). Estas células se dividen muchas veces, pasando por espermatogonias intermedias y del tipo B, y estas últimas dan origen a los espermatocitos primarios. Al día 15 post-nacimiento la primera generación de espermatocitos primarios entran en meiosis, mientras una segunda generación de células troncales inicia una segunda ronda de multiplicación y diferenciación [De Kretser y col., 1971; Austin & Short, 1972; Zhengwei y col., 1990]. Este evento es conocido como la "primera ola de espermatogénesis". Alrededor de los días después del nacimiento se producen los primeros espermatozoides. A partir de diferentes estudios realizados a edades tempranas del desarrollo, se ha podido inferir que los cambios cíclicos del epitelio seminífero y los tiempos de los diferentes pasos de la espermatogénesis son

25 3 similares a los observados en el adulto, y éstos están establecidos muy tempranamente antes que comience la espermatogénesis [ Austin & Short, 1972]. De hecho, en la rata inmadura, la duración del ciclo del epitelio seminífero es de alrededor de 11 días, como en el adulto (12 días), y el tiempo para la producción de los primeros espermatozoides desde las células troncales varía entre días, muy similar al adulto (48 días) [Austin & Short, 1972].

26 4 ~ 16\ Espaciointersticial.! -~'.: {)(.) \ ~ ~""-. y \J Ululoodeleydi ~~ \.._) ~@ _:;~~:~'"",;:'"~'""' -~ ~ Retlculo y\\ endoplasm4tlco \ (j}c:. -rp\ij \0 - Q_j,,,~ Espermatotonia B \ V ~ " - ~ ' ~~ " -~ooo'.- Ess':'Eu~ndp e:ocrrtm!to totronloa ~ Nu"cleacélulas. fr\o ~.,/~<~.~~ -~ "" ~,_ u ~ o. _~!!Yo ~ 'SJ _[~ -.~ 'Z_ e M1toco11dna o w ~ - 1 ~- ~~( o::~ Figura 1.- Diagrama esquemático del túbulo seminífero y proceso de espermatogénesis en mamíferos. El esquema muestra un corte transversal de testículo adulto y de un túbulo seminífero. Se destaca una sección del túbulo seminífero donde se observa el epitelio germinal masculino y las diferentes etapas de diferenciación durante espermatogénesis. Las células de Sertoli conforman la barrera hemato-testicular (BHT) y dividen el túbulo en dos compartimentos, basal y adluminal. Las células germinales primordiales y espermatocitos primarios constituyen parte del compartimento basal. Espermatocitos secundarios, espermátidas y espermatozoides se orientan hacia el compartimento adluminal del túbulo seminífero [Adaptada de Rato y col., (2012); Nat Rev Uro/9, ].

27 S MUERTE DE CÉLULAS GERMINALES EN TESTÍCULOS Y APOPTOSIS En diferentes puntos durante la división mitótica de las espermatogonias, algunas células degeneran, por lo que el número de espermatozoides eventualmente producidos es menor al esperado según el número de espermatogonias del tipo A al inicio de la espermatogénesis [Austin & Short, 1972, De Kretser y col., 1998; Kierszenbaum, 2001; Nakanishi & Shiratsuchi, 2004]. Por otro lado, la degeneración de células también ocurre durante la segunda división meiótica, por lo que el número de espermátidas producidas por cada espermatocito primario es inferior a cuatro. Las pérdidas en la producción de espermátidas alcanza entre un 27-37% [Austin & Short, 1972; Sinha-Hikin & Swerdloff, 1999; Print & Loveland, 2000; Blanco-Rodríguez, 2002]. Dependiendo de la especie, en los testículos adultos la espermatogénesis es un proceso relativamente ineficiente, resultando en la pérdida estimada del 25-75% del número potencial de espermatozoides maduros producidos [ Austin & Short, 1972]. La incapacidad para alcanzar los potenciales niveles de producción de espermatozoides que resulta de la sobre expresión temprana de células germinales, no depende sólo de la capacidad propia de las células de Sertoli por soportar la gametogénesis; es también resultado de la selección permanente de las células más idóneas, desencadenando que un gran número de células nunca alcancen el estado maduro. La apoptosis ha sido implicada en los testículos como un mecanismo esencial para remover las células germinales en desarrollo desde el epitelio seminífero [Sinha-Hikin & Swerdloff, 1999; Print & Loveland, 2000] y ha sido descrita en los testículos de todas las especies de mamíferos estudiadas [Austin & Short, 1972; Sinha Hikin & Swerdloff, 1999; Print & Loveland, 2000]. Esto sugiere que la función testicular normal para la producción de espermatozoides puede ser modulada por cambios en la habilidad de una célula germinal para proliferar sin morir, o bien, por la correcta sincronización de la muerte celular durante el desarrollo y la división exponencial de cada precursor.

28 6 La apoptosis corresponde al punto final de una cascada de eventos moleculares dependientes de energía iniciados por estímulos extra y/o intracelulares, los cuales juegan un papel muy importante en el mantenimiento de los tejidos y en el desarrollo embrionario, conservando un equilibrio entre el ritmo de proliferación y muerte celular [Zhang y col., 2004; Elmore, 2007; Degterev & Yuan, 2008]. El mecanismo de la apoptosis descansa en la activación de una cascada de enzimas cisteína-proteasas o caspasas, las cuales desmantelan la célula en forma rápida, controlada y silenciosa [Zhang y col., 2004; Elmore, 2007; Riedl & Salvesen, 2007; Degterev & Yuan, 2008]. Las caspasas se sintetizan como pro-enzimas o procaspasas, las cuales una vez activadas actúan sobre otra caspasa en una reacción secuencial en cadena. Se conocen en la actualidad 14 caspasas, de las cuales seis se relacionan con procesos inflamatorios; y las restantes, con apoptosis: estas últimas se dividen a su vez en caspasas iniciadoras (caspasas 8, 9 y 12) y caspasas ejecutoras (caspasas 2, 3 y 6) [Riedl & Shi, 2004; Zhang y col., 2004; Elmore, 2007]. La identificación de los factores específicos responsables para la iniciación de la cascada apoptótica, y el orden en el cual ellos ocurren depende fuertemente del tejido, tipo celular y estímulo medioambiental involucrado. Se ha sugerido la existencia de dos aparentes vías para el inicio de la apoptosis: extrínseca e intrínseca. Tempranamente, la vía intrínseca implica potencialmente, al iniciar la cascada de apoptosis, la exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática y la liberación de citocromo e desde las mitocondrias [Zhang y col., 2004; Elmore, 2007]. Por otra parte, el inicio de la cascada de transducción de señal apoptótica por factores extrínsecos (ligando Fas y TNF-alfa) comienza con la unión de los ligandos al receptor unido a la membrana celular. El complejo ligando/receptor está asociado con dominios de muerte específicos (secuencia intracelular de aproximadamente 80 residuos de aminoácidos, el cual es responsable de propagar la señal de apoptosis) y activa varias moléculas de procaspasas, las cuales se transforman en caspasas funcionales (Figura 2) [Zhang y col., 2004; Elmore, 2007].

29 7 En los testículos se ha propuesto que la alta tasa de apoptosis de las células germinales se debe a factores intrínsecos principalmente, antes que a factores extrínsecos. Se ha descrito que la liberación del ligando Fas es expresado por las células de Sertoli cuando ciertas células germinales, espermatocitos mayoritariamente, han perdido contacto con la matriz del túbulo seminífero [Oreen & Ferguson, 2001; Hipfner & Cohen, 2004; Riedl & Shi, 2004; Samejima & Eamshaw, 2005]. Este ligando Fas se une al receptor de Fas, el cual es expresado abundantemente sólo en células germinales, gatillando de este modo la muerte celular; sin embargo, diferentes autores se cuestionan por qué no mueren todas las células germinales cuando se libera el ligando Fas (ver detalles en Figura 2), sugiriendo que existen eventos intracelulares que determinan la susceptibilidad de ciertas células para entrar o no en apoptosis [Oreen & Ferguson, 2001; Hipfner & Cohen, 2004; Riedl & Shi, 2004; Samejima & Eamshaw, 2005]. Adicionalmente, se ha postulado que la muerte celular en testículos puede ser ejecutada mediante mecanismos dependientes e independientes de caspasa-2, activación caspasa-3, incluyendo activación de Bid y liberación de citocromo C [Oreen & Ferguson, 2001; Hipfner & Cohen, 2004; Samejima & Eamshaw, 2005]. No obstante, independiente del mecanismo que desencadena y ejecuta la muerte celular, aún permanece incierta la señal que induce la apoptosis de las células germinales en el epitelio seminífero. Diferentes vías moleculares dependientes de A TP existen para permitir el inicio o evadir la apoptosis. La muerte celular es probablemente un balance de moléculas pro-apoptóticas (bax, bad y bcl-xs) y anti-apoptóticas (bcl-2, bcl-xl y bcl-w), y las células pueden responder a cualquier vía, de acuerdo al estímulo apropiado. La activación de estas vías desde el interior de la célula permite que la membrana plasmática permanezca intacta y previniendo que antígenos intracelulares ingresen al espacio intersticial, lo cual podría gatillar la migración de leucocitos e iniciar una respuesta inmune que afecte al tejido completo en vez de a una célula única [Oreen & Ferguson, 2001; Hipfner & Cohen, 2004].