RESOLUCIÓN OIV-OENO USO DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN QUECHERS PARA LA DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS EN EL VINO

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1 RESOLUCIÓN OIV-OENO USO DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN QUECHERS PARA LA DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS EN EL VINO LA ASAMBLEA GENERAL Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino, A propuesta de la Subcomisión de Métodos de Análisis, DECIDE, a propuesta de la Comisión II Enología, introducir el siguiente método de tipo II en el Compendio de los métodos internacionales de análisis de vinos y mostos: USO DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN QUECHERS PARA LA DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS EN EL VINO Tipo de método: II 1 -INTRODUCCIÓN Varios documentos de referencia se utilizaron en la preparación de este trabajo, que ha sido validado por un laboratorio. [1] [2]. 2 CAMPO DE APLICACIÓN El presente método define las modalidades de extracción de los residuos de pesticidas en el vino por el método QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe) y el análisis de los extractos obtenidos mediante GC/MS y/o LC/MS MS. 3 -PRINCIPIO La muestra se extrae con acetonitrilo seguido de una partición líquido-líquido por adición de sulfato de magnesio, de cloruro de sodio y de un tampón de sales de citrato. A continuación el extracto es purificado con ayuda de amino-adsorbente (SPE dispersivo con APS y sulfato de magnesio). Los extractos son acidificados por adición de una pequeña cantidad de ácido fórmico, con el fin de mejorar su estabilidad de almacenaje. El extracto final puede ser utilizado directamente para los análisis de determinación por GC/MS y LC/MS-MS. Para los análisis sólo en LC/MS-MS, la SPE dispersiva no es indispensable. 1

2 4. REACTIVOS Y PRODUCTOS 4.1 Generalidades y seguridad Los pesticidas son potencialmente tóxicos y por tanto deben ser manipulados en condiciones de seguridad y los analistas deben protegerse especialmente durante la preparación de soluciones madre a partir de materias activas comerciales. Tomar todas las precauciones necesarias para evitar una eventual contaminación del agua, solventes y otros productos. Salvo especificación contraria, los reactivos utilizados serán de calidad analítica reconocida. 4.2 Agua, calidad HPLC 4.3 Acetonitrilo [ ] calidad HPLC 4.4 Metanol [ ] calidad HPLC 4.5 Sulfato de magnesio anhidro [ ] granulado 4.6 Sulfato de magnesio, anhidro [ ] polvo fino 4.7 Cloruro de sodio [ ] 4.8 Citrato de hidrógeno disódico sesquihidratado [ ] 4.9 Citrato trisódico deshidratado [ ] 4.10 Mezcla de sales tampón para la etapa de extracción: Pesar 4 g de sulfato de magnesio anhidro granulado, 1 g de cloruro de sodio, 1 g de citrato trisódico deshidratado y 0,5 g de citrato de hidrógeno disódico sesquihidratado en un tubo. La mezcla previa de sales permite evitar la formación de cristales Solución de ácido fórmico en el acetonitrilo Diluir 0,5 ml de ácido fórmico hasta 10 ml con acetonitrilo Adsorbente de aminas primarias y secundarias APS Por ejemplo Bondesil-PSA 40 µm Varian n Soluciones de referencia internas y soluciones de referencia de control de calidad Pueden utilizarse varios compuestos como patrones internos: por ejemplo el fosfato de trifenilo [ ] y el metano de trifenilo [ ]. El uso de un patrón de control de calidad permite disponer de un indicador de rendimiento de la extracción de los residuos de las muestras: por ejemplo el tri (1,3 dicloroisopropilo) fosfato o TCPP Es conveniente preparar soluciones de concentración apropiada. Ejemplo de preparación: solución de TCPP a 10mg/l En un matraz aforado de 50mL, poner 1 ml de solución madre de 500mg/l de tri (1,3- dicloroisopropilo) fosfato y completar con acetonitrilo. 2

3 4.14. Rango de calibrado; soluciones patrón de diferentes materias activas Soluciones patrón madre Preparar soluciones madre a partir de materias activas de 500mg/l en un solvente apropiado (por ejemplo acetona). Conservación a -18 C Soluciones patrón de trabajo Mezcla de materias activas según la aplicación (CPG o LC) y según las necesidades del rango de calibrado Rango de calibrado Patrones en el acetonitrilo A partir de las soluciones patrón de trabajo se preparara un rango de calibrado con el fin de obtener una recta de calibrado de 20 a 500 µg/l. Patrones en matriz vino A partir de un vino exento de materias activas, se prepara una matriz blanca según el protocolo 6.1.1, después se añaden cantidades crecientes de materias activas con el fin de establecer una recta de calibrado de 20 a 500 µg/l. 5. Materiales 5.2. Material de vidrio y volumétrico de laboratorio: Frascos de 100 ml con tapón Tubos para centrífuga de un único uso de 50 ml y de 12 ml con tapones de rosca Probetas graduadas 10 ml de clase A Matraces aforados de 10 ml, 50 ml y 100 ml de clase A Microjeringas de volúmenes variables de 30 µl a 1000 µl verificados según ISO Jeringas de extracción de 2 ml 5.3. Microfiltros nylon de porosidad 0,45 µm 5.4. Balanza analítica 5.5. Dispositivo de agitación de gran velocidad (tipo Vortex) 5.6. Centrífuga para tubos de 50 ml y 12 ml, capaz de alcanzar 3000 g Sistema LC/MS-MS, provista de una interfase de ionización por electrospray Sistema CG/MS, provisto de dispositivos de inyección y de detección apropiados ( por ejemplo trampa de iones o triple quad). 3

4 6. PROCEDIMIENTO 6.1. Preparación de las muestras Extracción por método QuEChERS. En un tubo para centrífuga, pesar 10 g o medir 10 ml de muestra (vino), agregar 10 ml de acetonitrilo y 100 µl de una solución tri (1,3-dicloroisopropilo) fosfato de 10 mg/l. Agitar vigorosamente durante 1 minuto. Verter la preparación de sales (4.10) en el tubo para centrífuga que contenga la mezcla líquida. Agitar vigorosamente durante 1 minuto. Centrifugar durante 5 min a 3000g. 1mL de solución aproximadamente es filtrado en filtro Nylon 25mm/45µm para proceder a continuación al análisis en LC-MS Purificación del extracto con ayuda de amino-adsorbente ( SPE dispersivo con PSA) 6 ml de fase de acetonitrilo obtenidos en son transvasados en un tubo para centrífuga que contiene 900 mg de sulfato de magnesio, polvo fino (4.6) y 150mg de APS (4.12). Cerrar el tubo y agitarlo vigorosamente durante 30 s, a continuación centrifugarlo durante 5 min a 3000 g. Sin esperar, aislar y acidificar el extracto así purificado por adición de 50µl de solución de ácido fórmico (4.11). Puede realizarse el análisis por GC-MS. NOTA: para minimizar los efectos matriz, es posible utilizar una solución de agentes protectores añadida en los extractos de muestras y en las soluciones de calibrado [3] Preparación de 10 ml de solución de agentes protectores : Pesar 15 mg de sorbitol, 300 mg de etilglicerol y 100 mg de gluconolactona Añadir 2 ml de agua Y completar a 10 ml con acetonitrilo. 20µl de esta solución se añade a cada frasco que contiene las soluciones de calibrado (1 ml) y los extractos de las muestras (1 ml) Resultados y cálculos Identificación de los residuos. Los residuos son identificados a partir de varios parámetros: - Su tiempo de retención - Su espectro de masa - La abundancia relativa de los iones fragmentos (se recomienda disponer de 1 a 2 transiciones en MS/MS y 2 a 3 iones en MS) Cuantificación El análisis de los extractos obtenidos en y puede realizarse con la ayuda de diversos instrumentos, parámetros y columnas. Sin embargo, es conveniente adaptar las condiciones para cada compuesto en función de los instrumentos utilizados con el fin de obtener las mejores sensibilidades. 4

5 A partir de las soluciones patrón, se prepara una curva de calibrado de 5 puntos con el fin de verificar la linealidad para cada materia activa. La concentración en mg/kg (o mg/l) para cada sustancia identificada es obtenida directamente a partir de la recta de calibrado Rendimiento de extracción. El rendimiento puede verificarse por la adición en las muestras de un patrón de control de calidad, por ejemplo el TCPP (véase 6.1.1). Éste debe estar comprendido entre 70 y 120%. Los resultados de rendimiento no se tienen en cuenta para corregir los contenidos de residuos en los vinos pero permiten validar el método de extracción. 7. PRECISIÓN DEL MÉTODO Los resultados de la validación realizada siguiendo MA-F-AS1-08-FIDMET[4] y MA-F-AS1-09-PROPER [5], se indican en la tabla siguiente. Los índices de recuperación medios están comprendidos entre 70% y 120% (los niveles de adición efectuados han cubierto un rango de concentración que va de 0,020mg/L a 0.200mg/L) 7.1 Repetibilidad (expresada en CVr%) La repetibilidad (expresada en CVr%) media es igual a 10% 7.2 Reproducibilidad La reproducibilidad (CV R %) media es igual a 30% %Índice recup. CV r % CV R % HorRat Metalaxil ,1 Chlorphyriphos ethyl ,0 Tebuconazole ,3 Ciprodinil ,1 Tebufenozide ,2 Fludioxonil ,4 Benalaxil ,1 Cyproconazole ,3 Tebufenpirad ,2 Pyraclostrobin ,2 Vinclozolin ,1 Mepanipirim ,1 Boscalid ,1 Iprovalicarb ,2 Iprodione ,1 Procymidone ,2 Pyrimethanil ,0 5

6 Carbendazima ,6 Fenbuconazole ,0 Fenitrothion ,7 Metrafenona ,7 Penconazole ,1 Flusilazole ,3 Oxadixyl ,3 Azoxystrobin ,2 Dimetomorf ,4 Fenhexamid ,8 El conjunto de los resultados de los ensayos inter laboratorios que han conducido a los datos de precisión se presentan en el anexo A BIBLIOGRAFÍA [1]P. Paya, J. Oliva, A. Barba, M. Anastassiades, D. Mack, I. Sigalova, B. Tasdelen; Analysis of pesticides residues using the Quick Easy Cheap Affective Rugged and Safe (QuEChERS) pesticide multiresidue method in combination with gas and liquid chromatography and tandem mass spectroscopy detection, Anal Bioanal Chem, [2]EN : 2008 Aliments d origine végétale - Méthode polyvalente de détermination des résidus des pesticides par CG-SM et SL/MS/MS avec extraction/partition avec de l acétonitrile et nettoyage par SPE dispersés Méthode QuEChERS; enero 2009; AFNOR [3]K. Mastovska, Steven J. Lehotay, and M. Anastassiades ; Combination of analyte protectants to overcome matrix effects in routine GC analysis of pesticides residues in food matrixes, Anal. Chem. 2005, 77, [4]MA-F-AS1-08-FIDMET, OIV: Precisión de los métodos analíticos (resolución oeno 5/99). [5]MA-F-AS1-09-PROPER, OIV: Protocolo para la planificación, la realización y la interpretación de los estudios de resultados de los métodos de análisis (resolución 6/2000). FV 1410: Resultados del estudio intralaboratorio. 6

7 ANEXO A RESULTADOS DEL ESTUDIO DE PRECISIÓN Este documento presenta los resultados del estudio de validación del método de análisis de los residuos de pesticidas en el vino después de extracción QuEChERS (FV 1340). El estudio se ha llevado a cabo según los documentos OIV MA-F-AS1-08-FIDMET y MA-F- AS1-09-PROPER 1- Laboratorios participantes Dieciséis laboratorios han participado en el estudio: - Laboratorio INTER RHONE Francia - INSTITUT FUR HYGIENE UND UMWELT Alemania - LABORATORIO AGROENOLÓGICO UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL MAULE Chile - AGRICULTURAL OFFICE OF BORSOD-ABAUJ-ZEMPLEN COUNTY Hungría - PESTICIDE RESIDUE ANALYTICAL LABORATORY Hungría - AUSTRIAN AGENCY FOR HEALTH AND FOOD SAFETY Austria COMPETENCE CENTER FOR PLANT PROTECTION PRODUCTS Austria - LABORATORIO DEPARTEMENTAL DE LA SARTHE Francia - LABORATORIO PHYTOCONTROL Francia - BENAKI PHYTOPATHOLOGICAL INST. PESTICIDES RESIDUES LAB. Grecia - LABORATORIO DUBERNET OENOLOGIE Francia - ARPAL DIPARTIMENTO LA SPEZIA Italia - ARPA VENETO SERVIZIO LABORATORI VERONA Italia - ARPALAZIO SEZIONE DI LATINA Italia - ANALAB CHILE S.A. Chile - LABORATORIO REGIONAL DE LA CCAA DE LA RIOJA España - SCL LABORATORIO DE BORDEAUX Francia - ARPA FVG DIP. DI PORDENONE Italia 2- Muestras Materias activas analizadas Para este estudio se han propuesto 12 muestras: - cuatro vinos tintos: A, B, G, H - cuatro vinos blancos: C, D, I, J - dos vinos de oporto: E, K dos moscateles: F, L 27 materias activas deberían analizarse, repartidas en las 12 muestras en cantidades que cubran un rango de concentración de 0, 015 mg/l a 0,200 mg/l (ref. tabla siguiente). A G B H C I D J mg/l mg/l mg/l mg/l Metalaxil Chlorphyriphos éthyl Tebuconazole Ciprodinil E K mg/l F L mg/l 7

8 Tebufenozide Fludioxonil Benalaxil Cyproconazole Tebufenpirad Pyraclostrobin Vinclozolin Mepanipirim Boscalid Iprovalicarb Iprodione Procymidone Pyrimethanil Carbendazima Fenbuconazole Fenitrothion Metrafenona Penconazole Flusilazole Oxadixyl Azoxytrobine Dimetomorf Fenhexamid Evaluación estadística El conjunto de los resultados primarios se presenta en el FV En cada cuadro, los valores eliminados o aberrantes aparecen en caracteres diferentes. 4.1 Valores eliminados Algunos valores se eliminan antes de la evaluación en los siguientes casos: - para evaluar la repetibilidad del método hemos utilizado el principio de las muestras dobles ciegas: algunos laboratorios solo han dado un resultado sobre una de las muestras del par, este valor se ha eliminado (señalados en los cuadros xxx ) - cuando los resultados se expresan en forma de inferior a (señalados en los cuadros < xxx ) Los test de COCHRAN y de GRUBBS se han aplicado sucesivamente a los pares de valores para eliminar las variantes aberrantes por una parte y los valores medios extremos por la otra. Los valores eliminados por estos dos test aparecen en los cuadros en forma de XXX 8

9 4.2 Repetibilidad-Reproducibilidad Los parámetros de repetibilidad y de reproducibilidad están agrupados en la tabla 1. En este cuadro se indican para cada sustancia: - n: número de pruebas consideradas - media: media de los resultados - TR%: índice de recuperación medio - CVr%: repetibilidad en % de la media - CV R %: reproducibilidad en % de la media - PR CV R %: reproducibilidad en % calculada por la ecuación de Horwitz (PR CV% = 2C - 0,1505 ) - HoR: valor de HorRaT (CV R % / PR CV R % ) Los criterios de evaluación escogidos son: - índice de recuperación comprendido entre 70% y 120%. - los resultados obtenidos en condiciones de reproducibilidad se comparan con los predichos según el modelo de Horwitz, utilizando la relación de HorRat. Los valores de reproducibilidad se consideran satisfactorias cuando esta relación es inferior o igual a 2. - la repetibilidad se considera satisfactoria cuando no supera el valor de 0,66x Horwitz. 9

10 TABLA 1: Valores de precisión Vino tinto1 Vino tinto2 Vino blanco1 Vino blanco2 Oporto Moscatel Metalaxil Chlorphyriphos ethyl Tebuconazole Ciprodinil Tebufenozide n media 0,051 0,041 0,105 0,033 0,014 TR% 102% 103% 82% 69% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,1 1 0,9 1,3 1,1 n media 0,073 0,031 0,166 0,018 TR% 73% 78% 83% 90% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,3 1 0,9 0,6 n media 0,025 0,078 0,05 0,04 TR% 100% 98% 100% 100% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,3 1,3 1,2 1,2 n media 0,045 0,036 0,098 0,023 TR% 90% 90% 94% 96% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,4 1,3 0,6 1,1 n media 0,049 0,106 TR% 98% 106% CV r% 16 6 CV R% PR CV R% HoR 1 1,3 10

11 TABLA 1 (continuación): Valores de precisión Vino tinto1 Vino tinto2 Vino blanco1 Vino blanco2 Oporto Moscatel Fludioxonil Benalaxil Cyproconazole Tebufenpirad Pyraclostrobin n media 0,026 0,064 0,015 TR% 104% 98% 100% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,7 1,2 1,4 n media 0,046 0,04 0,099 0,023 TR% 88% 98% 95% 110% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,4 1,2 1,1 0,8 n media 0,049 0,08 0,095 0,042 TR% 91% 93% 88% 98% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,4 1,4 0,9 1,3 n media 0,042 0,038 0,094 0,021 TR% 84% 95% 94% 105% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,3 1,2 1,1 1,1 n 8 9 media 0,055 0,121 TR% 110% 121% CV r% 6 5 CV R% PR CV R% HoR 1,2 1,2 11

12 TABLA 1 (continuación): Valores de precisión Vino tinto1 Vino tinto2 Vino blanco1 Vino blanco2 Oporto Moscatel Vinclozolin Mepanipirim Boscalid Iprovalicarb Iprodione n media 0,031 0,020 0,039 0,08 TR% 78% 100% 78% 80% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,4 0,9 1 0,9 n media 0,063 0,028 0,022 0,046 TR% 79% 70% 88% 92% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,4 1,3 0,7 1,1 n media 0,022 0,097 0,034 0,083 0,174 TR% 105% 121% 85% 83% 87% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,6 1,3 1 0,7 0,8 n media 0,016 0,016 0,052 0,1 TR% 107% 114% 104% 100% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,3 1,3 1,1 1,2 n media 0,079 0,039 0,053 0,101 TR% 104% 103% 113% 107% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,5 0,9 1 0,8 12

13 TABLA 1 (continuación): Valores de precisión Vino tinto1 Vino tinto2 Vino blanco1 Vino blanco2 Oporto Moscatel Procymidone Pyrimethanil Carbendazima Fenbuconazole Fenitrothion n media 0,018 0,011 TR% 90% 110% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,2 1,1 n media 0,036 0,011 0,027 TR% 60% 46% 120% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1 1 0,9 n 8 9 media 0,057 0,033 TR% 106% 120% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,5 1,7 n 8 7 media 0,067 0,042 TR% 84% 105% CV r% 6 5 CV R% PR CV R% HoR 1,9 2,0 n media 0,034 0,019 TR% 85% 95% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,2 1,4 13

14 TABLA 1 (continuación): Valores de precisión Vino tinto1 Vino tinto2 Vino blanco1 Vino blanco2 Oporto Moscatel Metrafenona Penconazole Flusilazole Oxadixyl Azoxystrobin n 7 7 media 0,038 0,018 TR% 95% 90% CV r% 8 7 CV R% PR CV R% HoR 0,7 0,6 n media 0,017 0,009 TR% 106% 113% CV r% 8 8 CV R% PR CV R% HoR 1 1,2 n media 0,035 0,019 TR% 88% 95% CV r% 6 9 CV R% PR CV R% HoR 1,4 1,2 n 7 10 media 0,04 0,023 TR% 80% 92% CV r% 10 5 CV R% PR CV R% HoR 0,7 1,1 n media 0,078 0,045 TR% 78% 90% CV r% 10 6 CV R% PR CV R% HoR 1,2 1,2 14

15 TABLA 1 (continuación): Valores de precisión Vino tinto1 Vino tinto2 Vino blanco1 Vino blanco2 Oporto Moscatel Dimetomorf Fenhexamid n media 0,086 0,019 0,019 0,047 TR% 86% 94% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,4 1,5 1,2 n media 0,083 0,026 0,025 0,039 TR% 83% 96% 93% 78% CV r% CV R% PR CV R% HoR 1,3 0,6 0,7 0,7 15