CARACTERIZACION DE BEGOMOVIRUS EN HOSPEDANTES ALTERNATIVOS ASOCIADOS AL CULTIVO DEL FRIJOL (Phaseolus vulgaris L.) EN CUBA

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1 CARACTERIZACION DE BEGOMOVIRUS EN HOSPEDANTES ALTERNATIVOS ASOCIADOS AL CULTIVO DEL FRIJOL (Phaseolus vulgaris L.) EN CUBA Ana Lidia Echemendial*, P.L. Ramos 2, R. Peral 2, A.D. Fuentes 2 y G.A. Gonzalez' 'Institute de Investigaciones de Sanidad Vegetal, 2 Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, aechemendia@inisay.cu. RESUMEN El frijol (Phaseolus vulgaris L.) originario de America, se considera uno de los alimentos basicos en esta region, ya que representa un aporte proteico y calorico de un % y 340 cal/100g, respectivamente. Este ha sido afectado durante decades por diferentes begomovirus, dentro del cual el Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) constituye la plaga mas importante de todos los tiempos en las zonas donde se cultiva el grano. Teniendo en cuenta las infecciones persistentes y las perdidas ocasionadas por los begomovirus, los objetivos de este trabajo se encaminaron a estudiar, mediante tecnicas biologicas, serologicas y moleculares, los hospedantes alternativos de BGYMV y de begomovirus presentes en plantas asociadas al cultivo del frijol. Los estudios de RFLP y analisis de secuencia en reservorios naturales sefial6 a Phaseolus lunatus L. como hospedantes de BGYMV. Los alineamientos de secuencias mostraron altos porcentajes de identidad con el aislado de Mexico y similares iterones a los encontrados para este en diferentes aislados de la region. La maleza Sida sp. se encontr6 infectada por una cepa del Sida golden yellow vein virus (SIGYVV) similar al aislado de La Florida. Sintomas de moteado amarillo en Dicliptera vahliana Ness. fueron producidos por el aislado cubano del Dicliptera yellow mottle virus (DiYMoV-CU); sin embargo, en M. lathyroides se identific6 una nueva especie de begomovirus al que se le denomin6 Macroptilium yellow mosaic virus (MaYMV), ambos determinados por primera vez en el pals. SiGYVV y MaYMV fueron capaces de infectar experimentalmente a plantas de frijol inoculadas por el metodo biobalistico. Similares analisis de restriccion y de secuencia revelaron la presencia de un begomovirus en las malezas Sida glutinosa Cay. y Desmodium sp. que mostro altos porcentajes de identidad con el Tomato mottle Taino virus (ToMoTV). Palabras clave: begomovirus, hospedantes, frijol, Phaseolus vulgaris. CHARACTERIZATION OF BEGOMOVIRUS IN ALTERNATE HOSTS ASSOCIATED TO COMMON BEAN (Phaseolus vulgaris L.) CROP IN CUBA SUMMARY Common bean (Phaseolus vulgaris L.) is an important source of protein and calories in Latin America (15-30 % and 340 cal/100g, respectively). In Cuba, the emergence of bean golden mosaic was associated to high populations of Bemisia tabaci in common bean fields, in the 1970s. During the last two decades, common bean has been affected by the begomovirus Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV), which is the most important disease in this crop recorded in the history of agriculture. The objective of this study was to detect the natural host reservoirs of BGYMV and other begomoviruses associated to bean crops, using biological, serological and molecular methods, taking into account the persistent infections and the significant economic losses caused by begomoviruses. Restriction fragments length polymorphism and sequence

2 analyses suggested that Phaseolus lunatus acted as natural host reservoir of BGYMV; the sequence analyses revealed high percentage identity with the Mexican BGYMV isolate and similar iterative sequences were identified with various strains in the region. Plants of Sida sp. weed were infected with Sida golden yellow vein virus (SiGYVV) similar to the Florida isolate. This is the first identification of SiGYVV in Cuba. Yellow mottle symptoms in Dicliptera vahliana were produced by the Cuban isolate of Dicliptera yellow mottle virus (DiYMoV-Cu). The virus isolated from Macroptilium lathyroides plants is a new species of begomovirus, named Macroptilium yellow mosaic virus. DiYMoV and MaYMV are the first report in Cuba. If inoculated using biobalistic method, SiGYVV and MaYMV are capable of infecting bean plants. Similar sequence and restriction analyses revealed the presence of a begomovirus in Sida glutinosa Cay. and Desmodium sp. isolates, which showed high percentage of identity with Tomato mottle Taino virus (ToMoTV). Key words: begomovirus, host, common bean, Phaseolus vulgaris. INTRODUCCION El frijol comun (Phaseolus vulgaris L.) originario de America, se considera uno de los alimentos basicos, ya que representa un aporte proteico y calorico de un % y 340 cal/100g respectivamente. Su produccion en America tropical y subtropical asciende a mas de cuatro millones de toneladas al ario, mientras que en los paises de Centroamerica se cultivan aproximadamente 500 mil hectareas y en el Caribe, particularmente Cuba, Republica Dominicana y Haiti, la cifra asciende a 250 mil hectareas (Morales, 2000). En Cuba se cultivan aproximadamente 52 mil hectareas de frijol, sin incluir las areas dedicadas al autoabastecimiento. En la region, la baja productividad del frijol se debe a diversos factores, entre los que se encuentran, la falta de asistencia tecnica, el bajo use de insumos dedicados a la atencion del cultivo y los problemas fitosanitarios. Entre estos Ultimos los que mas se destacan son las enfermedades virales del tipo del mosaico dorado y otros begomovirus, las que son transmitidas por moscas blancas Bemisia tabaci (Morales, 2000). Las enfermedades virales causadas por begomovirus que afectan al frijol en America Latina, son el Virus del mosaico dorado del frijol (BGMV), el Virus del mosaico calico del frijol (BCaMV) y el Virus del mosaico enano del frijol (BDMV) (Morales et al, 1990; Brown et al, 1999). De estos, el de mayor importancia es el mosaic() dorado del frijol, sefialado por primera vez en el Brasil (Costa, 1965), el que se disemin6 a Argentina y Bolivia alcanzando valores de incidencia del 80% y perdidas entre % y se convirtio en la decada del 80 en la enfermedad mas devastadora del cultivo de todos los tiempos (Schieber, 1969; Gamez, 1970; Bird et al, 1972; Pierre, 1975; Baltasar, 1978; Blanco y Bencomo, 1978; LOpez-Salinas y Becerra, 1994). Posteriormente, se distinguen dos especies del virus que causan el sintoma de mosaico dorado, la suramericana, denominada Virus del mosaico dorado del frijol (BGMV) y la mesoamericana, Virus del mosaico dorado amarillo del frijol (BGYMV) (Morales, 2000). En Cuba, el cultivo es afectado por los virus del moteado amarillo (BYSV) (Blanco, 1979), del mosaico comun (CBMV) (Lastres, 1981), del mosaico severo y amarillo del caupi (CPMV) (Blanco y Lastres, 1981), recientemente se ha detectado el virus del encrespamiento amarillo de la hoja del tomate (TYLCV) (Martinez et al, 2002) y desde inicios de la decada del 70, fueron sefialados los sintomas de amarillamiento en el frijol como causados por el mosaico dorado

3 (BGMV) (Blanco y Bencomo, 1978) asociado a poblaciones de moscas blancas. El BGMV provoco, en las campaflas de los aflos y 90-91, porcentajes maximos de infeccion en diferentes provincias, que conllev6 la destruccion de mas de 1000 hectareas del cultivo. Posteriormente, con la presencia de Bemisia tabaci biotipo B, a finales de la decada del 90, la enfermedad alcanz6 afectaciones de un 90 % y se convirtio en el principal pat6geno viral del frijol comun en Cuba (Blanco y Faure, 1994; Vazquez, 1999). Los estudios realizados hasta la actualidad en Cuba y relacionados con el BGMV se basaron en aspectos epidemiologicos (Blanco y Bencomo, 1978; Blanco et al, 1984), donde se demostro el momento de afluencia de las moscas blancas al frijol, de los picos poblacionales y de la aplicacion de insecticidas, asi como su relacion con las precipitaciones, sin existir referencias sobre caracterizacion, metodos de diagnostico y otros aspectos importantes de dilucidar, como los hospedantes intermediarios de este y de la posible presencia de begomovirus en plantas asociadas al cultivo capaces de infectarlo. Considerando lo antes expuesto y mediante los estudios de identificacion, caracterizacion y diagnostico de la especie de virus, que produce sintomas de begomovirus en el hospedantes alternativos asociados a frijol en Cuba, el objetivo de nuestro trabajo estuvo encaminado a caracterizar las especies de begomovirus presentes en hospedantes alternativos asociados al cultivo del frijol, mediante tecnicas biologicas, serologicas y moleculares. MATERIALES Y METODOS Determinacion del virus del mosaico dorado amarillo del frijol (BGYMV) en el cultivo del frijol y en especies de plantas asociadas, mediante tecnicas biologicas, inmunoenzimaticas y moleculares. Colecta de muestras La colecta de las muestras se realizo en tres campaflas del cultivo ( ) y abarc6 diferentes municipios de las provincias de Pinar del Rio, Ciudad Habana, La Habana, Matanzas, Cienfuegos, Villa Clara, Holguin, Granma, Santiago de Cuba y Guantanamo. Se analizaron un total de 173 muestras de diferentes especies de plantas asociadas al cultivo y pertenecientes a las familias Malvaceae (Sida sp., Sida glutinosa Cay.), Fabaceae (Macroptilium lathyroides L., Phaseolus lunatus L., Desmodium sp.) y Acanthaceae (Dicliptera vahliana Ness.), las que manifestaban sintomas de moteado o mosaico amarillo y encrespamiento foliar, similares a los causados por begomovirus (Tab la 1). Las mismas fueron debidamente registradas y conservadas a -20 C hasta su posterior analis is. Transmision mecanica Para determinar la presencia de begomovirus y detectar infecciones mixtas en las muestras se realizaron inoculaciones mecanicas por maceracion de tejidos y por biobalistica a diferentes especies de plantas y variedades de frijol, utilizando como inoculos hojas de especies con sintomas similares a begomovirus y colectadas en las diferentes provincias. A partir de cada aislado procedente de muestras de especies de las diferentes localidades se inocularon mecanicamente a 10 plantas de P. vulgaris variedad Delicias 364. Mientras que P. lunatus y D. vahliana se inocularon por este metodo a 10 plantas de: P. vulgaris, D. vahliana y P. vulgaris, respectivamente. Para la inoculacion mecanica los fragmentos de hojas de diferentes especies especies se maceraron con tampon fosfato 0.1 M ph 7.5, (1 gramo en 10 nil de buffer),

4 conteniendo 2-mercaptoetanol al 1% y se utilizo carborundum como agente abrasivo (Schwartz y Galvez, 1990). Tab la 1. Material vegetal colectado de especies de plantas asociadas al frijol en diferentes provincias y localidades de Cuba en el period() Provincias Especies de plantas Nombre vulgar Macroptilium lathyroides (L.) Ur Contramaligna 6 Pinar del Rio Sida sp. Ma lva 7 Phaseolus lunatus L. Frijol caballero 6 Macroptilum lathyroides (L.) Uri Contarmaligna 6 Ciudad Habana Phaseolus lunatus L. F. caballero 6 Dicliptera vahliana Ness. Gallitos 7 Sida glutinosa Cay. Ma lva 9 Desmodium sp, Amor seco 8 Sida sp. Ma lva 7 La Habana Dicliptera vahliana Ness. Gallitos 6 Sida glutinosa Cay. Ma lva 5 Phaseolus lunatus L. F. caballero 5 Macroptilium lathyroides (L.) Ur Contramaligna 6 Sida sp. Ma lva 8 Matanzas Phaseolus lunatus L. F. caballero 8 Macroptilium lathyroides (L.) Ui Contramaligna 7 Cienfuegos Phaseolus lunatus L. F. caballero 5 Macroptilium lathyroides (L.) Ur Contramaligna 7 Miner de muestras Villa Clara Macroptilium lathyroides (L.) Ur Contramaligna 8 Holguin Sida sp. Ma lva 10 Santiago de Cuba Sida sp. Ma lva 11 Sida sp. Ma lva 6 Guantanamo Sida glutinosa Cay. Ma lva 7 Phaseolus lunatus L. F. caballero 7 Cada uno de los aislados de las diferentes especies de plantas fueron inoculadas por biobalistica a 10 plantas de P. vulgaris, Lycopersicon esculentum (variedad Campbell-28) y Nicotiana tabacum (variedad Corojo). En el ensayo de la trasmision por biobalistica, de las plantas colectadas se tomaron 6 mg del ADN extraido por el metodo Dellaporta y col. (1983). Estas se mezclaron con las microparticulas a bombardear empleando el metodo de precipitaci6n con particulas de oro (Sanford y col., 1992). Para ello se utilizo una pistola de genes de disefio Finer y col. (1993) en condiciones de vacio (28 pulgadas de Hg). El volumen de inoculo utilizado por cada muestra fue de 5 ml de mezcla ADN-microparticulas, la presion de disparo fue de 700 kpa y la distancia de bombardeo de 18 cm. Las plantas inoculadas por ambos metodos permanecieron en condiciones controladas de temperatura a C y se observaron durante 30 dias.

5 Tecnica inmunoenzimatica Se desarroll6 la tecnica ELISA-DAS y se emplearon un anticuerpo de amplio espectro denominado (3F7), el que fue donados gentilmente por el Dr. Francisco J. Morales del Centro Internacional de Agricultura Tropical en Cali, Colombia. El anticuerpos 3F7 obtenido por Canino y col. (1995) se usaron segun el procedimiento informado por estos autores. Tecnicas moleculares. Extraccion de ADN total de plantas y Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR) La extraccion de ADN viral se llev6 a cabo por el metodo Dellaporta y col., 1983, con modificaciones descritas por Herrera y col., (1999). La concentracion fue estimada teniendo en cuenta la concentracion de ADN cromosomal, en electroforesis en geles de agarosa al 0.8 % y teilidos con bromuro de etidio al 0.5 mg/ml (Maniatis y col., 1982). La amplificacion se llev6 a cabo con los siguientes pares de oligonucleotidos degenerados disefiados por Rojas y col. (1993), los que amplifican diferentes regiones del componente A de begomovirus. Las condiciones empleadas fueron las sefialadas por Rojas y col. (1993). Los fragmentos amplificados se visualizaron en geles de agarosa al 0.8% teilidos con bromuro de etidio a 0.5 mg/ml (Maniatis y col., 1982). Clonaje y analisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccion (RFLP) Los fragmentos amplificados por PCR, se aislaron por electroforesis en geles de agarosa al 0.8% usando el procedimiento de extraccion fenolica (Sambrook y col., 1989). Por otra parte, los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pzerotm-2.1 (Invitrogen, San Diego, CA) en el sitio de corte Unico Pstl y las tecnicas de ADN recombinante se realizaron segun Sambrook y col. (1989). En el analisis de restriccion la digestion se realizo con diferentes enzimas teniendo en cuenta el fragmento amplificado y las secuencias informadas. Para el fragmento amplificado de los posibles aislados de BGYMV con los oligonucleotidos: PAL1v1978-PAR1c715, se usaron las enzimas- HindIII, Ndel, EcoRV, EcoRI, Hindi, Bg111, Sall, Pstl (Sambrook y col., 1989). Determinacion de la diversidad genetica y secuenciacion de los begomovirus presentes en hospedantes alternativos asociadas al cultivo del frijol Para cada aislado de las especies de plantas en estudio asociadas al cultivo del frijol se seleccion6 dos clones, basados en si habla variacion en los patrons de restriccion, con el objetivo de determinar la secuencia de los aislados encontrados. Se escogieron para P. lunatus los clones de C. Habana y La Habana, para Desmodium sp., D. vahliana y Sida sp. los de La Habana, para M. lathyroides se seleccionaron los de Villa Clara y C. Habana y para Sida glutinosa los de La Habana y Guantanamo. La secuenciacion del ADN se realizo por el metodo de terminacion de cadenas por dideoxinucleotidos (Sanger y col., 1977), usando el secuenciador automatic ALFwin Sequense Analiser 2.00 (Amersham Pharmacia Biotech, UK. Ltd.). En todos los aislados se secuenciaron parcialmente los clones que contenfan el fragmento amplificado con el par de oligonucleotidos PAL1v1978-PAR1c715 y PALv1960-PARc722. Las secuencias totales y parciales obtenidas se compararon con los aislados de begomovirus informados en la region, de forma que para el analisis filogenetico se compararon las secuencias con la de los siguientes geminivirus: BCMoV (AF110189); BGMV-BZ (M88686); BGYMV-PR (M10070); BGYMV-GA (M91604); BGYMV-DR (L01635); BDMV (M88179); BGYMV-Mx

6 (AF173555); ToMHV (Y14874); ToMoTV (AF02700) y las otras especies de plantas ademas de estas secuencias se compararon segun correspondia con DiYMoV (AF139168); TGMV (K02029); SiGMCRV (X99550); SiGMFV (U77963); SiGMHV (Y11097); SiGMV (AF049336); SiGYVV (U77964); SiYVV (Y11099). En los analisis de secuencia se utilizaron los paquetes de software Gene Runner version 3.02 Copyright 1994 Hastings Software, Inc. La busqueda de secuencias relacionadas se realizo con el programa BLAST (NCBI) y los alineamientos multiples de secuencias por el Clustal W (EMBL) (Thompson y col., 1994). Las secuencias se obtuvieron de la base de datos EMBL y GenBank. RESULTADOS Y DISCUSION Determinacion de begomovirus en el cultivo del frijol y en especies de plantas asociadas, mediante tecnicas biologicas, inmunoenzimaticas y moleculares Transmision mecanica En los ensayos de transmision mecanica, los resultados obtenidos en la manifestacion de sintomas de mosaico amarillo en plantas de P. vulgaris al ser inoculadas con los extractos de P. lunatus y M. lathyroides, sugieren la presencia del Virus del mosaico dorado y/o dorado amarillo del frijol ya que estas plantas se consideran hospedantes naturales de los mismos (Tabla 2) (Schwartz y Galvez, 1990). Sin embargo, el 'limner de plantas de frijol con sintomas, al inocular los extractos de las muestras de Sida sp. y M. lathyroides, fue menor que lo encontrado para P. lunatus y P. vulgaris, sugiriendo diferencias en la facilidad, de los posibles virus presentes en estas especies de plantas, de infectar a P. vulgaris (Tabla 2). P. lunatus se ha sefialado como hospedante de BGYMV y BGMV en Puerto Rico y Brasil, respectivamente (Bird et al, 1972; Costa, 1965). En Cuba, no existen referencias en este sentido, pero P. lunatus, conocido como frijol caballero, se encuentra frecuentemente en las cercas que bordean las plantaciones de diferentes cultivos (Roig, 1965) constituyendo un hospedante potencial de virus. Las malezas Sida glutinosa y Desmodium sp., a pesar de presentar sintomas caracteristicos de mosaico amarillo no infectaron las plantas de frijol, tabaco y tomate (Tabla 2), mientras que las plantas de P. vulgaris infectadas con Sida sp. representaron un 30% del total y mostraron sintomas de encrespamiento foliar severo. Otras especies de malezas como Desmodium occuleatum y Macroptilium lathyroides, han sido reconocidas como hospedantes de BGYMV (Schuwartz y Galvez, 1990). Mientras que Sida sp. y Dicliptera sexagularis se han sefialado como reservorios de geminivirus diferentes (Hofer et al, 1997a; Wu et al, 1996; Lotrakul et al, 2000).

7 Tabla 2. Resultados obtenidos en la inoculacion por biobalistica de diferentes especies de plantas asociadas at cultivo de frijol. Metodo de Inoculacion / Inoculo Biobalistica* Dicliptera vahliana C. Habana y La Habana Sida sp. La Habana y C. Habana Sida glutinosa La Habana Desmodium,sp La Habana Biobalistica y Mecamco* Macroptilum lathyroides La Habana y Villa Clara Plantas inoculadas No. de plantas positives/ Total de plantas inoculadas Sintomas Dicliptera vahliana 6/10 Mo-a y Ef Lycopersicon esculentum 0/10-0 /10 - Nicotiana tabacum var. Criollo Phaseolus vulgaris 0/10 - P. vulgaris 3/10 Ef-s 0/10 - N. tabacum L. var. Criollo L. esculentum Mill 0/10 - P. vulgaris 0/10-0/10 - N. tabacum L. var. Criollo L. esculentum 0/10 - P. vulgaris 0/10-0/10 - N. tabacum L. var. Criollo L. esculentum Mill 0/10 - P. vulgaris 8/10 M-va 0/10 - N. tabacum L var. Criollo L. esculentum Mill 0/10 - Phaseolus lunatus P. vulgaris 14/10 M-va N. tabacum L var. Criollo 0/10 - L. esculentum Mill 0/10 - * se refiere a los aislados de todas las especies por municipios. M-va: Mosaico verde-amarillo Efencrespamiento foliar - Resultados negativos Mo-a : Moteado amarillo Ef-s encrespamiento foliar severo Sida sp. conocida como Malva, aunque no se consideran un problema por su dominancia y presencia en la aplicacion de los Manejos Integrados de Plagas en el frijol, constituyen gran parte de la vegetacion herbacea espontanea de Cuba y se encuentra en los terrenos de cultivos, caminos y potreros, serialandose, al igual que M. lathyroides como hospedantes de B. tabaci, responsable de la transmision viral desde las malezas a los cultivos (Roig, 1965; Paredes (1999) citado por Murguido, 2000). Otros dos aislados de geminivirus denominados Virus del mosaico dorado de Sida de Honduras (SiGMHV) y Virus de las venas amarillas de Sida (SYVV), fueron encontrados en Honduras infectando Sida sp. y produciendo sintomas de encrespamiento foliar, deformacion de la planta y mosaico verde-amarillo, similares a los observados en nuestro estudio con dicha especie (Frischmuthh et al, 1997). Estos resultados son de gran interes, por el riesgo que conlleva

8 la presencia de nuevos hospedantes de BGYMV y de otros begomovirus en areas de este cultivo que provoquen un incremento del nivel de infeccion pudiendo desatar la aparicion de nuevas epidemias en el frijol. Tecnica inmunoenzimatica El 3F7 reconoci6 a los aislados colectados de las diferentes especies de plantas y fue reactivo en todos los casos, al poder reconocer los aislados de begomovirus presentes en Sida sp., Desmodium sp., S. glutinosa, M. lathyroides, D. vahliana, y P. lunatus. Resultados identicos se alcanzaron al reaccionar el anticuerpo 3F7 frente a distintos aislados de begomovirus como: el Virus del mosaico del Abutilon, BGMYV-PR, BGYMV-GA, BGYMV-RD, BGMV-BZ, BGYMV-Florida, el Virus del mosaico de la euphorbia, Virus del mosaico de la rhynchosia, Virus del encrespamiento foliar de la calabaza, Virus del mosaico amarillo de la soya y el Virus del moteado del tomate (Canino et al, 1995). Esta habilidad, para identificar por serologia distintas especies de begomovirus a partir de disimiles muestras de campo, es una alternative de diagnostico rapida para detectar infecciones ocasionadas por geminivirus. Los resultados obtenidos en este estudio, corroboraron la utilidad del inmunosuero 3F7, al reaccionar con todas las muestras de especies analizadas, lo que nos lleva a asumir que estamos en presencia de begomovirus trasmitidos por moscas blancas en dichas plantas. Tecnicas moleculares. Extraccion de ADN total de plantas y Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR) Para la extraccion de acidos nucleicos la concentracion obtenida de ADN cromosomal estuvo en un rango de 4-6 ughtl por cada gramo de tejido. En todas las muestras analizadas, y mediante la tecnica de PCR empleando oligonucleotidos degenerados PAL1v1978-PAR1c715 y PAL1c1960-PAR1v722, se amplificaron fragmentos de 1.4 y 1.2 kb respectivamente que corresponden al componente ADN-A de begomovirus (Figura 1). Los oligonucleotidos degenerados disefiados a partir de regiones altamente conservadas, para la amplificacion de porciones del componente A de begomovirus empleando la reaccion en cadena de la polimerasa, facilita la caracterizacion molecular de begomovirus encontrados en diferentes cultivos y malezas hospedantes de los mismos (Rojas et al, 1993). Los resultados obtenidos confirman una vez mas la presencia de begomovirus y sefialan que mediante esta tecnica, se define, para los aislados de begomovirus de Cuba, en las especies de plantas en estudio asociadas al cultivo del frijol. La amplificacion por PCR de fragmentos de ADN correspondientes a begomovirus, empleando oligonucleotidos degenerados, ha sido ampliamente usado en nuestro estudio no solo como tecnica de diagnostico sino tambien para combinar con otros procedimientos moleculares. Los fragmentos obtenidos se clonaron para realizar RFLP y determinar si existe variabilidad genetica entre los aislados de BGYMV en los hospedantes alternativos colectados en las diferentes localidades.

9 Figura 1. Fragmentos de 1.2 y 1.4 kb amplificados por PCR a partir de muestras de: 1- Marcador de peso molecular 1 Kb; 2 y 6- muestras de Macroptilium lathyroides de Pinar del Rio y Villa Clara con los oligonucleotidos PAL1v1978-PAR1c715; 3, 5 y 7- muestras de Macroptilium lathyroides de P. del Rio, Matanzas y Villa Clara con PAL1c1960-PAR1v722; 4- muestra de frijol sana. Clonaje y analisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccion (RFLP) La amplificacion de ADN por PCR y a partir de los fragmentos obtenidos, el analisis de los patrones de restriccion por RFLP son descritos para la identificacion y diferenciacion de especies de begomovirus (Rojas et al, 1993). En otros ensayos los resultados para el analisis de los patrones de restriccion de los fragmentos amplificados a partir de los oligonucleotidos PAL1v1978-PAR1c715 de las especies de plantas asociadas al cultivo del frijol en estudio, revelaron diferencias para los patrones de los begomovirus estudiados en Cuba y de la region que pudieran estar relacionados (Tabla 3). En el caso de P. lunatus el patron coincide con el de las muestras de frijol analizadas anteriormente por Echemendia et al. (2001), por lo que estas pudieran estar infectadas con un aislado de BGYMV. Similar situacion ocurre con los patrones de restriccion de Desmodium sp. y Sida glutinosa, al compararlos con los del Virus Taino moteado del tomate (ToMoTV), con excepcion de que posee un sitio adicional para las enzimas Hincll y Apal (Tabla 3). Las muestras de Sida sp. mostraron semejanza en el analisis de restriccion, con el Virus de las venas doradas amarillas de Sida (SGYVV) aislado de La Florida, mientras que en las muestras de Dicliptera vahliana y Macroptilum lathyroides los patrones de restriccion no presentaron parecido con los de begomovirus estudiados hasta el momento en Cuba y en otros paises de la region, sugiriendo la presencia de nuevas especies de begomovirus infectando estas plantas. Debido a estos resultados, para la determinacion de la secuencia de los begomovirus presentes en las especies con igual patron de restriccion se seleccionaron los clones P. lunatus y S. glutinosa.

10 Tabla 3. Analisis de restriccion comparativo realizado a los aislados de begomovirus presentes en especies de plantas a partir de los fragmentos amplificados con los oligonucleotidos PAL1v1978- PAR1c715. Geminivirus Pst I EcoRI Xbal Sad Sal I BglII Apal Hindi ToMoTV TMoHV SiGYVV DiYMoV FL TbLRV BGYMV-Cu TYLCV D. vahliana P. lunatus Sida sp Desmodium sp S. glutinosa M. lathyroides 0 1 1/ cada ninnero indica la cantidad de sitios para cada enzima en cada aislado Determinacion de la secuenciacion de los aislados y diversidad genetica de begomovirus de especies de plantas asociadas al cultivo del frijol Al comparar las secuencias nucleotidicas y aminoacidicas completas entre el aislado cubano procedente de P. lunatus con los de BGYMV de otros paises y con otros begomovirus, los mayores porcentajes de identidad se observaron con el aislado de BGYMV de Mexico, lo que indica que en esta especie estamos en presencia del aislado cubano de BGYMV. Estos ultimos son considerados aislados de la especie mesoamericana denominada Virus del mosaico dorado amarillo del frijol (BGYMV) (Fauquet et al, 2003). Otros autores como Bird et al, (1972), Schwart y Galvez (1990) y Faria (1999) indican que en paises como Puerto Rico y Brasil, P. lunatus, se comporta como un importante reservorio natural. Teniendo en cuenta lo antes sefialado, se puede considerar de igual manera en las condiciones de Cuba, ya que aunque no se le dedican grandes extensiones, esta especie se siembra asociado a otros cultivos generalmente en la cerca que limita los mismos, en otros casos se hace espontaneo dentro de las plantaciones, por semillas que permanecen en el suelo despues que este se ha cultivado. Los alineamientos de las secuencias de la region comun (CR) del asilado de BGYMV CU con los aislados de la region, revelo la alta identidad entre sus secuencias, y la presencia de iterones identicos (TGGAG) a los sefialados para los aislados de este virus. Los resultados obtenidos permitieron que por primera vez fuera caracterizado molecularmente en P. lunatus el Virus del mosaico dorado amarillo del frijol en Cuba. Las consideraciones sefialadas para identificar especies de virus teniendo en cuenta los porcentajes de identidad de la secuencia nucleotidica sugieren, que el aislado de BGMV-BZ debe ser considerado una especie diferente de virus, estrechamente relacionado con las especies de begomovirus del Nuevo Mundo, que difiere en cuanto a la transmision por savia y la patogenicidad en diferentes cultivares, al compararlo con los aislados de BGYMV-GA, BGYMV-PR, BGYMV-DR (Gilbertson et al, 1993; Padidam et al, 1999). Estos son

11 considerados como la especie mesoamericana denominado Virus del mosaico dorado amarillo del frijol, el cual se trasmite mecanicamente y por moscas blancas (Morales, 2000). Los resultados obtenidos al secuenciar el aislado presente en la maleza Dicliptera vahliana, aunque difieren con los resultados mostrados por analisis de restriccion, muestran los mayores porcentajes de identidad con el Virus del moteado amarillo de Dicliptera, aislado de la Florida con un 99 % de identidad para la CP y con % para la secuencia completa del componente A (Tabla 4). Estos valores indican que el begomovirus presente en esta especie de maleza, es un aislado cubano del Virus del moteado amarillo de Dicliptera (DiYMoV-CU), por primera determinado en el pais, el que no es capaz de infectar el cultivo del frijol. Estos resultados de secuencia del componente A de DiYMoV-CU, condujo a que se depositara esta en el banco de genes con el No. de accesi6n AJ El aislado de La Florida se encontr6 infectando plantas ornamentales de la especie Dicliptera sexagularis y mostro sintomas severos de moteado amarillo y distorsion en las hojas, similares a lo observado en D. vahliana. En ambos casos al realizar la determinacion de la secuencia mostraron los mas altos valores de identidad entre ellos y con aislados mesoamericanos de BGYMV (Lotrakul et al, 2000) (Tabla 4). Por otra parte, fue de interes, que al realizar el alineamiento de la CR se observ6 que este aislado comparte iterones similares a los de TGMV (GGTAV). Diferentes autores han sefialado la posibilidad de que ocurra el proceso de recombinacion entre diferentes begomovirus (Hofer et al, 1997; Ramos et al, 2003) lo que constituye una de las principales fuentes de variacion en este grupo y conlleva a la emergencia de nuevos virus y a la amplitud del rango de hospedantes, con la aparicion de dafios cuantiosos, al detectar nuevos virus que poseen secuencias identicas a otros anteriormente caracterizados (Padidam et al, 1999; Garcia-Arenal et al, 2001). Tabla 4. Porcentaje de identidad entre las secuencias nucleotidicas y aminoacidicas de los marcos de lectura abiertos del aislado presente en Dicliptera vahliana y otros begomovirus de la region. Geminivirus Total CR nt AV1 nt /aa BGYMV MX /91 BGYMV CU /87 BGYMV PR /91 BGMV BZ /89 DiYMoV FL /98 TGMV /87 ToMoTV /88 ToMHV /88 CR: region comfm, AV1: gen que codifica para la proteina de la capsida. Al determinar la secuencia del aislado de Sida sp. se detect6 los mayores porcentaje de identidad con el virus SiGYVV de la Florida (Tabla 5), lo que coincidi6 con el resultado por RFLP que arroj6 similitud con el patr6n de este, lo que indica que este aislado es una cepa de ese

12 virus, y se reafirma por el hecho de que el alineamiento realizado mostro iterones similares (GGGGT) en ambos aislados. Los resultados anteriormente obtenidos demostraron que SIGYVV-Cu es capaz de infectar el cultivo del frijol, ademas de ser reconocido por el inmunosuero 3F7. Las referencias consultadas no aportan muchos datos sobre SiGYVV, aunque el numero de plantas infectadas por biobalistica con este aislado represento solo un 30 %, la importancia radica en que el aislamiento cubano esta presente en la especie Sida sp, maleza connim en las areas de frijol y hospedante de moscas blancas, por lo que constituye un riesgo potencial para lograr un incremento de los niveles de inoculos en este cultivo y mayores estimados de perdidas. Esta determinaci6n se realiza por primera vez en Cuba y se coloc6 la secuencia en el banco de genes con el numero de accesi6n AJ Tabla 5. Identidad entre las secuencias nucleotidicas y aminoacidicas de los marcos de lectura abiertos del aislado de Sida sp. y otros begomovirus de la region. Geminivirus Total CR (nt) SiGMFV /85 SiGMHV /88 SiGMV /86 SiGYVV /93 SiYVV /86 BGYMV CU /77 AV1(nt/aa) ToMoTV /76 ToMHV /77 CR: region comfm, AV1: gen que codifica para la proteina de la capsida. Los experimentos realizados con la maleza M. lathyroides, demostraron que el aislado presente no mostr6 valores de identidad para la secuencia nucleotidica mayores al 90% para el componente A y la CP con ninguno de los virus de referencia, (Tabla 6) y a pesar de tener iterones similares a diferentes aislados de BGYMV nos lleva a considerar la existencia de una nueva especie de virus, el que fue denominado Virus del mosaico amarillo de Macroptilium, con el 'limner de accesion AJ colocado en el banco de genes, y que es reconocido por el inmunosuero 3F7 y capaz de infectar el cultivo del frijol con relativa facilidad, al mostrar mas del 50% de las plantas inoculadas con sintomas. Hasta el momento solo estaba informado infectando esta maleza el Virus del mosaico de Macroptilium en Puerto Rico (Fauquet et al, 2003), por lo que este resultado aporta conocimientos de otra enfermedad viral para esta maleza en Cuba y en otros paises, y ademas alerta sobre una posible coinfeccion, en condiciones naturales, del cultivo del frijol.

13 Tab la 6. Identidad entre las secuencias nucleotidicas y aminoacidicas de los marcos de lectura abiertos del aislado de M. lathyroides y otros begomovirus de la region. Geminivirus Total CR (nt) AV1(nt/aa) BGYMV MX /94 BGYMV CU /94 BGYMV RD /93 BGYMV PR /88 DiYMoV FL /88 ToMoTV /87 ToMHV /87 CR: region comfm, AV1: gen que codifica para la proteina de la capsida. El aislado presente en Sida glutinosa mostr6 valores de identidad de 92.4 % para la regi6n conaln del Virus de la hoja rugosa del tabaco (TbLRV) (Dominguez et al, 2002), de 99.8 % para 400 pb del extremo 3' de la CP de Virus Taino moteado del tomate (ToMoTV), revel6 ademas porcentajes de 92.7, 95.1 y 95.2 al comparar la secuencia nucleotidica de los genes AC1, AC2 y AC3 con el ToMoTV (Ramos et al, 1997), sin embargo los iterones mostraron similitud a los de TbLRV. Este aislado no infecto las plantas de frijol, como tampoco las de tomate y tabaco, a pesar de su similitud genetica con los virus antes mencionados que afectan notablemente estos cultivos en Cuba. La determinaci6n de la etiologia de este aislado debe encaminarse en un futuro, sobre todo por la importancia que puede significar para los cultivos de tomate y tabaco, los que presentan afectaciones por otros virus pertenecientes a diferentes grupos que disminuyen considerablemente los rendimientos aflos tras aflos (Martinez et al, 1998). REFERENCIAS Bird, J., Perez, J.E., Alconero, R., Vakili, N.G. y Melendez, P.L A whitefly-transmitted golden-yellow mosaic of Phaseolus lunatus in Puerto Rico. J. Agric. Univ., P.R. 56: Blanco, N Caracteristicas del virus del moteado amarillo del frijol (BYSV) en Cuba. Tesis de opcion al grado de candidato a Doctor en Ciencias Agricolas, Academia de Ciencias de Cuba, La Habana, 135pp. Blanco, N. y Faure, B SituaciOn actual del mosaico dorado del frijol en el Caribe: Cuba, pp En: El mosaico dorado del frijol, avances de investigacion bean goleen mosaic virus research advances, F. J. Morales [ed.] Centro Intern. de Agricultura tropical CIAT, Cali, Colombia. Blanco, N.; y Bencomo, I Afluencia de la mosca blanca (Bemisia tabaci) vector del virus del mosaico dorado en plantaciones de frijol. Ciencias de la Agricultura 2: Blanco, N. y Lastres, N Presencia en Cuba de las razas amarilla y severa del virus del mosaico del frijol carita (CPMV) sobre frijol. Ciencias de la Agricultura 8:

14 Blanco, N.; Lastres, N. y Bencomo, I Incidencia de enfermedades virosas del frijol en Cuba. Ciencias de la Agricultura 19: Brown, J. K., Ostrow, K. M., Idris, A. M. y Stenger, D. C Biotic, Molecular and Phylogenetic Characterozation of Bean Calico Mosaic Virus, a Distinct Begomovirus Species with affiliation in the Squash Leaf Curl Virus Cluster. Phytopathology. 89(4): Cancino, M., Hiebert, E., Purcifull, D., Polston, J. E. y Morales, F. J. 1995a. Monoclonal antibody with broad specificity to whitefly-transmitted geminiviruses. Phytopathology 85: Costa, A. S Three whitefly-transmitted virus diseases of beans in Sao Paulo, Brazil. FAO Plant Protetion Bull. 13(6): Dellaporta, S. L.; Wood, J. y Hicks, J. B A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1.4: Dominguez, M., Ramos, P. L., Echemendia, A. L., Peral, R., Crespo, J., y V. Andino Molecular characterization of tobacco leaf rugose virus, a new Begomovirus infecting tobacco in Cuba. Plant Disease 86 (9), Echemendia, A. L., Ramos, P. L., Peral, R., Fuentes, A., Gonzalez, G., Sanpedro, J., Morales, F Cuban isolate of Bean golden yellow mosaic virus is a member of the Mesoamerican BGYMV Group. Plant Disease 85 (9), Faria, J. C. y Maxwell, D. P Variability in geminivirus isolates associated with Phaseolus spp. In Brazil. Phytopathology 89: Fauquet, C.M.; Bisaro, D.M.; Briddon, R.W.; Brown, J.K.;Harrison, B.D., Rybicki, E.P., Stenger, D.C. y Stanley, J Revision of taxonomic criteria for species demarcation in the family Geminiviridae, and an updated list of begomovirus species. Arch. Virology 148: Finer, J. J.; Vain, P.; Jones, M.W. y McMullen, M.D Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Reports 11: Frischmuth, T., Engel, M., Lauster, S. y Jeske, H Nucleotide sequence evidence for the occurrence of three distinct whitefly-transmitted, Sida-infecting bipartite geminiviruses in Central America. Journal of General Virology 78: Gamez, R Los virus del frijol en Centroamerica. TransmisiOn por mosca blanca (Bemisia tabaci L.) y plantas hospedantes del virus del mosaico dorado. Turrialba 21: Garcia-Arenal, F., Fraile, A., y Malpica, J. M Variability and genetic structure of plant virus populations. Annu. Rev. Phytopathology 39: Gilbertson, R.L., Faria, J.C., Ahlquist, P., y Maxwell, D.P Genetic diversity in geminiviruses causing bean golden mosaic diseases: The nucleotide sequence of the infectious cloned DNA components of a Brazilian isolate of bean golden mosaic geminivirus. Phytopatho.l 83: Herrera, L., Guerra, 0., Ramos, P. L., Peral, R., Echemendia, A. L., Ramirez, N., Dorestes, V. y Oramas, P Detection of Cuban Tomato Yellow Leaf Curl Geminivirus (TYLCV) in infected plant and viruliferous whiteflies. Biotecnologla Aplicada 16 (4):

15 Hofer, P., Engel, M., Jeske, H. y Frischmuth, T Nucleotide sequence of a new bipartite geminivirus isolated from common weed Sida rhombifolia in Costa Rica. Journal General Virology 78: Lastres, N El virus del mosaico comun del frijol en Cuba. Ciencias de la Agricultura.10: LOpez-Salinas, E. Becerra, E. N El mosaico dorado del frijol: Mexico Sur. In:Morales, FJ (ed) Bean Golden Mosaic: 1994 Research Advances. CIAT, Palmira,Colombia, pp Lotrakul, P., Rodrigo, A., Valverde, A. y Landry, A. D Biological and molecular properties of a Begomovirus from Dicliptera sexagularis. Virology 90(7): Maniatis, T., Fritsch, E. F. Y Sambrook, J Molecular cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Martinez, Y., de Blas, C., Quinones, M., Castellanos, C., Peralta, E. L., y Romero, J Havana tomato virus, a new bipartite geminivirus infecting tomatoes in Cuba. Arch. Virology 143: Martinez, Y., Quinones, M., Fonseca, D., Potter, J. y Maxwell, D First report of Tomato yellow leaf curl virus associated with bean, Phaseolus vulgaris, in Cuba. Plant Disease. 86: 814. Ministerio de Economia y PlanificaciOn Morales, F. J El mosaico dorado y otras enfermedades del frijol comun causadas por geminivirus transmitidos por mosca blanca en America Latina. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Palmira, Colombia. Murguido, C. A Manual sobre manejo integrado de plagas, enfermedades y malezas en el cultivo del frijol. Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Ministerio de la Agricultura, Ciudad Habana, Cuba. Padidam, M., Sawyer, S. y Fauquet, C. M Possible emergence of geminiviruses by frequent recombination. Virology 265: Pierre, R Observations on the golden mosaic of bean (Phaseolus vulgaris)prophete, E Haiti. In: Morales F. J. (ed), Bean golden mosaic: 1994 research advances. CIAT, Palmira, Colombia, pp Ramos, P. L., Guerra, 0., Peral, R., Oramas, P., Guevara, R. G. y Rivera-Bustamante, R Taino tomato mottle Virus, a new bipartite geminivirus from Cuba. Plant Disease 81:1095. Ramos, P. L., Guevara-Gonzalez, R.G., Peral, R., Ascencio-Ibannez, Polston, J. E., Arguello- Astorga, G.R. y Rivera-Bustamante, R.F Tomato mottle Taino Virus pseudorecombines with PYMV but not with ToMoV- Implications for the delimitation of cis- and trans-acting replication specificity determinants. Archives of Virology 148: Rodriguez, 0 y Faure, B (ComunicaciOn personal) Roig y Mesa, J. T Diccionario Botanic de nombres vulgares cubanos. EstaciOn Experimental AgronOmica de Santiago de las Vegas. Instituto Nacional de Reforma Agraria (INRA). Tercera edicion ampliada y corregida.

16 Rojas, M. R., Gilbertson, R. L., Russell, D. R., Maxwell, D. P Use of degenerate primers in the Polimerasa chain reaction to detect whitefly transmitted geminiviruses. Plant Disease 77: Roossinck, M. J Mechanisms of plant virus evolution. Annu. Rev. Phytopathol. 35: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY. Sanford, J.C.; Smith, F. D. y Russel, J.A Methods Enzimology. Sanger, F., Nick len, S. y Coulson, A. R DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 24: Schieber, E Enfermedades del frijol (Phaseolus vulgaris) en la Republica Dominicana.Turrialba 20: Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matriz choice. Nucleic Acids Research, 22: Vazquez, L CaracterizaciOn del polimorfismo de la mosca blanca Bemisia argentifolii Bellows and Perring (Homoptera:Aleyrodidae). Fitosanidad 3 (2): Wu, Z. C., Hu, J.S., Polston, J. E., Ullman, D. E. y Hiebert, E Complete nucleotide sequence of a nonvector-transmissible strain of Abutilon mosaic geminivirus in Hawaii. Mol. Plant Pathol. 86(6):