Instituto de Investigaciones del Tabaco, Carretera Tumbadero km 8½, San Antonio de los Baños, La Habana, Cuba. 2

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1 CUBA TABACO Vol.8, No.1, 2007 SISTEMA DIAGNÓSTICO, BASADO EN EL EMPLEO DE PCR-RFLP PARA LA IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE TOBACCO LEAF CURL CUBA VIRUS, BEGOMOVIRUS QUE INFECTA NICOTIANA TABACUM Yunior Miguel Morán Gómez 1 *, Pedro Luís Ramos Gónzález 2, Milagro de la Caridad Domínguez Molina 1 y José Andrés Crespo Romero 1 1 Instituto de Investigaciones del Tabaco, Carretera Tumbadero km 8½, San Antonio de los Baños, La Habana, Cuba. 2 Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. Ave 31 e/158 y 190, Ciudad de La Habana, Cuba. * yunior.moran@iitabaco.co.cu RESUMEN Con la finalidad de desarrollar una metodología para el diagnóstico de Tobacco leaf curl Cuba virus (TbLCCuV), wue que se emplearía masivamente en estudios epifitiológicos de este begomovirus en el cultivo del tabaco, se estudiaron dos métodos basados en el análisis de los ácidos nucleicos virales. Para el ensayo tipo Dot Blot se elaboró una sonda no radiactiva a partir de un fragmento de 483 paraes de base (pb), el cual contenía la región común de TbLCCuV que teóricamente reconoce, con porcentajes bajos entre 55,3 y 74,8%, a las secuencias de algunos begomovirus que circulan en el país diferente de TbLCCuV. La hibridación se realizó en condiciones restrictivas. En el ensayo tipo PCR-RFLP, primeramente se realizó un estudio teórico de las secuencias de los begomovirus que circulan en el país para obtener los patrones de corte teórico y luego, se comprobaron estos patrones para tres de los nueve begomovirus estudiados. En el ensayo tipo Dot Blot se obtuvo que la sonda elaborada partir de la región común de TbLCCuV, resulta en la práctica, incapaz de diferenciar a TbLCCuV de otros geminivirus que circulan en el país. En el ensayo tipo PCR-RFLP se determinó que la elección de los pares de enzimas EcoR I / Pst I, EcoR I / EcoR V, o EcoR I / Nde II, son complementos adecuados de la digestión con Sac I, para obtener perfiles de fragmentos que diferencian a TbLCCuV, entre todos los geminivirus que circulan en el país, por lo que se recomienda este ensayo para realizar los estudios epifitiológicos de este virus. Palabras claves: tabaco, begomovirus, TbLCCuV, Dot Blot, PCR-RFLP, diagnóstico. ABSTRACT A PCR-RFLP BASED DIAGNOSTIC SYSTEM TO RAPIDLY IDENTIFY TOBACCO LEAF CURL CUBA VIRUS, A BEGOMOVIRUS INFECTING NICOTIANA TABACUM. In order to develop a methodology to Tobacco leaf curl Cuba virus (TbLCCuV) diagnosis, which can be used in epiphitiologic studies of this begomoviruses in the tobacco crop, two diagnosis systems, based on viral nucleic acid analyses were assayed. In the Dot Blot test, a probe constituted by a fragment of 483 pb that contained the TbLCCuV s common region was obtained. The theoretical bioinformatic analysis showed that the probe recognize, with percentages between 55,3 and 74,8 %, the 14

2 Vol.8, No. 1, 2007 CUBA TABACO sequences of the begomoviruses that circulate in the country. Therefore, this test was able, theoretically, to differentiate the studied geminiviruses. The hybridization was carried out in restrictive conditions. Using PCR-RFLP assay, a theoretical study of begomoviruses sequences that circulate in the country, was conduced to obtain the restriction profiles. Three from nine analysed begomoviruses were tested. In the Dot blot assay, it was determined that the elaborated probe from the TbLCCuV s common region, it wasn t able to differentiate TbLCCuV of other geminiviruses that circulate in the country. Through PCR-RFLP test, the enzymatic pairs combination EcoR I / Pst I, EcoR I / EcoR V and EcoR I / Nde II, was an adequate complement to the Sac I digestion. It was obtained profiles, which permit to differentiate TbLCCuV from others geminiviruses that circulate in the country. Finally, we recommended the PCR-RFLP assay to develop the TbLCCuV diagnosis in Nicotiana Tabacum L. Key words: tobacco, begomovirus, TbLCCuV, Dot Blot, PCR-RFLP, diagnostic. INTRODUCCIÓN La identificación, mediante técnicas moleculares de diagnóstico, de dos begomovirus denominados Tobacco leaf rugose virus (TbLRV) y Tobacco leaf curl Cuba virus (TbLCCuV), en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.) afectadas con síntomas de rugosidad foliar entre el 2002 y el 2004, respectivamente, confirmó la sospecha de que virus pertenecientes a la familia Geminiviridae son los agentes causales de tales desordenes e inutilizan las hojas para los torcidos de exportación (Domínguez et al., 2002; Morán et al., 2006). Dada la importancia del cultivo del tabaco para la agricultura nacional, la búsqueda de mecanismos para contrarrestar la emergencia de los begomovirus, constituye una prioridad. Para ello, resulta necesario conocer las relaciones ecológicas en las que están involucrados estos agentes, mediante un estudio epifitiológico de los nuevos aislados que circulan en el país. Un paso importante en este camino es disponer de un sistema diagnóstico que facilite los estudios de incidencia y distribución de estos agentes. La metodología diagnóstica que se empleó para la detección, caracterización e identificación de TbLCCuV se basó en el clonaje y la secuenciación del componente A de este begomovirus (Morán et al., 2006). Esta metodología, a pesar de ser la más precisa para el diagnóstico, no se puede emplear para realizar estudios epifitiológicos porque implica procesar muchas muestras y el tiempo requerido para ello es relativamente largo y los costos de su implementación serían muy altos. Los métodos de diagnóstico inmunológico, más procesativos y adecuados para estudios epifitiológicos, no se han desarrollado con mucha fuerza para los geminivirus, dado a la baja y moderada antigenicidad de las proteínas de la cápside (CP) y los bajos recobrados de CP en plantas infectadas que dificultan obtener anticuerpos con alta calidad y especificidad (Harrison, 1985; Harrison, 1991). En la literatura aparecen trabajos que describen, con buenos resultados, métodos de diagnóstico de geminivirus basados en análisis de ácidos nucleicos, preferentemente los que tienen su fundamento en la hibridación del ADN con sondas (Navot et al., 1991; Herrera et al., 1999; Rodríguez et al., 2003). Sin embargo, Rodríguez et al. (2003) desarrollaron una sonda específica de 500 nt de longitud (toda la región intergénica y hasta el 5 terminal del gen de la CP de TYLCV) 15

3 CUBA TABACO Vol.8, No.1, 2007 para el diagnóstico de TYLCV, aprovechando para ello los bajos porcentajes de identidad de la mencionada región de este virus con su homóloga de los que circulan en el país y condiciones de hibridación muy restrictivas. El diagnóstico mediante hibridación de ácidos nucleicos es relativamente barato y muy procesativo, por lo que se perfila como una buena opción para emplearlo en estudios epifitiológicos masivos. Otra técnica que ha sido empleada en el estudio de geminivirus es el análisis del polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP), el cual se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos (Accotto et al., 2000). Este trabajo tiene como objetivo desarrollar un método diagnóstico basado en el análisis de ácidos nucleicos virales que permita Fig. 1. Diagrama teórico de la secuencia del componente A de TbLCCuV. detectar y diferenciar confiablemente a TbLCCuV de otros geminivirus que circulan en el país. MATERIALES Y MÉTODOS Para realizar el experimento los trabajos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Virología de la división de plantas del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, perteneciente a la provincia Ciudad de La Habana, en el Desarrollo del diagnóstico molecular basado en la hibridación de los ácidos nucleicos Diseño de la sonda El diseño de la sonda se realizó a partir del diagrama del componente A de TbLCCuV, elaborado mediante el empleo del programa Vector NTI 6.0 Copyright InforMax, Inc. Y se tomó la secuencia completa de este componente que se encuentra depositada en la base de datos internacional GenBank, con el número de acceso AM (Fig. 1). Se muestra el total de pares de bases, los sitios de corte para las enzimas de restricción, los sitios de unión de los cebadores degenerados para geminivirus y los porcentajes de reconocimiento de la secuencia viral (Rojas et al., 1993). Las flechas curvas indican los productos de la expresión del genoma para las proteínas: Rep (Replication Associated Protein), TrAP (trans-activator Protein) REn (Replication Enhancer Protein) y CP (Core Protein). 16

4 Vol.8, No. 1, 2007 Ensayo teórico de especificidad de la sonda diseñada El análisis bioinformático de las secuencias obtenidas del GenBank, pertenecientes al genoma de virus que circula en el país, para determinar el porcentaje de identidad teórico con la secuencia de la sonda diseñada se realizó mediante el programa Vector NTI 6.0 Copyright InforMax, Inc. Los números de acceso de las secuencias empleadas en el ensayo fueron: -Tomato yellow leaf curl virus-[cuba], No. AJ223505; -Tobacco leaf rugose virus, No. AJ488768; -Bean golden yellow mosaic virus, No. AJ544531; -Tomato mottle Taino virus, No. AF Obtención del fragmento de ADN que se va a emplear como sonda Para obtener el fragmento que se va a emplear como molde para la confección de la sonda, se procedió a digerir, con las enzimas de restricción Pst I y Nco I, un clon que contenía el fragmento de interés del componente A de TbLCCuV. Los productos de la digestión con la enzima Nco I fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa de baja temperatura de fusión al 0,8 %. Se purificó la banda de aproximadamente 884 pb, que más tarde fue digerida con la enzima Pst I, se obtuvieron dos fragmentos que fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 0,8 %. Se purificó el fragmento de alrededor de 483 pb, para ser empleado como molde en el marcaje de la sonda. Preparación de las muestras para el ensayo tipo Dot blot Los fragmentos de ADN viral que se emplearon en el estudio fueron: -Tobacco leaf curl Cuba virus (TbLCCuV) - ADN A. aprox. 1,4 kpb desde el extremo 5' de la Rep hasta el 5' CP-. CUBA TABACO -Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) -ADN A. aprox. 1,4 kpb desde el extremo 5' de la Rep hasta el 5' CP-. -Tobacco leaf rugose virus (TbLRV) -ADN A. aprox. 1,4 kpb desde el extremo 5' de la Rep hasta el 5' CP-. -Tomato yellow leaf curl virus (Cuba) (TYLCV-Cuba) -Dímero viral-. -Tomato mottle Taino virus (ToMoTV) -ADN A. aprox. 1,4 kpb desde el extremo 5' de la Rep hasta el 5' CP-. Todos los extractos de ADN fueron gentilmente donados por el Dr. Ramos, del Laboratorio de Virología de la división de plantas del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. Los extractos de ADN fueron diluidos en 50 μl TE 1X (Tris-HCl 10 mm, ph 8; EDTA 10 mm), calentados durante 5 min a 100 ºC e incubados a 4 ºC hasta que fueron usados. Cada muestra de veinte μl fueron aplicados en la membrana de nitrocelulosa Hybon- N+ (Amersham Pharmacia Biotech, USA), por medio del dispositivo comercial de transferencia (Hybri-Dot manifold, Gibco, USA). El ADN fue fijado a la membrana mediante su exposición a la luz ultravioleta (en un crosslinker device comercializado por Amersham Pharmacia Biotech, USA). Por cada muestra fueron transferidos a la membrana de nitrocelulosa 100 ng de ADN. Procedimiento de marcaje no radiactivo La reacción de marcaje se realizó con 50 ng del ADN molde y se usaron los componentes y las metodologías descrita en Gene Imagen Random Prime Labeling Kit (Amersham Pharmacia Biotech, USA). La sonda obtenida fue conservada a -20 ºC para su posterior empleo. Hibridación no radiactiva del ácido nucleico y detección de la señal Las condiciones de hibridación y detección del ácido nucleico fueron realizadas de acuerdo con las especificaciones del Gene Imagen Random Prime Labeling Kit 17

5 CUBA TABACO Vol.8, No.1, 2007 (Amersham Pharmacia Biotech, USA). La hibridación se efectuó durante un período de 16 a 18 h a 65 ºC. Posteriormente, se le realizaron a la membrana dos lavados a 65 ºC, el primero con 1X SSC (NaCl 3 M, citrato de sodio 0,3 M, ph 7) por 15 min. y el segundo con 0,5X SSC (NaCl 3 M, citrato de sodio 0,3 M, ph 7). Desarrollo del diagnóstico molecular basado en el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción de las secuencias amplificadas (RFLP). Ensayo teórico de restricción El análisis bioinformático de las secuencias obtenidas del GenBank, pertenecientes al genoma de virus que circula en el país, se realizó con el empleo del programa Vector NTI 6.0 Copyright InforMax, Inc. Los números de acceso de las secuencias empleadas en el ensayo fueron: -Tomato yellow leaf curl virus-[cuba], No. AJ Macroptilium yellow mosaic virus-[cuba], No. AJ Tobacco leaf rugose virus, No. AJ Bean golden yellow mosaic virus, No. AJ Dicliptera yellow mottle virus, No. AJ Tomato mosaic Havana virus-[quivican], No. Y Tomato mottle Taino virus, No. AF Sida golden yellow vein virus, No. AJ A cada begomovirus se le determinó el sitio de unión de su secuencia con las de los cebadores degenerados de María Rojas PAL1v1978 PAR1c715 (Rojas et al., 1993) y al fragmento obtenido se le realizó un análisis teórico de restricción. Las 10 enzimas elegidas arbitrariamente para el ensayo fueron: Hind III, Nde I, Nde II, Eco R I, Eco R V, Nco I, Pst I, Sac I, Ssp I y Xba I. Comprobación experimental del análisis de restricción teórico Para la comprobación experimental del análisis teórico realizado a los virus se realizó una amplificación de los extractos de ADN viral de Macroptilium yellow mosaic virus - [Cuba], y de Tomato mottle Taino virus. Se empleó la pareja de cebadores degenerados PAL1v1978 PAR1c715 (Rojas et al., 1993). La mezcla de reacción se preparó en un volumen de 25 ìl. La amplificación se realizó en un equipo MJ Research Termocycler (Watertown, Massachusetts) con el programa siguiente: desnaturalización 1 min. a 94 ºC, hibridación 1 min. a 42 ºC, polimerización 3 min. a 72ºC, durante 35 ciclos. Los productos amplificados se digirieron con enzimas de restricción en las condiciones referidas por los fabricantes. Los productos obtenidos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % con 1ìL/mL bromuro de etidio. En el caso de TbLCCuV se empleó directamente en la digestión el clon que contenía el fragmento de alrededor de pb, correspondiente a la región de interés. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Desarrollo del diagnóstico molecular basado en la hibridación de los ácidos nucleicos Identificación del fragmento que se va a emplear como sonda Entre el codón inicial del gen de la proteína Rep y el codón inicial del gen de la proteína CP del componente A de los geminivirus bipartitos se encuentra la región intergénica. Esta región contiene una secuencia nucleotídica de alrededor de 200 pb, conocida como región común, que es específica para cada especie de begomovirus e idéntica en los dos componentes (A y B) de los begomovirus bipartitos (Arguello-Astorga et al., 1994). Dado a que las mayores diferen- 18

6 Vol.8, No. 1, 2007 cias nucleotídicas entre begomovirus de diferencies especies se deben de encontrar en esta región, se decidió elaborar la sonda específica para el diagnóstico de TbLCCuV con el empleo de esta zona. Los cortes realizados con las enzimas de restricción Pst I y Nco I sobre el clon empleado, permitieron obtener un fragmento de aproximadamente 483 pb. Estas enzimas fueron eligidas porque mediante un procedimiento sencillo era posible obtener el fragmento que contenía la región común de este begomovirus bipartito. Ensayo teórico de especificidad de la sonda elaborada El análisis bioinformático del alineamiento de las secuencias existentes en el laboratorio, utilizando como referencia la secuencia del fragmento de aproximadamente 483 pb que se empleó como sonda, mostró que esta reconoce con porcentajes entre 55,3 y 74.8 % a las secuencias virales, por lo que teóricamente puede discriminar los geminivirus estudiados (Tabla 1). CUBA TABACO A (GenBank accession no. AF012300). Ensayo práctico de especificidad de la sonda elaborada Los resultados del ensayo tipo Dot Blot realizado a los geminivirus estudiados revelaron que la sonda reconocía, a pesar de las condiciones de alta restricción impuestas a la reacción, a los ADN virales estudiados, por lo que no puede ser utilizada para discriminar a los geminivirus que circulan en el país (Fig. 2). Carril 1, BGYMV; Carril 2, TbLRV; Carril 3, TYLCV; Carril 4, ToMoTV; Carril 5, TbLCCuV; Carril 6, planta sana. Fig. 2. Autorradiograma de los extractos de ADN de los begomovirus presentes en el país. Tabla 1. Análisis comparativo teórico del alineamiento de las secuencias de los geminivirus empleados en el ensayo de especificidad de la sonda obtenida de TbLCCuV. Las secuencias se alinearon contra la secuencia de la sonda. Como se esperaba, teóricamente los mayores porcentajes de identidad de la sonda se obtuvieron con ToMoTV, ya que la comparación de la región común (CR; 145 pb) de TbLCCuV reveló la mayor identidad (80,1%) con Tomato mottle Taino virus DNA- Como se puede observar en el carril 3, el ADN de Tomato yellow leaf curl virus (Cuba) es el que menos señal emite, en concordancia con su bajo porcentaje de identidad con la sonda; mientras que la señal más fuerte la emite Tomato mottle Taino virus, en correspondencia con su mayor porcentaje de identidad con la sonda. Resultados obtenidos por Font et al. (2005) 19

7 CUBA TABACO Vol.8, No.1, 2007 en España, revelan que el tabaco es un hospedero natural de Tomato yellow leaf curl virus, por lo que de existir una infección por este virus, el empleo de este método daría falsos positivos. Existe una posibilidad real de que los begomovirus que hasta hoy no han sido detectados en tabaco y sí en otros hospedantes, se puedan encontrar en un futuro en este cultivo, como lo demuestran los recientes reportes de estos virus en tabaco (Ascencio-Ibañez et al., 2002; Font et al., 2005). La probabilidad de encontrar un falso positivo, si se emplea esta sonda, se incrementa si la infección es por Tobacco leaf rugose virus, ya que este virus fue identificado en el tabaco cubano (Domínguez et al., 2002) y emite una señal muy marcada en el autorradiograma efectuado. Desarrollo del diagnóstico molecular basado en el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción de las secuencias amplificadas Ensayo teórico de restricción El ensayo teórico que se realizó con el programa informático, mediante la secuencia de Tomato mottle Taino virus DNA-A (GenBank accession no. AF012300), permitió estimar una longitud de aproximadamente pb para el fragmento que se amplifica con los cebadores degenerados, los cuales reconocen la secuencia en 90,8 y 89,2%. De igual forma, se determinó que las enzimas de restricción Eco R I, Nde I, Xba I y Pst I reconocen un único sitio de corte en la secuencia y generan dos fragmentos. Teóricamente se espera que, al digerir con Pst I, se genere un fragmento de aproximadamente 557 pb y otro de 815 pb. (Fig. 3). Enzimas de corte único en la secuencia: Xba I, Nde I, EcoR I; enzimas que realizan múltiples cortes: Nco I, Ssp I, Nde II. Los números entre paréntesis indican la posición relativa de los sitios de corte de cada enzima. Además se muestra en los extremos los sitios de unión de los cebadores degenerados empleados (PAL1v1978 PAR1c715) y sus respectivos porcentajes de reconocimiento de las secuencias. Fig. 3. Análisis bioinformático realizado a la secuencia parcial de Tomato mottle Taino virus. 20

8 Vol.8, No. 1, 2007 Este análisis también se realizó para el resto de las secuencias empleadas en el estudio y los resultados de los cortes teóricos con las enzimas elegidas fueron tabulados (Anexo 1). Comprobación experimental del análisis de restricción teórico El análisis de longitud de los fragmentos de restricción realizado al fragmento de aproximadamente pb de Macroptilium yellow mosaic virus (Cuba), obtenido por amplificación con los oligos degenerados PAL1v PAR1c715, coincidió con el análisis de restricción teórico realizado con el programa bioinformático al fragmento de secuencia de 1405 pb de este virus. En teoría se esperaba que las enzimas de restricción Pst I, EcoR I, Hinc II, Xba I y Bgl II produjeran fragmentos de aproximadamente pb; 348 pb pb; 348 pb pb; 187 pb pb y pb, respectivamente, y este fue el patrón de cortes que se obtuvo (Fig. 4). CUBA TABACO El análisis de longitud de los fragmentos de restricción realizado al fragmento de aproximadamente pb de Tomato mottle Taino virus, obtenido por amplificación con los oligos degenerados PAL1v PAR1c715, coincidió con el análisis de restricción teórico realizado con el programa bioinformático al fragmento de secuencia de 1372 pb de este virus. En teoría se esperaba que las enzimas de restricción Pst I, EcoR I, Hinc II, Xba I y Bgl II produjeran fragmentos de aproximadamente 557 pb pb; 348 pb pb; 326 pb pb; 187 pb pb y 208 pb pb pb, respectivamente. Este fue el patrón de cortes que se obtuvo (Fig. 5). 1, marcador de peso molecular 1kb ladder; 2, no digerido; 3, Pst I; 4, EcoR I; 5, Hinc II; 6, Xba I; 7, Bgl II. 1, no digerido; 2, Pst I; 3, EcoR I; 4, Hinc II; 5, Xba I; 6, Bgl II. MP, marcador de peso molecular 1kb ladder. Fig. 4. Electroforesis en el gel de agarosa al 0,8%. RCP y análisis de restricción del fragmento amplificado con los oligonucleótidos degenerados PAL1v PAR1c715 a partir del ADN extraído de M. lathyroides. Fig 5. Electroforesis en el gel de agarosa al 0,8%. RCP y análisis de restricción del fragmento de aproximadamente 1,4 Kpb amplificado con los oligonucleótidos degenerados PAL1v PAR1c715 a partir del ADN de ToMoTV. En la tabla 2 se puede observar que el análisis de restricción práctico realizado al fragmento de aproximadamente 1,4 Kpb amplificado con los oligonucleótidos degenerados PAL1v PAR1c715 a partir del 21

9 CUBA TABACO Vol.8, No.1, 2007 ADN total de Tobacco leaf curl Cuba virus, clonado en el vector pbluescript, coincidió con el análisis de restricción teórico (Fig. 6). Tabla 2. Comparación entre el patrón de digestión esperado por el análisis bioinformático de las secuencias ensambladas y el obtenido en el análisis de longitud de los fragmentos de restricción realizado a la banda clonada en el vector pbluescript Banda de aproximadamente pb amplificada con los oligos degenerados , con dos sitios Pst I que flanquean los extremos. La banda está clonada en el vector pbluescript de pb en el sitio Pst I del vector (Extremos pegajosos que se restituyen). Carriles 1 y 12, Marcador de peso molecular (1 Kb Plus Ladder, Invitrogen, UK); 2, EcoR V; 3, Pst I; 4, Nde I; 5, Nco I; 6, BamH I; 7, Nci I; 8, Hind III; 9; Cla I; 10, Hinc II; 11, Clon sin digerir. Fig. 6. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de los productos de la restricción realizado a la banda de aproximadamente pb amplificada con los cebadores , clonada en el vector pbluescript en el sitio Pst I. 22

10 Vol.8, No. 1, 2007 De acuerdo con los resultados de la digestión teórica de cada virus con diferentes enzimas de restricción, se estima que solamente la enzima Sac I genera patrones de restricción diferentes a TbLCCuV en la totalidad de las secuencias de los virus analizados, por lo que bastaría con realizar digestiones con esta enzima para poder discriminar a TbLCCuV de cualquiera de estos virus estudiados. Sin embargo, se debe emplear más de una enzima de corte, a pesar de que se eleva el costo del ensayo, para incrementar la precisión de la identificación del aislado en cuestión y la detención y diferenciación de un nuevo aislado muy similar al investigado. De este modo la elección de las parejas de enzimas EcoR I / Pst I, EcoR I / EcoR V o EcoR I y Nde II en otro, resultan ser complementos adecuados a la digestión con Sac I, ya que el empleo en conjunto de cada pareja de enzimas, además de Sac I, permite la diferenciación de TbLCCuV del resto de los begomovirus estudiados. La digestión solamente con Pst I y Nde II no esclarecería el caso de que se estuviera en presencia de Tomato mosaic Havana virus (Quivicán), por lo que no se recomienda que se empleen solas como complementos a la digestión con Sac I. El resto de las enzimas de restricción empleadas no tienen la misma capacidad para originar fragmentos que permitan diferenciar de forma conjunta la mayor parte de los virus, por lo que su introducción al ensayo de restricción no mejoraría mucho el resultado y sí encarecería más la investigación. CONCLUSIONES Se desarrolló un sistema diagnóstico basado en el análisis de restricción de los fragmentos amplificados del componente A del genoma de cualquier begomovirus con los cebadores degenerados de María Rojas. Se determinó que la elección de las enzimas CUBA TABACO Eco R I y Pst I en un caso o Eco R I y Nde II en el otro, resultan ser complementos adecuados a la digestión con Sac I,para obtener perfiles de fragmentos que diferencien a TbLCCuV, entre todos los geminivirus que circulan en el país. La sonda elaborada a partir del ADN de la región común de TbLCCuV, con mayor porcentaje de diferencia con otras especies de begomovirus, resultó, en la práctica, incapaz de diferenciar a TbLCCuV de otros geminivirus que circulan en el país. RECOMENDACIONES Aplicar la metodología diagnóstica obtenida al diagnóstico de TbLCCuV en las venideras campañas tabacaleras en todo el territorio nacional y en cultivos como la papa y el tomate. Desarrollar esta metodología para el diagnóstico de cada uno de los geminivirus presentes en el país de los que se tenga conocimiento de su secuencia nucleotídica y no se pueda emplear el diagnóstico inmunológico ni el que se basa en la hibridación de ácidos nucleicos. BIBLIOGRAFÍA Accotto, G., J. Navas-Castillo et al.: Typing of Tomato yellow leaf curl viruses in Europe. European Journal of Plant Pathology, 106: , Arguello-Astorga, G., E. Guevara- González et al.: Geminivirus replication origins have a group - specific organization of iterative elements: a model for replication. Virology, 203:90-100, Ascencio-Ibañez, J., G. Argüello-Astorga et al.: First report of Rhynchosia golden mosaic virus (RhGMV) infecting tobacco in Chiapas, México. Plant Disease, 86(6):692, 23

11 CUBA TABACO Vol.8, No.1, Domínguez, M., P. L. Ramos et al.: Molecular characterization of Tobacco leaf rugose virus, a new begomovirus infecting tobacco in Cuba. Plant Disease, 86(9):1050, Font, M. I., C. Córdoba y A. García: First report of tobacco as a natural host of Tomato yellow leaf curl virus in Spain. Plant Disease, 89: 910, Harrison, B. D.: Advances in geminivirus research. Annu. Rev. Phytopathol, 23:55-82, : Recognition and differentiation of seven whitefly-transmitted geminiviruses from India and their relationship to Africa cassava mosaic and Thailand mung bean yellow mosaic viruses. Ann. Applied Biology, 118: , Herrera, L., O. Guerra et al.: Techniques for detection of Tomato Yellow Leaf Curl Geminivirus (TYLCV) in infected plants and viruliferous whiteflies. Biotecnología Aplicada, 16: , Morán, Y. M., P. L. Ramos et al.: Tobacco leaf curl Cuba virus, a new begomovirus infecting tobacco (Nicotiana tabacum) in Cuba. Plant Patholog,y 55: 570, Navot, N., E. Pichersky et al.: Tomato yellow leaf curl virus: a whiteflytransmitted geminivirus with a single genomic component. Virology, 185: , Rojas, M. R., R. L. Gilbertson et al.: Use of degenerate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly-transmitted geminiviruses. Plant Disease, 77(4): , Rodríguez, R., P. L. Ramos et al.: Establishment of a non-radioactive nucleic acid hybridization technique for begomovirus detection. Biotecnología Aplicada, 20: ,

12 Vol.8, No. 1, 2007 CUBA TABACO Anexo 1. Análisis bioinformático de las secuencias de los geminivirus reportados en el país 0/ 1394 En cada celda se muestra, con números en negritas antes de la barra inclinada, la cantidad de cortes en la secuencia que es capaz de realizar la enzima en el fragmento viral, y los restantes números después de la barra inclinada, separados por dos puntos, las tallas de los fragmentos que se generan. Sombreados aparecen los patrones de cortes teóricos que resultan diferentes a TbLCCuV (en primera fila). 25