Memoria de Prácticas en Empresa

Transcripción

1 Memoria de Prácticas en Empresa Tamara Lechón Gómez Biotecnología, 3º

2 Introducción Este verano, durante los meses de julio y agosto (01/07/10-31/08/10) y tras cursar el tercer curso de la licenciatura de Biotecnología, he realizado las prácticas en empresa en el Centro de Investigación del Cáncer, gracias al convenio existente entre el CSIC y la Facultad de Biología de la Universidad de Salamanca. La elección de este centro y, en particular, del laboratorio del Dr. Rogelio González Sarmiento como lugar para la realización de dichas prácticas vino dada por la lectura de las interesantes líneas de investigación llevadas a cabo por dicho investigador y por la familiaridad con los objetivos y el método de trabajo de su grupo de investigación, tras haber cursado varias asignaturas impartidas por el Dr. González Sarmiento. En esta memoria se expone brevemente mi experiencia como alumna en prácticas en este centro. Entorno de trabajo El Centro de Investigación del Cáncer (CIC) está situado en el campus Miguel de Unamuno, en Salamanca. Este centro está formado por diversas unidades que corresponden bien al propio Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, o bien a unidades que proporcionan a los investigadores la tecnología necesaria. Este centro tiene carácter de Instituto Universitario Mixto y, como tal, está patrocinado por diversas entidades, como son la Universidad de Salamanca y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Está también reconocido como Centro Sanitario por la Consejería de Sanidad y Educación de la Junta de Castilla y León. El CIC nació en 1997, en base al modelo de los Comprehensive Cancer Center de Estados Unidos, con el objetivo de aglutinar a los mejores investigadores regionales y nacionales en la investigación sobre el cáncer, con vocación de ser referencia internacional. Podemos resumir los objetivos de este centro así: 2

3 1. Realizar investigación puntera en cáncer a nivel básico, clínico y aplicado. 2. Favorecer el transvase bidireccional de información entre la ciencia biomédica básica y la aplicada. 3. Constituirse como un centro científico de excelencia capaz de competir en igualdad de condiciones con otros centros internacionales. 4. Fomentar la conexión del CIC con redes telemáticas de investigación oncológica tanto nacionales como internacionales. 5. Potenciar la creación de valor que revierta en el bienestar social y el desarrollo económico a nivel regional y nacional. Debido al aspecto clínico de la investigación del laboratorio 14 del CIC, está unido con el departamento de Medicina Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Salamanca, ya que ambos están a cargo del Dr. González Sarmiento. Es en este departamento principalmente donde se han desarrollado mis prácticas. Rogelio González Sarmiento El doctor Rogelio González Sarmiento se licenció y doctoró por la Universidad de Salamanca en 1979 y 1985 respectivamente. Se especializó en Hematología y Hemoterapia en Desde esta fecha hasta que obtuvo la plaza de profesor titular del área de conocimiento de Medicina en 1989, gozó de numerosas becas: Becario Fulbright en el Lab. of Medicine and Pathology, Minneapolis Minnessota, USA desde 1985 a Becario de reincorporación en el Departamento de Medicina de la Universidad de Salamanca Becario EMBO en el Lab. of Molecular Biology, Cambridge Univ., UK, en Profesor Titular del área de conocimiento de Medicina Ha trabajado en el estudio de reordenamientos genéticos y caracterización de traslocaciones cromosómicas en neoplasias hematológicas y, posteriormente en la clonación y caracterización de nuevos genes implicados en tumorogénesis. Sus líneas de investigación: 3

4 1. Caracterización molecular de alteraciones del gen Ikaros en leucemias agudas linfoblásticas B. 2. Desarrollo de modelos animales portadores de anomalías del gen Ikaros. 3. Clonación y caracterización molecular del gen Aiolos humano. Estudio de su posible implicación en enfermedades. 4. Estudio de anomalías moleculares en cáncer de mama familiar y esporádico. 5. Estudio de anomalías moleculares en tumores del SNC. 6. Caracterización de alteraciones moleculares en sarcomas de partes blandas y en pseudomixoma peritoneal. 7. Estudio del gen PATCHED en basalioma y Síndrome de Gorlin. 8. Estudio de genes modificadores de la susceptibilidad al cáncer. Actividades realizadas Mi trabajo en laboratorio estuvo determinado por el miembro del equipo que el Dr. González Sarmiento designó para tutelarme, si bien es cierto que guarda relación con el del resto de investigadores del laboratorio. Éste ha consistido en el aprendizaje del diagnóstico genético de distintas enfermedades hereditarias, incluyendo el cáncer hereditario, y de las técnicas y actividades más habituales empleadas para ello. En particular, me he centrado en el gen PATCHED y su implicación en el síndrome de Gorlin, en los genes TSC1 y TSC2 implicados en esclerosis tuberosa, y en distintas enfermedades dermatológicas o de disfunción del colágeno, como son la ictiosis X o la osteogénesis imperfecta. Además, he asistido al investigador que me tutelaba en el inicio de la investigación por parte de este equipo de los genes NPHS1 y PKHD. Para ello me he basado en las siguientes técnicas: 1. Extracción de DNA 2. Amplificación de fragmentos de DNA por PCR 4

5 3. Análisis de heterodúplex 4. Secuenciación automática 5. Análisis bioinformático de las secuencias A continuación trato detalladamente estas actividades. 1. EXTRACCIÓN DE DNA La extracción de DNA es el paso básico en todo estudio genético, sea de carácter básico, clínico o aplicado. Permite obtener un DNA absolutamente puro, concentrado y fácil de manipular en subsiguientes técnicas. Se extrajo DNA genómico a partir de sangre periférica y tejido tumoral. En sangre periférica, las células nucleadas se aislaron mediante centrifugación repetida y lisis eritrocitaria con solución hipotónica (centrifugación de la sangre total en 50mL de ddh 2 O durante 30 minutos, 1500 rpm, a 4ºC). Tras la recuperación de la interfase creada y lisis de los glóbulos rojos con agua destilada, se lavaron las células mononucleadas en tampón Fornace (0.25M Sacarosa; 50mM Tris-HCl ph: 7.5; 25mM KCl; 5mM MgCl2) y se precipitaron mediante centrifugación a 580g durante 20 minutos. El botón de células nucleadas de la sangre se resuspendió en tampón Fornace a una concentración estimada de 5x10 6 células/ml, tras lo cual se añadió EDTA (ácido etilendiamino-tetraacético, concentración final 10 mm), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate, concentración final 1%) y Proteinasa K (Boehringer Mannheim, concentración final 50 µg/ml). La mezcla se incubó a 55 ºC durante 8-16 horas. Tras la incubación, se procedió a extraer DNA por el método de extracción con fenol y cloroformo, anteriormente descrito. Las muestras procedentes de tejido tumoral se homogeneizaron con un homogeneizador (Polytron System PT 1200 E; Kinematica AG). Entre 0.1 y 0.2 g de tejido se resuspenden en tampón Fornace, EDTA, proteinasa K y SDS, siguiendo el mismo procedimiento que para la extracción de DNA a partir de sangre periférica. 5

6 La muestra de DNA, se almacenó en tubos Eppendorf a -20ºC, con el fin de evitar tanto la degradación progresiva del DNA como su posible contaminación por microorganismos. PCR 2. AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA MEDIANTE La reacción en cadena de la polimerasa, PCR, es una técnica que permite replicar in vitro pequeñas cantidades de DNA entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurso de unas pocas horas. Se basa en la capacidad de la DNA polimerasa de sintetizar una cadena de DNA en sentido 5 3 a partir de dntps, un molde de cadena sencilla y una región de doble cadena, que se consigue mediante los oligonucleótidos cebadores o primers. Las reacciones de amplificación se realizaron con el producto comercial PCR Master Mix (Promega), y se llevó a cabo en un volumen de 20 µl: 10 µl de Master Mix; 8 µl de agua libre de nucleasas; 0.5 µl de cada oligonucleótido cebador (sentido y anti-sentido); y 1 µl de DNA obtenido por el método anteriormente descrito (concentración, medida por absorbancia, de 0,1-0,2 μg/ml). Como control, para asegurar que no existía contaminación y que las reacciones eran específicas para cada muestra de partida, se preparó una reacción conteniendo todos los reactivos antes citados excepto DNA molde. Todas las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador automático y la manipulación post-pcr se realizó en un laboratorio distinto de donde se llevó a cabo la extracción del DNA. Los programas de amplificación utilizados para las diferentes combinaciones de oligonucleótidos únicamente varían en la temperatura de anillamiento. PROGRAMA 95ºC, 5 min. (x1 ciclo) 95ºC, 1min.; 50-55ºC, 30 seg.; 72ºC, 1 min. (x35 ciclos) 72ºC, 10 min. (x1 ciclo) En las reacciones de PCR en las que no se obtuvieron productos de 6

7 amplificación se añadieron 0.5 μl de dimetil sulfóxido (DMSO), reactivo que facilita la separación de las dos cadenas de la doble hélice de DNA, debido a que rompe el apareamiento entre las bases. 3. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Estudia la migración de los fragmentos de DNA, cargados negativamente, en un gel de agarosa sometido a un campo eléctrico. La agarosa es un polisacárido cuyas disoluciones poseen la propiedad de mantenerse líquidas por encima de 50ºC y formar un gel semisólido al enfriarse. Microscópicamente, el gel es una matriz constituida por una trama tridimensional de fibras poliméricas embebidas en un medio líquido, que se opone al paso de las moléculas. El gel es pues el soporte que permite la migración diferencial por tamaño de los distintos fragmentos de DNA. Los fragmentos amplificados mediante PCR fueron separados por su tamaño mediante electroforesis en geles horizontales de agarosa al 2% (Gibco-BRL) preparados con tampón TBE (Tris M, ácido bórico M, EDTA 1.0 mm ph=8.3). El primer pocillo del gel se reservó para separar, en paralelo con las muestras a estudiar, un DNA marcador de tamaño conocido que corresponde con el DNA del fago ФX-174 cortado con la endonucleasa HaeIII. La electroforesis se llevó a cabo con una diferencia de potencial constante de 120 voltios durante minutos. Para monitorizar la migración del DNA en el gel utilizamos dos colorantes que se incluyeron en el tampón de carga: el xyleno cianol, que migra aproximadamente con los fragmentos de 5 Kb en un gel de agarosa al 0.8%, y el azul de bromofenol, que migra aproximadamente con los fragmentos de 0.5 Kb. Tras la electroforesis, los fragmentos amplificados se visualizaron en el gel de agarosa utilizando SYBR Safe (Invitrogen), similar al bromuro de etidio, aunque menos citotóxico, que actúa intercalándose entre las bases nitrogenadas del DNA y emitiendo fluorescencia al ser expuesto a la luz UV (254nm). Los resultados obtenidos fueron almacenados mediante un sistema de fotografía digital (Kodak DC40) acoplado a un programa informático de tratamiento de imágenes (Kodak Digital Science 1D). 7

8 4. ANÁLISIS MEDIANTE HETERODÚPLEX Los fragmentos amplificados fueron sometidos a análisis por heterodúplex siguiendo la técnica descrita por Orita, con algunas modificaciones (Orita, 1989). El gel fue teñido con nitrato de plata. El paso inicial del análisis por heterodúplex consiste en desnaturalizar el producto de PCR a 95º C y volver a renaturalizarlo, para permitir la formación de heterodúplex (apareamiento entre cadenas que difieren en su secuencia) en el caso de individuos heterocigotos (figura 1). Los heterodúplex y homodúplex de DNA migran de manera diferencial en geles de acrilamida, lo que permite la resolución de moléculas que difieren en un solo par de bases. Figura 1. Formación de heterodúplex tras la desnaturalización y posterior renaturalización del producto de PCR en un individuo heterocigoto. Los geles para electroforesis fueron hechos con MDE TM 2X (AT Biochem, Inc. USA), que es un polímero modificado derivado del vinilo. Se utilizaron las siguientes cantidades para preparar cada gel: agua destilada ml, formamida 99% 5.98 ml, etilenglicol 99% ml, TBE 10X ml, MDE TM 2X ml, TEMED (N, N, N, N Tetrametilendiamina) 36.8 µl, AMPS 25% 138 µl. La electroforesis se llevó a cabo a 180 voltios durante aproximadamente 21 horas (el tiempo varía dependiendo del tamaño del fragmento de PCR). Para la tinción de plata se utilizó el kit comercial DNA Silver Staining Kit de Amershan Pharmacia, con un volumen de 250 ml, siguiendo las instrucciones del comerciante. 8

9 Los fragmentos de PCR de un mismo exón de distintos pacientes, con distintos patrones de migración en el gel de acrilamida, fueron posteriormente secuenciados. 5. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA Para la preparación de las muestras se purificó el fragmento de PCR mediante el kit comercial High Pure Product Purification Kit de Roche. Se preparó una muestra con el oligonucleótido sentido y otra con el oligonucleótido antisentido con las siguientes concentraciones: 3 pmol de oligonucleótido de secuenciación y ng de producto de PCR, en un volumen final de 8 µl. La secuenciación automática se llevó a cabo en un secuenciador ABI 377 (Applied Biosystems) en el Servicio Central de Secuenciación de la Universidad de Salamanca. 6. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE DNA DE GELES DE AGAROSA Aunque normalmente la purificación del producto es un paso trivial, realizado directamente sobre la muestra sobrante de la monitorización en geles, en ocasiones aparecen bandas correspondientes a otros productos de PCR que son imposibles de eliminar incluso al llevar a cabo la PCR en condiciones restrictivas. Esto puede dificultar la secuenciación del fragmento de DNA de interés. En ese caso recurrimos a la purificación de la banda concreta que deseamos directamente del gel. Los productos amplificados mediante PCR y separados en geles de agarosa fueron aislados del gel y purificados mediante el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Después de fundir la agarosa a 55-60ºC durante 15 min en tampón de solubilización, se añadió sobre la columna cromatográfica a la que se une el DNA. Se incubó un minuto a temperatura ambiente, se centrifugó 1 min a rpm y se lavó con el tampón de lavado modificado con etanol, repitiendo estos dos pasos hasta tres veces, tras lo cual se dejó secar durante 5 min a temperatura ambiente. Seguidamente, se añadió tampón de elución y, tras una centrifugación de 5 min, se recogió la solución eluída, que contiene el DNA. 9

10 La concentración del DNA se determinó mediante espectrofotometría, midiendo la absorbancia a 260nm con un espectrofotómetro GeneQuant (Pharmacia). 7. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICOS DE LAS SECUENCIAS El análisis de las secuencias obtenidas se ha llevado a cabo usando diferentes programas informáticos. La lectura y tratamiento de las secuencias automáticas se llevó a cabo con ayuda del programa EditView ABI Automated DNA Sequence Viewer 1.0 (Perkim Elmer). El diseño de oligonucleótidos específicos para PCR o secuenciación se llevó a cabo con el programa Oligo 4.05 Primer Analysis Software (National Biosciences, Inc.). La identificación de posibles mutaciones en la secuencia se llevó a cabo con el algoritmo BLAST facilitado por el NCBI. La posterior distinción de estas mutaciones como patogénicas se llevó a cabo utilizando bases de datos especializadas cuando era posible. En caso contrario, se recurrió a la bibliografía disponible. Para la actualización bibliográfica y la obtención de las secuencias genómicas de los genes afectados se utilizó la base de datos PubMed de la National Library of Medicine y el sistema de bases de datos cruzadas abiertas Entrez del NCBI. 8. ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS Semanalmente se realiza una reunión de todos los miembros del equipo para exponer el progreso llevado a cabo en cada proyecto y los problemas surgidos durante la investigación, que se resuelven mediante un debate común. Además, si se inicia un nuevo tema o una nueva línea de investigación, se procede a explicar qué se estudia y la importancia de este estudio. Esto permite a todos los investigadores estar al tanto del trabajo global que se realiza tanto en el laboratorio 14 como en el departamento de Medicina Molecular. 10

11 Valoración personal Las prácticas en empresa me parecen un complemento formativo casi necesario para tomar contacto con el entorno laboral al que nos enfrentaremos en un futuro próximo. Me han permitido darme cuenta de la utilidad real de varias asignaturas impartidas en mi carrera que de otro modo podrían parecer accesorias. Éste ha sido el caso, por ejemplo, de la Bioinformática, que se ha convertido para cualquier investigador en una herramienta básica para trabajar con las enormes cantidades de información que genera el trabajo experimental. También han conseguido dar un nuevo enfoque a la carrera, en cuanto a qué se espera de nuestra formación y cómo los conocimientos adquiridos en ésta se traducen en un trabajo útil y tangible. He podido comprobar que los alumnos de esta facultad poseemos conocimientos relativamente amplios de Biología Molecular, lo que supone una ventaja en cuanto a la comprensión de las técnicas y experimentos realizados y, por tanto, se traduce en un mejor aprovechamiento de la estancia de prácticas. Además, las propias prácticas han contribuido a reforzar esos conocimientos, de manera que ahora estoy plenamente familiarizada con las técnicas de manipulación del DNA detalladas anteriormente. Esto me está facilitando el estudio de las asignaturas del actual curso académico. En cuanto al lugar elegido para la realización de las prácticas, he tenido la suerte de estar en un grupo de trabajo formado por gente con verdadera vocación por la investigación, que han tenido la paciencia necesaria para enseñarme cuanto estaba en sus manos y responder a mis preguntas sobre la variedad de sus actividades en el laboratorio, y que han sabido transmitirme el valor del trabajo en equipo y el entusiasmo por la investigación, por ardua que pueda ser en ocasiones. En definitiva, me ha parecido una experiencia muy positiva y muy recomendable para todos los compañeros de titulación. 11