Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018

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3 AGRADECIMIENTOS Elena Sukhacheva, Manager global Scientific Affairs Hematology; Beckman Coulter (Switzerland) Àngels Doñate, Beckman Coulter Barcelona Juan Gimeno, Beckman Coulter Barcelona

4 ALGORTIMOS DIAGNÓSTICOS

5 Primer paso analítico: Hematimetría Criterios de revisión y validación de hemogramas Datos hemograma OBJETIVO: identificar patología hematológica y observación del frotis de sangre periférica CytoDiff

6 75% Normal WBC Result WORK FLOW LABORATORIO HEMATIMETRÍA CBC/Diff Result Validation Reporting Abnormal WBC Result 25% Slidemaking Slide Staining 2% Manual Count Pathology Review Reporting Reporting

7 Marker CD36-FITC CD2-PE CD294-PE CD19-ECD CD16-PC5 CD45-PC7 Reactivo CytoDiff (6- marcadores, 5-colores) Cellular Expression Monocitos, ERIs, Plaquetas Linfocitos T, LGG (células NK), blastos LA-T Eosinófilos, Basófilos, Linfocitos T activados Linfocitos B, blastos LA-B Neutrófilos, Monocitos pro inflamatorios (anormales), linfocitos T/NK CD16-positivos Todos los leucocitos

8 El algoritmo CytoDiff propone una selección poblacional celular sencilla que facilita la interpretación de resultados. 13 histogramas secuenciales conforman el diagrama final reduciendo la complejidad. B-Cell Classifier Ba Classifier Non-WBC Classifier Eo Classifier Ne Classifier B Blast Classifier Mo Classifier Im Mo Classifier IG-EO Classifier Mo± Classifier LyT Classifier Ly ± Classifier BlastOther Classifier

9 From CD19 gate From LyT&NK gate From IG & Eo gate From CD36 gate From Mo gate

10 Morphological population Immunological populations Pathological populations

11 Region/Gate name Xt Xb Xn Xm T+ T- Mo+ Mo- T-Blasts B-blasts non-t and non-b Blasts Monoblasts Description CD16+ T and NK lymphocytes CD16-negative T and NK lymphocytes Pro-inflammatory monocytes (CD16+) Non-inflammatory monocytes (CD16-) Información en % y # de las poblaciones celulares leucocitarias detectadas

12 CytoDiff populations B ly = B-lymphocytes CD16 negative T/NK-lymphocytes CD16 positive T/NK lymphocytes Mo=Monocytes CD16neg + Monocytes CD16pos CD16pos SSChigh neutrophils Eosinophils Basophils CD16neg SSChigh immature granulocytes Blasts=B-cell precursor + T-cell precursor + Non B and non T precursor + Mono precursor Cytology populations Lymphocytes Monocytes Mature Neutrophils Eosinophils Basophils Immature granulocytes Blast cells Estos parámetros nos aportan: 1. Información adicional para el diagnóstico y tratamiento del paciente 2. Test de selección de patología como paso previo a paneles de citometria especializados 3. Inmunomonitorización (control celular de la sepsis, control inmunológico de la aplicación de drogas inmunosupresoras e inmunoterapia)

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17 en qué puede contribuir? Aporta información adicional de elevada especificidad en pacientes con sospecha de enfermedad hematológica; la Hematimetría suele ser el primer contacto del paciente con el proceso diagnóstico. En el seguimiento de pacientes con patología hematológica conocida; detección de células anormales y/o inmaduras. Complementar los algoritmos diagnósticos basados en reglas expertas de Hematimetria y ampliar/contrastar la información del frotis de sangre periférica.

18 El objetivo del estudio es comparar la identificación de células patológicas mediante la observación al microscopio óptico como método de referencia en el primer estadio diagnóstico en el laboratorio de rutina y la detección mediante citometría de flujo WBC-Diferencial Se han estudiado hasta el momento 500 pacientes en los que el análisis del frotis de sangre periférica es requerido (reglas expertas, algoritmos diagnósticos, alarmas internas y/o criterios numéricos del hemograma). Se han incluido también pacientes Hematológicos y Oncológicos en seguimiento.

19 Cuándo hacemos Cytodiff? Linfocitosis absoluta; linfocitosis relativa (valorar el hemograma con alarmas y gráficas) Monocitosis absoluta (valorar evolución, historia clínica del paciente) Pediátricos con alarmas y/o gráfico anormal Gráfico anormal (no separación poblaciones leucocitarias; mala distribución de las poblaciones) Pancitopenia Casos control

20 UTILIDAD DE CYTODIFF: RESULTADOS POR PATOLOGIA

21 VALORACIÓN INICIAL DEL ESTUDIO Estudiamos hemogramas de pacientes de Atención Primaria 5.5% aparece alarma Abnormal Lympho 1.2% aparece alarma Atypical Lympho 2% de las muestras presentan Linfocitosis absoluta (>4.500 células) Se realizan frotis por diferentes reglas expertas y algoritmos diagnósticos en un 3-5% del total de muestras.

22 GRUPO PACIENTES SOSPECHA SLP Estudio sobre 100 pacientes con sospecha de SLP (alarma, linfocitosis, gráficos) CONDICIÓN OBSERVADA LEUCOCITOSIS (>12.500X10 3 /µl) 55 LINFOCITOSIS RELATIVA (>45%) 73 LINFOCITOSIS ABSOLUTA (>4.5X10 3 /µl) MONOCITOSIS ABSOLUTA (>1.000X10 3 /µl) 40 LINFOCITOSIS Y MONOCITOSIS 36 ALARMAS EN EL HEMOGRAMA 78 ALARMA % Abnormal Lympho 60 Atypical Lympho 20 Blasts/Abnormal Lympho? 14 Blasts? 6 N (sobre 100 pacientes) 77 (Ẋ=11.6)

23 100 PACIENTES SOSPECHA DE SLP FSP PRUEBAS COMPLEMENTARIAS (INMUNOFENOTIPO, ASPIRADO MO, SEROLOGIA)

24 LINFOCITOSIS ALARMAS HEMOGRAMA GRÁFICOS ALTERADOS FROTIS SANGRE PERIFÉRICA PRUEBAS COMPLEMENTARIAS (INMUNOFENOTIPO, ASPIRADO MO )

25 Paciente de 65 años de edad, mujer, control por DM II linfocitosis progresiva de dos años de evolución y citología de aspecto reactivo en anteriores revisiones del frotis. En el hemograma: linfocitosis de 6x10 3 /µl; alarma Abnormal Lympho.

26 Linfocitosis absoluta citológicamente de aspecto maduro, con alguna célula de citoplasma abundante y de carácter probablemente reactivo. Escasas sombras celulares. Se recomiendan controles evolutivos.

27 CytoDiff, sugiere población de predominio T (CD19 débil) y algunas células NK. Inmunofenotipo básico SLP: 78% CD3, 14% CD19 y 7% CD56. BUENA CORRELACIÓN ENTRE CYTODIFF E INMUNOFENOTIPO (citología)

28 Paciente de 60 años de edad, varón, con amputación extremidad I Antecedentes de Hemorragia rectal auto limitada. Absceso periungueal. Ligero MEG e insomnio. Control ordinario en Medicina Familiar. En el hemograma: linfocitos de 1.1 x10 3 /µl; monocitosis de 15.2 x10 3 /µl; sin alarmas.

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32 Linfocitosis absoluta con monocitopenia; CYTODIFF con presencia de población de predominio B pero con cluster celular de morfología atípica, ausencia de monocitos. Inmunofenotipo SLP, población CD19 75%, CD4 68%, CD8 28% y CD3 13%. Monoclonal. ES NECESARIO AMPLIAR ESTUDIO INMUNOFENOTIPO SLP (TRICOLEUCEMIA).

33 Paciente de 41 años de edad, varón, sin antecedentes de interés. Acude a urgencias por fiebre y MEG de dos semanas de evolución. Motivo consulta: edemas en EEII. Leucocitosis con linfocitosis y monocitosis; alteración del gráfico de dispersión. Anemia y trombopenia. LEUCOCITOSIS+ANEMIA+TROMBOPENIA. Alarma Blasts?

34 LA (no B, no T)

35 HEMATOLOGICAL DISORDER BLASTS FLAG % BLASTS CELLAVISION AML SI 2 7 AML SI AML-QT SI 1,3 1,81 AML-QT SI 33,5 38,6 AML final QT NO 0 0 % BLASTS CYTODIFF AML DX SI 20 19,64 AML DX SI 45,5 35,29 SMD SI SMD SI 3 4 SMD NO 1 1 MPD-MF SI 1 1 MPD-MF SI 1 1 MPD-MF SI 1 1 MPD-MF SI MPD-MF SI 7 10 MPD-TE SI CORRELACIÓN CIFRA BLASTOS (MICROSCOPIO vs CYTODIFF).Existe buena correlación.los resultados son mejores a menor cifra de células

36 CYTODIFF ANTES? LINFOCITOSIS Abnormal Lympho Gráfico anormal CYTODIFF DESPUÉS? LINFOCITOSIS Abnormal Lympho Gráfico anormal CYTODIFF: CD19%= 2.34 NO BLASTOS???? PRUEBAS COMPLEMENTARIAS (INMUNOFENOTIPO, ASPIRADO MO )???? CYTODIFF: CD19%= 3.63 NO BLASTOS

37 CBC/Diff Result Normal WBC Result Abnormal WBC Result Remisol Middleware Validation 25% + Reflex CytoDiff Test Reporting Analyze on FC % CytoDiff Result 5% Manual Diff Pathology Review ETAPA INTERMEDIA Y COMPLEMENTARIA A LA REVISIÓN CITOLÓGICA DE LAS MUESTRAS PATOLÓGICAS 1%

38 LINFOCITOSIS Abnormal Lympho Gráfico anormal FROTIS SANGRE PERIFÉRICA 60 FSP SUGESTIVOS SLPC 30 FSP MORFOLÓGICAMENTE NORMALES (8 linfocitosis progresivas; control evolutivo) 4 FSP ASPECTO REACTIVO (1 paciente con Mononucleosis Infecciosa) 6 FSP SUGESTIVOS LGG (100) CYTODIFF CD19% >15: 40 PACIENTES CYTODIFF CD19% <15: 60 PACIENTES

39 CYTODIFF CD19% >15: 40 PACIENTES 40 SLPC 17? CYTODIFF CD19% <15: 60 PACIENTES 30 NORMALES 4 POBLACIÓN T+ 8 POBLACIÓN T/NK 1 LAM 43 PACIENTES 43 NO SLPC

40 INMUNOFENOTIPO CITOMETRIA: 48 SLPC TIPO B 8 SLP CD56 3 SLPT 1 LAM 4 LINFOCITOSIS POLICLONAL B (64 PACIENTES) 14? 8 SLPC CYTODIFF NORMAL PARA CD19% 2 MONONUCLEOSIS 1 MONOCITOSIS MADURA 1 TUMOR SÓLIDO 1 HIV 1GM-MM 30 LINFOCITOSIS MONOCLONAL B (LLC) 6 LINFOCITOSIS MONOCLONAL B NO LLC 3 TRICOLEUCEMIAS 2 LINFOMAS FOLICULARES 4 LEZM 3 LDCGB 2 SD SEZARY 1 SLPT

41 CONSIDERACIONES DE LA TÉCNICA X b 46.46% Blastos?

42 X b 41.46% Blastos?

43 POBLACIÓN CD2-94+ (25,24%) BASÓFILOS?

44 En conclusión: CYTODIFF permite incrementar la especificidad y ampliar la información del diferencial leucocitario del analizador hematológico en el diagnóstico de patología relacionada con esta serie. Se obtiene información útil en la orientación diagnóstica de muestras que deben ser analizadas por citometría de flujo específica, aportando mayor seguridad y objetividad a la citología del frotis de SP. El análisis de las muestras es sencillo y rápido por que su uso resulta ágil en laboratorios de Hematología de rutina.

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