REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS

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1 REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS EVALUACION EN LAS NEOPLASIAS INTRAEPITELIALES Y CÁNCER DE CUELLO UTERINO DE Ki67, p16, p53 Y VIRUS PAPILOMA HUMANO TESIS PRESENTADA ANTE LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS MÉDICAS TUTOR: Dr. Jorge García Tamayo Doctor en Ciencias Médicas AUTOR: M.E. Asmiria Arenas de Sotolongo Maracaibo Mayo -2010

2 ii EVALUACION EN LAS NEOPLASIAS INTRAEPITELIALES Y CÁNCER DE CUELLO UTERINO DE Ki67, p16, p53 Y VIRUS PAPILOMA HUMANO.

3 v DEDICATORIA A Dios Todopoderoso, por enriquecer día a día mi fe y darme la fortaleza y constancia en el camino recorrido. A mi esposo Mario, por su amor y dedicación y por ser el pilar fundamental para el logro de esta meta. A mis hijos, Marian y Mario Miguel, las razones más grandes de mi existir, por su amor y apoyo incondicional. A toda mi familia, en especial a mis padres, por su amor, comprensión y ayuda en todo momento. Al Dr. Jorge García Tamayo, mi apreciado Tutor, por su orientación y sabios consejos en la realización de este trabajo. A mis Amigas y compañeras Pierina y Melisse, por la amistad invaluable, el apoyo, comprensión y colaboración durante mis períodos de ausencia, contribución importante para el logro de esta meta. Asmiria Arenas de Sotolongo

4 vi AGRADECIMIENTO A Dios Nuestro Señor y a mi adorada Virgen de Chiquinquirá, por ser los guías espirituales de mi existencia. Al Dr. Jorge García Tamayo, por su valiosa colaboración y orientación para el logro de los objetivos planteados. Al Personal de BIMECA, por el apoyo constante y la colaboración desinteresada en la realización del trabajo. Al Personal del Laboratorio de Patología Molecular, por su colaboración y trato siempre amistoso y gentil hacia mi persona. A todas las personas, que de una u otra forma contribuyeron para que mi meta fuera alcanzada. A todos ellos Muchísimas Gracias! Asmiria Arenas de Sotolongo

5 vii Asmiria Arenas de Sotolongo. EVALUACION EN LAS NEOPLASIAS INTRAEPITELIALES Y CÁNCER DE CUELLO UTERINO DE Ki67, p16, p53 Y VIRUS PAPILOMA HUMANO Tesis presentada ante La Universidad del Zulia, Facultad de Medicina, para optar al grado de Doctor en Ciencias Médicas, Maracaibo - Venezuela, RESUMEN Se realiza una investigación cuyo objetivo es determinar, en Neoplasias Intraepiteliales Cervicales (NIC) y CA Epidermoide del cuello uterino, la expresión Inmunohistoquímica de actividad de proliferación celular, mediante Ki67 y p53, la oncogénesis viral a través de p16 INK4a y la asociación con infección por VPH, utilizando sondas de Hibridación In Situ para ADN-VPH de amplio espectro (WS) y de alto riesgo (AR). El estudio es de tipo retrospectivo, descriptivo, con diseño no experimental, transversal. La muestra está conformada por 72 biopsias de cuello uterino, obtenidas de los archivos del Laboratorio de Anatomía Patológica Bimeca, clasificadas como NIC1 18 casos (25%), NIC2 13 casos (18%), NIC3/CA In Situ 29 casos (40,3%) y CA Epidermoide 12 casos (16,7%). Previa confirmación del diagnóstico histológico, se aplica la técnica de inmunohistoquímica con los anticuerpos seleccionados y las sondas de hibridación in situ. Resultados: El inmunomarcaje positivo para Ki67, se expresa en un total de 38 casos (52,68%), de los cuales 5 casos (27,77%), corresponden a NIC1, y 5 casos a NIC2 (38,46%) mientras que 19 casos de NIC3/CA in situ (65,52%) fueron positivos, y en los casos de CA epidermoide, 9 fueron positivos (75,00%) lo cual señala un alto índice de proliferación celular y de potencial de progresión a lesión de mayor grado. El p16 INK4a demuestra resultados similares, con un incremento en los casos de NIC3/CA In situ y CA Epidermoide, con 55,17% y 66,66 % respectivamente, mientras que la expresión de p53 muestra moderada positividad para el inmunomarcaje en NIC1 (16,66%) y NIC 2 (15,38%), expresión igualmente moderada en Carcinoma Epidermoide (41,66%) y en NIC3/CA In Situ (31,03%). Mediante la técnica de Hibridación in situ, 54 casos (75%) del total de lesiones premalignas y malignas estudiadas, resultaron positivas para VPH de amplio espectro (WS) y de ellos, 33 casos (61.1%) resultaron positivos para VPH de alto riesgo (AR). Palabras Claves: VPH, NIC, Cáncer cervical, Inmunohistoquímica, Hibridación In Situ asmiriaar@gmail.com

6 viii Asmiria Arenas de Sotolongo. Evaluation in Cervical Intraepithelial Neoplasia (CIN) and Squamous Cell Carcinoma of the cervix, of Ki67, p16, p53 and Human Papillomavirus. Thesis presented before the Universidad del Zulia, Faculty of Medicine, to apply for the Doctor in Medical Science degree. Maracaibo Venezuela, ABSTRACT An investigation was performed to determine the immunohistochemical expression of cell proliferation with Ki67 and p53, viral oncogenesis through p16 INK4a and the association with Human Papillomavirus (HPV) in Cervical Intraepithelial Neoplasia (CIN) and Squamous Cell Carcinoma of the cervix, using In Situ Hybridization strands for Wide spectrum (WS) and High Risk (AR) HPV-DNA. The study was retrospective and descriptive with a non-experimental and transversal design. The sample was composed of 72-cervix biopsy specimens, from the files of the Anatomic Pathology Laboratory BIMECA, 18 cases (25%) classified as CIN 1, 13 cases (18%) as CIN 2, 29 cases (40.3%) as CIN 3/In Situ Carcinoma and 12 cases (16.7%) as Squamous Cell Carcinoma. An Immunohistochemical technique was performed, previous confirmation of the histological diagnosis, with the selected antibodies and In Situ Hybridization strands. Results: The positive immunostain for Ki67 was expressed in 38 cases (52,68%), 5 cases of CIN 1(27,77%) 5 cases of CIN 2 (38,46%),19 cases (65,52%) of CIN 3/In Situ Carcinoma, and 9 cases of Squamous Cell Carcinoma (75,00%), which determines a high cell proliferation and potential progression to a higher grade lesion. P16 demonstrated similar results, with an increase in cases of CIN 3/In Situ Carcinoma and Squamous Cell Carcinoma, with 55,17% and 66,66%, respectively, whereas the expression of p53 shows a low positive immunostain in CIN 1 (16,66%) and CIN 2 (15,38%), with an expression in Squamous Cell Carcinoma (41,66%) and in CIN 3/In Situ Carcinoma (31,03%). Through In Situ Hybridization techniques, 54 cases (75%), of the total malignant and pre-malignant studied lesions, turned out positive for wide spectrum (WS) HPV, and of these, 33 cases (61.1%) resulted positive for high risk (AR) HPV. Key Words: HPV, CIN, Cervix Carcinoma, Immunohistochemistry, In Situ Hybridization asmiria_ar@hotmail.com

7 ix INDICE DE CONTENIDO Pág. Frontispicio Veredicto Dedicatoria Agradecimiento Resumen Abstract Índice de Contenido Índice de Tablas Índice de Figuras iii iv v vi vii viii ix xi xii CAPITULO I: EL PROBLEMA 1.1 Planteamiento del Problema 1.2 Formulación del Problema 1.3 Objetivos de la Investigación General Específicos 1.4 Justificación de la Investigación 1.5 Consideraciones Éticas 1.6 Factibilidad y Viabilidad CAPITULO II: MARCO TEÓRICO 2.1. Bases Teóricas Factores Moleculares Pronósticos Inmunohistoquímica Marcadores Tumorales Utilizados Hibridación de ADN Viral 2.2 Hipótesis

8 x CAPITULO III: MARCO METODOLÓGICO 3.1. Tipo y Diseño de Investigación 3.2. Población y Muestra 3.3. Criterios de Inclusión y Exclusión Criterios de Inclusión Criterios de Exclusión 3.4. Materiales y Método 3.5. Técnica de Recolección de Datos y Elaboración del Instrumento 3.6. Técnica de Análisis de Datos CAPITULO IV: MARCO ADMINISTRATIVO 4.1. Recursos Humanos 4.2. Recursos Materiales 4.3. Recursos Institucionales 4.4. Recursos Económicos Financiamiento Costo total de la Investigación CAPITULO V: RESULTADOS CAPITULO VI: DISCUSIÓN CAPITULO VII: CONCLUSIONES CAPITULO VIII: RECOMENDACIONES REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ANEXOS Planilla de recolección de Datos

9 xi INDICE DE TABLAS Tabla 1. Diagnóstico Histológico de lesiones premalignas y malignas de cuello uterino.. 31 Tabla 2. Expresión inmunohistoquímica de la proliferación celular con la utilización de Ki Tabla 3. Determinación de la oncogénesis mediada por VPH mediante la expresión de p16 INK4a Tabla 4. Expresión inmunohistoquímica de p53, en lesiones premalignas y malignas de cuello uterino Tabla 5. Determinación mediante Hibridación in situ del ADN de VPH de Amplio Espectro (WS) 36 Tabla 6. Determinación mediante Hibridación in situ del ADN de VPH de Alto Riesgo (AR) Tabla 7. Tipificación mediante Hibridación in situ del ADN de VPH-AR (16,18, 31,33) en lesiones premalignas y malignas de cuello uterino... 39

10 xii INDICE DE FIGURAS Fig.1 Cuello uterino. Zona de transformación Exo y Endocervical. (H-E) Fig.2. Epitelio exocervical plano estratificado no queratinizado (H-E) Fig.3. Epitelio endocervical cilíndrico simple mucoso. (H-E) Fig. 4 Cambios Coilocíticos VPH (H-E) Fig.5 NIC1 VPH (H-E) Fig.6 NIC 2 VPH (H-E) Fig.7 Carcinoma in Situ VPH (H-E) Fig. 8 Carcinoma. Epidermoide. H-E 100X Fig. 9 Carcinoma Epidermoide. H-E 200X Fig.10 NIC1 Ki-67 (+) 100X

11 xiii Fig.11 NIC2 Ki-67 (+) 100X Fig.12 Carcinoma In Situ Ki-67 (+) 200X Fig.13 NIC2 P16 (+) 100x Fig.14 NIC3 P16 (+) 40x 34 Fig.15 NIC 3/CA IN SITU P16 (+) 40x 34 Fig.16 NIC1 P53 (+) 35 Fig.17 NIC2 P53(+) Fig. 18 VPH- WS (+) HINS Fig.19. VPH-AR.HINS Fig. 20. VPH-AR 16. HINS.. 38

12 xiv Fig. 21 VPH-AR 18. HINS 38 Fig. 22. VPH-AR 31. HINS 38

13 1 CAPITULO I EL PROBLEMA Planteamiento del problema El cáncer del cuello uterino sigue siendo el tumor maligno más común del tracto genital femenino en muchos países, persistiendo como un problema de salud aún sin resolver en el mundo. 1,2 Se trata de una neoplasia heterogénea, que se diagnostica con una alta frecuencia y se caracteriza por un mal pronóstico. En nuestro país, el cáncer del cuello uterino, también denominado cáncer del cérvix, es la neoplasia maligna más frecuente en el sexo femenino (17,77%), seguido por el cáncer de mama (15,71%) 2. A nivel mundial, el cáncer de cuello uterino ocupa el séptimo lugar entre todas las neoplasias malignas que afectan a ambos sexos. 3 Se ha descrito mayor incidencia en las mujeres con edades comprendidas entre los 40 y 50 años. 4 Las observaciones hechas en Italia en 1842 sobre la aparición de cáncer del cuello uterino con mayor frecuencia en mujeres casadas y raramente visto en monjas, fue la primera sugerencia hecha sobre la posibilidad de que un agente infeccioso fuera el responsable del cáncer cervical. 5 En 1971, en el VIII Congreso Latinoamericano de Patología, J. Nágel y E. Casale, demostraron con el microscopio electrónico la presencia de partículas virales en unas lesiones planas, blanco rosadas en el cuello uterino. Los médicos venezolanos Dr. José Trinidad Núñez Montiel, médico ginecólogo y el Dr. Jorge García Tamayo, médico anatomopatólogo, presentaron dos años después (1973) en el IX Congreso Latinoamericano de Patología, en un par de trabajos libres, evidencias inequívocas de la apariencia colposcópica, histopatología, cambios ultraestructurales e identificación por tinción negativa del virus del papiloma humano en lesiones de displasia y de cáncer del cuello uterino. 6,7 Los cambios citológicos de la infección con este virus fueron descritos posteriormente por Meisels y

14 Fortín 8 y por Puroloa y Savia 9 en Harald zur Hausen en 1991, demostró la presencia de las secuencias de ADN viral en el cáncer del cervix Unos años más tarde, Zur Hausen y algunos otros investigadores estudiaron la relación entre diversos tipos de VPH y la neoplasia cervical 11,12,13 hasta quedar firmemente establecido el hecho de que hasta el 70% de los casos de cáncer cervical están asociados a VPH de los tipos 16 y Por otra parte, con los nuevos métodos de biología molecular, los estudios de Nubia Muñoz y sus colaboradores en la Agencia Internacional para Investigación sobre el Cáncer (IARC) en Francia, han concluido que en 99.7% de todos los casos de cáncer cervical, el VPH es la causa necesaria para que estos tumores se desarrollen. 15 El análisis de las variables biológicas, puede ayudar a entender el comportamiento del cáncer y determinar su pronóstico. El interés que ha generado en los últimos años la búsqueda de sistemas adecuados para identificar la actividad proliferativa tumoral, ha proporcionado distintos métodos que han permitido establecer su importancia como marcador de pronóstico y su relación con otros parámetros clínicopatológicos. En general, tanto en el carcinoma de cérvix como en otras neoplasias, el alto índice proliferativo se asocia a mayor agresividad biológica 16. En la actualidad, las variables que se derivan de los estudios moleculares, empiezan a aportar una información y un conjunto de datos que pueden ayudar, junto a parámetros clínicos y anatomopatológicos, en la identificación de lesiones preneoplásicas de mayor riesgo, así como de pacientes con tumores con una alta probabilidad de desarrollar recidiva local y metástasis a distancia, confiriendo, por tanto, un peor pronóstico y sugiriendo la necesidad de una actitud terapéutica más agresiva. Uno de los más grandes progresos alcanzados por la medicina durante los últimos años, lo constituye el diagnóstico cada vez más precoz de los procesos neoplásicos que se desarrollan en el organismo humano, a través de estudios de Inmunohistoquímica y de Biología Molecular, lo que permite la aplicación de medidas profilácticas y terapéuticas eficaces.

15 3 Las infecciones por el Virus del Papiloma Humano (VPH) se caracterizan por presentar una expresión genética de tipo restringido y es esta la que ha permitido a estos virus oncogénicos evolucionar con la especie humana e intervenir en diferentes enfermedades. 17 La replicación viral múltiple con difusión de gran cantidad de copias de los viriones sin que se produzcan daños celulares aparentes, es un fenómeno muy particular del VPH; sabemos que los genes del VPH se encuentran en diversos epitelios del ser humano y que estos usualmente no se expresan en las células basales y parabasales para hacerse evidentes, solamente cuando las células epiteliales que van migrando hacia la superficie alcanzan cierto grado de maduración, y es en ese momento cuando se produce el ensamblaje y la integración de las partículas virales y se pueden detectar los viriones ultraestructuralmente. 18,19 El daño que éste fenómeno produce, se evidencia en las células superficiales que estaban ya destinadas a morir y que muestran cambios arquitecturales que han sido descritos desde hace muchos años, como son alteraciones nucleares y vacuolas perinucleares que son los llamados coilocitos. 20,21 El proceso de transformación neoplásica en un epitelio infectado por el VPH es puntual y está directamente inducido por los oncogenes E6 y E7 de los tipos de VPH de alto riesgo que producen inestabilidad cromosómica en las células basales y parabasales del epitelio involucrado. 22 Afortunadamente, estos cambios que dan inicio a la carcinogénesis, se producen ocasionalmente durante las infecciones con los diversos tipos de VPH de alto riesgo, cuya incidencia está asociada a factores geográficos y sociológicos bien estudiados. 23,24 A través de la Hibridación In Situ (HinS) con amplificación de la señal para virus de alto riesgo, utilizando sondas con tiramida biotinilada, hoy día es posible detectar secuencias de ácidos nucleicos virales tan pequeñas como una sola copia en los tejidos infectados con el VPH, lo cual hace de esta técnica un valioso instrumento para la investigación sobre la infección del epitelio cervical y la carcinogénesis viral. 25

16 4 El VPH está relacionado con diversos tipos de cáncer, el de cuello uterino es el más común en las mujeres de los países en vías de desarrollo y se calcula que alrededor de mujeres fallecen cada año en el mundo como consecuencia de esta neoplasia. 26 Ante la incidencia tan alta de la infección con el VPH y el conocimiento de que estas son persistentes, una de las preguntas que se plantea es cómo saber cuándo y cuáles de estas infecciones van a evolucionar hacia la transformación maligna?. Desde hace ya una década se sabe que la captura de híbridos II para el VPH es un método de muy alta sensibilidad y de especificidad precisa. 27 La frecuencia del VPH de alto riesgo en los casos de Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC)1, ha sido descrita como alta, en comparación con otros estudios de pequeñas series, donde no se encontró evidencia de infección por VPH. 28 Estudios previos en México habían demostrado hasta 33% de positividad en casos de NIC1, 29 habiéndose descrito presencia de VPH en más del 80% en casos de NIC 2 y NIC 3, particularmente en países en vías de desarrollo. 30,31,32 En un estudio más reciente, se examinó la edad de las pacientes con VPH de alto riesgo señalándose un incremento del virus en pacientes jóvenes, destacándose igualmente la relación de antecedentes familiares de cáncer de cérvix asociada a la presencia de VPH de alto riesgo. 33 No hay duda de que el largo lapso de tiempo que se establece entre las infecciones silentes con VPH de alto riesgo y la aparición de cáncer cervical supone diversos factores que deben interactuar en el proceso de transformación, entre los cuales se han descrito efectos hormonales, tabaquismo, inflamación crónica y diferencias genéticas. 34,35 Al utilizar la inmunohistoquímica y la hibridación in situ como métodos para la detección del VPH, proponemos en nuestra investigación, utilizar estos recursos examinados en los casos de NIC en etapas progresivas y de cáncer cervical.

17 5 En los últimos años, se ha estudiado el papel de las glicoproteínas de membrana y del p16 en el comportamiento biológico del epitelio cervical transformado por efecto del VPH de alto riesgo. 36 La investigación del efecto de la inactivación en los genes del epitelio cervical a través de la expresión de p16, una proteína que reacciona con más énfasis al producirse la inactivación del gen del retinoblastoma (Rb) por la proteína E7 del VPH, también se examinó con inmunohistoquímica en este proyecto. Hoy en día se considera que p16, p21, p53, la Ciclina D1 y Ki-67 pueden ser marcadores biológicos complementarios que ayuden a examinar la relación del VPH con la capacidad de invasión inicial del carcinoma cervical. 36,37 Nuestros conocimientos parecen estar lejos de descubrir los procesos íntimos del origen del cáncer del cérvix, sin embargo, estos estudios moleculares nos acercan más a los factores realmente implicados en la génesis del mismo. Mientras tanto, los programas de prevención, pesquisa y diagnóstico precoz constituyen la mejor arma que la medicina moderna puede ofrecer a las pacientes con lesiones premalignas en el cuello uterino. Por todo lo antes expresado, se plantean las siguientes interrogantes: Formulación del problema Es posible relacionar los cambios histopatológicos con el índice de proliferación celular y con la expresión de p53 en las biopsias de pacientes con diagnósticos histológicos de NIC, Carcinoma In Situ y Carcinoma epidermoide de cuello uterino? Es posible asociar la expresión inmunohistoquímica de la oncogénesis mediada por virus (VPH) a través del inmunomarcaje con p16 en las biopsias de pacientes con NIC, Carcinoma In Situ o Carcinoma Epidermoide de cuello uterino?

18 6 Se puede establecer una correlación entre la presencia de VPH de Amplio espectro (WS) y Alto Riesgo (AR) mediante la utilización de técnicas de Hibridación In Situ con las lesiones de NIC, Carcinoma In Situ o Carcinoma Epidermoide de cuello uterino? Objetivos de la Investigación Objetivo General Realizar el estudio histológico, inmunohistoquímico y con Hibridación In Situ para VPH en muestras de cuello uterino con diagnósticos histológicos previos de NIC, CA In Situ y CA Epidermoide Objetivos Específicos Confirmar los diagnósticos histológicos de NIC-VPH, CA In Situ y CA Epidermoide previamente realizados en las biopsias de cuello uterino seleccionadas para el estudio. Analizar la expresión Inmunohistoquímica de p16, Ki67 y p53 en los casos de NIC, CA in Situ y CA Epidermoide de las muestras estudiadas. Establecer la asociación entre VPH de Amplio Espectro (WS) y Alto Riesgo (AR), con las lesiones correspondientes a NIC, CA In Situ y CA Epidermoide de cuello uterino, en el grupo de casos estudiados, mediante técnicas de Hibridación In Situ.

19 Justificación de la Investigación El cáncer de cuello uterino es una enfermedad que siempre ha tenido una prevalencia significativa en Venezuela, con una elevada tasa de mortalidad, a pesar de la existencia de programas de pesquisa de cáncer de cuello uterino. La larga historia natural de la enfermedad y la existencia de lesiones preinvasoras fácilmente identificables, debieron haber hecho posible el éxito de la citología como el método único para el despistaje del cáncer cervical. Los nuevos avances experimentados en la lucha contra esta patología se basan en la detección precoz de las lesiones premalignas y la mejoría en la eficacia de terapias para etapas más avanzadas. Actualmente se intenta definir mejor los subgrupos de pacientes, tratando de individualizar al máximo la terapia y así optimizar el tratamiento en relación a calidad y tiempo de sobrevida (ej. preservar fertilidad en mujeres jóvenes). Un importante elemento de juicio, especialmente en etapas donde se plantea la alternativa de terapia médica y/o quirúrgica, sería la determinación de factores pronósticos. La detección temprana y el tratamiento de lesiones precancerosas pueden prevenir la progresión a cáncer de cuello uterino, sin embargo, la presencia de células anormales puede pasar desapercibida durante la revisión citológica y en estos casos, un grupo de pacientes con alteraciones citomorfológicas interpretadas como borderline o lesiones displasicas leves, pueden tener enfermedad de alto grado, identificada posteriormente por colposcopia y/o biopsia. En la actualidad, tanto en las displasias cervicales como en el Carcinoma In Situ se puede requerir el uso de métodos diagnósticos más actualizados. Uno de ellos es la técnica de Inmunohistoquímica, con la cual se puede llegar a evaluar la expresión de diversas proteínas dependientes de genes en el epitelio cervical, tales como p53, bcl2, p16ink4a, Ki-67, B-catenina, entre otras. 38 Por otro lado, las técnicas de sensibilidad y especificidad molecular que detectan el ADN-VPH y distinguen los tipos de VPH de alto riesgo, como PCR, Hibridación in situ (HIS) o captura de Híbridos (CH), en conjunto con la citología y/o biopsia cervical, permiten la detección temprana de lesiones premalignas

20 8 y malignas asociadas con VPH, así como la determinación de los tipos virales específicos, todo lo cual conlleva a mejorar la calidad en el tratamiento, evolución y seguimiento de las pacientes. 39 Desde el punto de vista teórico, al realizar estudios de Inmunohistoquímica en los casos revisados de NIC, Carcinoma in situ y Carcinoma epidermoide de cuello uterino asociados a la infección por VPH, pretendemos, con la ayuda de esta técnica y basándonos en diferentes parámetros histológicos y biológicos, precisar el pronóstico de la enfermedad. Con este trabajo, nos proponemos estudiar la expresión de p53, la oncogénesis viral a través de la expresión de p16 y la actividad de proliferación celular (Ki67) en relación con la presencia de Virus del Papiloma Humano (VPH), de Amplio espectro (WS) y Alto Riesgo (AR), en los casos de NIC, Carcinoma In Situ y Carcinoma Epidermoide. Las muestras provienen del Archivo de Biopsias de cuello uterino del Laboratorio de Anatomía Patológica Bimeca de la ciudad de Mérida. Desde el punto de vista práctico, se espera que la aplicación de los hallazgos de esta investigación, contribuya al desarrollo de estrategias para terapias específicas en cáncer del cuello uterino y conducir a la introducción progresiva de los análisis inmunohistoquímicos en la Unidad de Anatomía Patológica de la Universidad de Los Andes (ULA), para contar con una mejor y más exhaustiva información del diagnóstico y del pronóstico de la patología oncológica en general. Desde el punto de vista metodológico, la presente investigación deberá constituir una referencia informativa para posteriores investigaciones que estén relacionadas con el tema desarrollado. Desde el punto de vista social esperamos definir a mediano plazo dentro de nuestra comunidad, los grupos de riesgo que pueden beneficiarse para ser introducidos en un plan terapéutico más agresivo, ante la presencia de factores moleculares de riesgo, lo que se traducirá en una mayor supervivencia.

21 Consideraciones Éticas En cuanto a las consecuencias de la investigación, se considera que no existe daño a personas por cuanto no se manipuló la variable, además, se contó con la autorización de las instituciones implicadas en la realización de la misma. Por otra parte, se pretende brindar información confiable que conduzca en el futuro a la mejora de los servicios ofertados por los miembros del equipo de salud y de manera particular en el área de Anatomía Patológica Factibilidad y Viabilidad Para la realización del presente estudio contamos con el consentimiento de La Facultad de Medicina de la Universidad de Los Andes, a los fines de recopilar el material proveniente de los archivos de Biopsias del Laboratorio de Anatomía Patológica BIMECA de la ciudad de Mérida y del respectivo procesamiento de las mismas, aplicando las técnicas de Inmunohistoquímica y de Hibridación In Situ propuestas en la investigación y realizadas en el Laboratorio de Patología Molecular en la ciudad de Maracaibo, contando con recursos financieros y humanos bajo la supervisión y tutoría del Dr. Jorge García Tamayo. Así mismo, se diseñó un instrumento de recolección de información y el investigador dispuso de tiempo y recursos económicos necesarios para llevarla a cabo.

22 10 CAPITULO II MARCO TEÓRICO En el marco conceptual se revisaron las consideraciones generales sobre la neoplasia intraepitelial cervical (NIC), el carcinoma in situ y el carcinoma infiltrante del cuello uterino; aspectos importantes sobre la infección por Virus Papiloma Humano (VPH), conceptos de Inmunohistoquímica, y la descripción de los anticuerpos a utilizar, según el planteamiento establecido, así como la técnica de Hibridación molecular con sondas de ADN de VPH de Amplio espectro (WS) y de Alto Riesgo (AR) Bases Teóricas El cáncer de cuello uterino es el segundo en frecuencia en la población femenina mundial. Cada año se registran 500 mil nuevos casos de los cuales aproximadamente la mitad fallece por la enfermedad. Durante los últimos 50 años la tasa de incidencia y mortalidad del cáncer del cérvix ha venido descendiendo en la mayor parte de los países desarrollados, gracias fundamentalmente a la aplicación de programas de pesquisas (citología). 40 A diferencia de lo que ocurre en los países desarrollados, esta patología, ocupa el primer lugar entre los cánceres ginecológicos en países en vías de desarrollo y en zonas con niveles socio culturales bajos. En Venezuela, desde la década de los años cuarenta, el cáncer del cuello uterino es la primera causa de muerte por cáncer en la mujer. A pesar de algunas variaciones en la tendencia de la tasa de mortalidad que parecían haber mostrado un descenso en los 25 años anteriores a 1985, es preocupante el posterior repunte que se mantiene desde entonces por lo que, el cáncer del cuello uterino, sigue siendo la primera causa de muerte por cáncer en la mujer venezolana. 2,41 El cáncer de cuello uterino es responsable aproximadamente del 20% del total de las muertes por cáncer en Venezuela; los Estados Trujillo, Guárico, Yaracuy, Zulia,

23 11 Lara, Aragua, Mérida, Táchira, Bolívar y Falcón son las entidades federales más afectadas por esta patología, con tasas de mortalidad superiores al promedio nacional 41. Hasta fines de la década del 60, el grupo etario de mayor prevalencia se encontraba entre los 50 y 65 años, donde los factores de riesgo estaban vinculados a los de orden socioeconómico y a la multiparidad propia observada en las zonas rurales. Las causas que influyen en la aparición del cáncer de cuello uterino han sido objeto de estudio durante más de 150 años. Hacia principios del siglo pasado se marcó un importante avance en materia de diagnóstico cuando George Papanicolaou en 1924 publicó la técnica de tinción que permitiría detectar células cancerosas a partir del aspirado cervical y paralelamente en Alemania, Hans Hinselmann comenzó a desarrollar la colposcopía. 42 Los cánceres invasores del cuello uterino vienen precedidos generalmente por una larga fase de enfermedades pre-invasoras. Esto se caracteriza microscópicamente por una serie de manifestaciones que van de la atipia celular a diversos grados de displasia o Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC, o CIN según sus siglas en inglés) antes de progresar a carcinoma invasor, eventos recientemente ratificados por diversos investigadores. 43,44 Desde el punto de vista histológico, aproximadamente 85% de las neoplasias malignas del cérvix, son carcinomas de células escamosas llamados Carcinomas Epidermoides, precedidos por las lesiones intraepiteliales cervicales escamosas, también conocidas como Neoplasias Intraepiteliales Cervicales o NIC, y 10 a 15% corresponden a Adenocarcinomas. 45 La correlación de alteraciones citológicas e histopatológicas específicas con el curso clínico define el pronóstico con precisión y permite añadir a los tratamientos habituales nuevos adyuvantes que optimizan la terapéutica convencional. El desarrollo e investigación de nuevos factores pronósticos permiten una evaluación más integral de cada paciente y así se pueden plantear alternativas terapéuticas más adecuadas a cada

24 12 caso. En la actualidad, se han logrado importantes avances en sobrevida libre de progresión de la enfermedad en base a nuevos conceptos de tratamiento como en la individualización de éste; de manera que cada paciente reciba la alternativa más efectiva de acuerdo a su perfil clínico e histopatológico. 46 Los virus oncogénicos desempeñan un papel etiológico de extrema importancia en varios tumores malignos que afectan al hombre. Los estudios moleculares han examinado la relación entre las células epiteliales escamosas del cérvix y numerosas infecciones inducidas por los Virus Epstein Barr (VEB), Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV), Herpes Virus tipo II (VHS-2), Citomegalovirus (CMV) y, en particular y mayormente, por el Virus del Papiloma Humano (VPH). 47 Estudios de Biología molecular han demostrado la relación entre tipos específicos de VPH de alto riesgo (VPH16-VPH18), la neoplasia intraepitelial de cérvix y el carcinoma invasivo 48. En la neoplasia intraepitelial de alto grado y el carcinoma invasivo, el VPH está integrado en el genoma humano. En el % de los casos diagnosticados con cáncer de cuello uterino, se ha identificado el ADN transcrito y los productos proteicos del VPH. Se han aislado, secuenciado y clonado al menos 100 tipos de VPH y de ellos, 50 están asociados al tracto genital femenino. 49 Los VPH de tipo genital se clasifican en 3 tipos, de acuerdo con el potencial para provocar cambios malignos en el epitelio cervical: 1- De alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82), 2- de riesgo intermedio (26, 53 y 66), y 3- de bajo riesgo (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, y CP6108).Entre los virus de alto riesgo más conocidos, el 16 y el 18 se observan en 50% y en 20% de los casos de carcinoma epidermoide, respectivamente. No obstante, tan solo una minoría de los casos infectados con los VPH de alto riesgo se transformará en cáncer. 50,51 El VPH pertenece a la familia Papovaviridae, son virus que tienen una cápside con 72 capsómeros con el genoma del virus. Los capsómeros están compuestos por dos proteínas estructurales: L1 que forma el 80% de la partícula viral y L2 que es la proteína menor de los cápsidos, de kd. 52 El genoma es una molécula de doble

25 13 cadena de ADN organizada con 8 a 10 marcos de lectura abierta (ORFs) la cual es semejante para todos los VPH. El genoma está dividido en tres regiones: la región larga de control (LCR) que no tiene potencial para codificar, la región de las proteínas tempranas (E1-E8), y la región de las proteínas tardías (L1 y L2); las proteínas E1 y L2 son necesarias para la replicación extracromosómica del virus y existen para poder completar el ciclo vital del virus. 53 En la etapa no productiva, episomal, las células basales del epitelio llegan a formar hasta 200 copias del VPH con gran amplificación del genoma. Posteriormente se transcribirá el ARNm y se van a codificar las proteínas L1 y L2 de la cápside, cosa que se produce únicamente en las capas superficiales del epitelio y es allí donde se pueden comenzar a ver con el microscopio electrónico las partículas virales. La infección persiste en las células basales porque ellas no sufren cambios, no hay coilocitosis, no hay lisis celular, y ellas no son productivas. 54 Las oncoproteínas E6 y E7 de los VPH de alto riesgo son las que más se relacionan con p53 y con el gen del retinoblastoma (Rb) los cuales llevan a la hiperproliferación, inmortalización e inestabilidad genética del epitelio cervical, y conducen a la malignización asociada con los tipos de VPH de alto riesgo. 55 El mecanismo de apoptosis en el epitelio del cérvix es interferido por p53 y esto es influido por E6. Esta proteína del VPH (E6), actúa a través del bloqueo del ciclo celular por la cinasa dependiente de la ciclina p21 y Bax, proteína proapoptótica que puede ser degradada por E6 a través de la ubiquitina. En realidad sucede que algunas proteínas de los queratinocitos se unen al extremo C terminal de E6 y esto altera las uniones intercelulares, la polaridad y la división celular. 56,57 En cuanto a E7, su principal papel consiste en alterar el control del ciclo celular. La proteína E7 es principalmente nuclear y se sabe que su expresión está asociada al incremento de la síntesis del ADN celular y por tanto de la proliferación celular. Precisamente el efecto de la inactivación en los genes del epitelio cervical se ha

26 investigado a través de la expresión de p16, una proteína que se sobreexpresa al producirse la inactivación de Rb por la proteína E7 del VPH Factores Moleculares Pronósticos Numerosos estudios han abordado la estructura, el mecanismo de acción y el poder oncogénico de los diferentes tipos de VPH en el desarrollo de lesiones pre malignas y malignas del cuello uterino. Evidentemente, la influencia de un solo factor no transforma a una célula normal en una que prolifera sin restricción. Muchas evidencias indican que es necesario que sobre una célula sucedan de 3 a 7 eventos mutacionales independientes para que ocurra la transformación maligna. 59 La infección por VPH parece ser la "causa fundamental" en la génesis del cáncer de cérvix, sin embargo, sólo pocas mujeres infectadas desarrollan la enfermedad. La susceptibilidad genética a la infección por el VPH parece ser importante en determinar el riesgo individual de desarrollo viral del cáncer. 60 La habilidad de ciertos haplotipos de HLA son predisponentes a aumentar la susceptibilidad a la iniciación y persistencia de la infección por VPH y, por consiguiente, al desarrollo de tumores malignos en el cuello uterino. 61 La contribución de otros factores de riesgo asociados a la etiología de los tumores en esta localización no ha recibido la debida atención, teniendo en cuenta que sólo pocas mujeres infectadas con VPH desarrollan lesiones intraepiteliales de alto grado y Carcinoma in Situ. Hay otros factores que también pueden influir en el pronóstico de estos tumores. El tabaquismo se ha asociado con la presencia de carcinomas de células escamosas predominantes en el cáncer de cuello uterino, el de pulmón y el de laringe. Se ha propuesto la hipótesis de que los carcinógenos procedentes del consumo del tabaco, al ser trasportados por el sistema circulatorio y llegar al epitelio cervical, puedan iniciar o actuar como co-carcinógenos en las células ya afectadas por agentes transformantes posiblemente por transmisión venérea como el VPH y el Virus Herpes Simple tipo II. 62

27 15 Otro mecanismo atribuido a este factor para explicar su efecto en el cáncer de cérvix, es la inducción indirecta de inmunosupresión y la reducción de antioxidantes provenientes de la dieta. Sin embargo, actualmente se le da una importancia moderada a este factor pero se acepta que, junto a otros, aumenta 3 veces el riesgo de padecer la enfermedad comparado con las mujeres no fumadoras y se ha reportado que existe una fuerte relación dosis-respuesta. 63 La respuesta inmune está considerada como un potente mecanismo de resistencia al desarrollo de tumores, desde la fase de inicio hasta el crecimiento y progresión de los mismos. 64 La infección viral es común en pacientes con defecto de supresión en el S1 demostrado por linfopenia, alteraciones de la relación linfocitos B/ linfocitos T y disminución de la migración espontánea y quimiotaxis de los neutrofilos. 65 Las pacientes infectadas con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana muestran un incremento en la incidencia de lesiones intraepiteliales escamosas, debido a fallas en los mecanismos de la respuesta inmune con progresión de casos de NIC. Además, el comportamiento de los mecanismos efectores de la respuesta inmune en pacientes con lesiones del cuello uterino, varían según el estadio y el tipo de VPH que infecta el epitelio. 66 De acuerdo con lo publicado por la Agencia Internacional para investigaciones sobre el cáncer en 2003, la regresión de las lesiones inducidas por VPH está acompañada de una reacción característica de hipersensibilidad retardada dependiente de linfocitos T auxiliares (Th). 67 El uso de anticonceptivos orales por más de 5 años ha sido considerado como un cofactor que incrementa 4 veces el riesgo de padecer cáncer de cérvix en mujeres portadoras de VPH. Otro hallazgo de las investigaciones epidemiológicas expone que tras un diagnóstico de displasia, la progresión a Carcinoma in Situ es más rápida en aquellas mujeres que consumen anticonceptivos orales. 68,69 Existen varios mecanismos por los cuales las hormonas sexuales (estrógenos y progesterona) pueden ser factores que favorecen la infección persistente por el VPH. En ausencia de hormonas, el receptor para estas se inactiva y se localiza en el núcleo

28 16 de la célula blanco como un gran complejo molecular asociado a diversas proteínas; cuando la hormona se une a su receptor, se produce un cambio conformacional que provoca la dimerización del receptor, adquiriendo capacidad de unión a secuencias específicas del ADN. Existen regiones de regulación para la transcripción del ADN viral que contienen elementos de reconocimiento a hormonas y que aumentan el nivel de expresión de los 2 genes virales el E6 y el E7. 70 Otro mecanismo descrito relacionado con las hormonas sexuales, es su acción sobre determinados genes asociados a la regulación del ciclo celular y al programa de muerte celular. Estas hormonas inhiben la transactivación transcripcional mediada por p53 de genes involucrados en el arresto del ciclo celular y la apoptosis Inmunohistoquímica Existen técnicas de inmunotinción que permiten demostrar una variedad de antígenos presentes en las células o tejidos, utilizando anticuerpos marcados. Esta técnica se basa en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos con una reacción que es visible si el anticuerpo está marcado con una sustancia que absorbe o emite luz, o produce una determinada coloración. 72 Las técnicas de Inmunohistoquímica (IHQ) permiten la identificación sobre muestras tisulares o citológicas, de determinantes antigénicos característicos de distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular. La aplicación directa de anticuerpos policlonales o monoclonales sobre secciones tisulares permite la localización microanatómica de su expresión y su correlación con los parámetros morfológicos, aumentando la sensibilidad y especificidad del estudio y proporcionando información adicional esencial en muchos casos. 73 La Inmunohistoquímica tiene utilidad diagnóstica en la identificación de factores de diferenciación celular y de marcadores de valor pronósticos en las neoplasias

29 17 (marcadores tumorales). Es posible la identificación de los productos de oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales, especialmente contra c-erbb-2, bcl2, p21, Rb1, y p53; así como la identificación de marcadores de proliferación celular como Ki67, de diferenciación de melanocitos como HMB-45, utilizados en el diagnóstico de melanomas; AE1/AE3, aplicable para el diagnóstico de carcinomas, entre otros. 74 En la actualidad, uno de los problemas con ésta técnica, manual o automatizada, es la dificultad para tener acceso a la gran cantidad de anticuerpos existentes y sobre todo, la necesidad de una especial preparación para una correcta interpretación de los resultados. Los errores de interpretación disminuyen cuando el patólogo tiene experiencia en estas técnicas y los resultados se analizan a la luz de los demás hallazgos clínico-patológicos. En las últimas décadas la utilización de IHQ ha sido progresivamente creciente y se ha consolidado como tecnología esencial en el diagnóstico patológico de rutina. En general y muy especialmente en patología oncológica, son cada vez más las patologías cuyo diagnóstico y clasificación requiere IHQ. La incorporación de nuevos protocolos de recuperación antigénica y la afluencia constante de nuevos anticuerpos están ampliando notablemente el ámbito de aplicación con nuevas utilidades en diagnóstico y pronóstico Marcadores Tumorales Utilizados Ki67 Es un antígeno nuclear humano de naturaleza proteica no histónica presente en todas las células con actividad proliferativa y ausente en las que no están proliferando. Su síntesis se inicia en la fase G1 del ciclo celular y aumenta durante la fase de síntesis (fase S), alcanzando su máxima expresión al final de la misma según unos autores, o en las fases G2/M según otros. 75 Desde que, en 1983, Gerdes y colaboradores elaboraron un anticuerpo anti-ki67 en tejido congelado, distintos estudios han

30 18 consolidado el estudio de IHQ como un método de evaluación más rápido y fidedigno de la actividad proliferativa celular en tumores sólidos. 76 El anticuerpo monoclonal Ki67, que fue inicialmente empleado para el estudio inmunohistoquímico, tenía el inconveniente de que sólo podía utilizarse con secciones tisulares frescas congeladas, ya que el epítopo del antígeno al que se unía, sufría una degeneración cuando el tejido era fijado, deshidratado y embebido en parafina. La reciente caracterización de la proteína identificada por el anticuerpo Ki67, ha facilitado el desarrollo del anticuerpo monoclonal MIB-1, que permite el estudio inmunohistoquímico de muestras tisulares fijadas con formol e incluidas en parafina, posibilitando de este modo la realización de estudios retrospectivos. 77 En el caso de la enfermedad neoplásica del cuello uterino, la medición inmunohistoquímica de Ki-67 se utiliza para predecir la progresión de la Neoplasia Intraepitelial Cervical grados 1 2 a Carcinoma in Situ e igualmente para determinar el grado de agresividad tumoral y metástasis, demostrando así tener valor pronóstico. 78,79,80,81 Por otra parte, la interacción de las oncoproteínas virales de los VPH de alto riesgo con las proteínas reguladoras del ciclo celular p53 y prb que ocurre en la neoplasia cervical invasora, puede verse reflejada entre otras, mediante la expresión anormal de Ki ,83 P16 INK4a La proteína p16, codificada por el gen supresor CDKN2A (MTS1, INK4A), situado en el cromosoma 9p21, es un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclinas (cdk) que desacelera el ciclo celular, inactivando la función de los complejos cdk4- y cdk6- ciclina D. Estos complejos regulan el punto de control de la fase G1 del ciclo celular mediante la fosforilación y la subsiguiente inactivación de retinoblastoma (prb), lo cual libera E2F y permite a la célula entrar en la fase S. 84 Se ha demostrado la existencia de una correlación recíproca entre prb y p16, razón por la cual existe una fuerte sobreexpresión de p16 tanto en las lesiones premalignas del cérvix uterino como en los carcinomas. 85 La expresión de esta proteína está estrictamente regulada en células normales en las que se expresa a niveles muy bajos, no detectándose mediante

31 19 tinciones inmunohistoquímicas. Por el contrario, p16 INK4a se encuentra sobreexpresada en las lesiones escamosas intraepiteliales del cuello uterino (NIC), relacionadas con el virus papiloma humano (VPH). 86 En el cáncer de cérvix, prb está funcionalmente inactivada desde las fases iniciales de la carcinogénesis cervical como consecuencia de la expresión del gen E7 de VPH. La sobreexpresión de p16 es fácil de detectar mediante una simple tinción Inmunohistoquímica. Esta sobreexpresión de p16 INK4a ha sido propuesta como un marcador biológico que permitiría identificar de forma inequívoca las células con cambio displásico o maligno inducido por VPH, mejorando así la especificidad diagnóstica y solucionando los problemas anteriormente expuestos de variabilidad inter e intraobservador. 87 La sobreexpresión de p16 INK4a está presente de forma importante en las infecciones por Virus del Papiloma Humano de alto riesgo. En definitiva, la determinación de p16 INK4a nos informa de la interacción del VPH con las proteínas reguladoras del ciclo celular y constituye un buen candidato a marcador de proliferación 88, 89 neoplásica. En las lesiones de NIC1, de bajo grado, la expresión de p16 es más heterogénea y el epitelio cervical normal es negativo. La positividad inmunohistoquímica se observa en núcleo y citoplasma y puede ser de utilidad en el diagnóstico diferencial de NIC en 90, 91 biopsias o de Lesión Intraepitelial (LIE), en frotis citológicos. P53 La proteína p53 no se expresa en el epitelio cervical normal y no siempre se observa inmunomarcaje para p53 en el carcinoma cervical. 92 Las diferencias en inmunomarcaje para p53, pueden también deberse al número de mutaciones que puede ser variable en diferentes localizaciones del Carcinoma Epidermoide. Aunque las implicaciones reales de p53 en la oncogénesis mediada por VPH no están totalmente

32 dilucidadas, es bueno recordar que pocas veces se ha podido demostrar mutaciones de 93, 94,95 p53 en el Carcinoma del cuello uterino. 20 Como ya se ha mencionado, p53 es inactivado por la oncoproteína supresora del VPH E6, la cual se une a la proteína p53, y promueve su degradación, por lo que su función se altera durante la infección con VPH de alto riesgo, sin que se produzca una verdadera mutación del gen. 96,97 La inducción de apoptosis se ha asociado a la activación de p53 a través de fosforilación, proceso este que parece comprometer ambas vías de apoptosis, la intrínseca y la extrínseca. 98 En la infección por VPH, la muerte celular programada es interferida a través de p53 por el oncogen E6 del mismo VPH, a través del bloqueo del ciclo celular inducido por el inhibidor de la cinasa dependiente de la ciclina p21 y por Bax. Bax es una proteína proapoptótica presente en los epitelios indiferenciados, la cual también puede ser degradada por E6 a través de la ubiquitina. 99 Según otros investigadores, a pesar de que la infección con VPH de alto riesgo es la responsable de la sobreexpresión de p53, la expresión de la misma no puede considerarse como un factor de valor pronóstico. Finalmente, para otros, no pareciera existir ninguna relación directa entre la positividad para VPH y el inmunomarcaje para p Hibridación de ADN Viral Las proteínas E6 y E7 del VPH, son importantes por sus propiedades oncogénicas ya que tienen la capacidad de inmortalizar y transformar las células del cuello uterino y por otra parte, mantendrán el ambiente celular para que el genoma viral pueda subsistir mientras no se encuentre incorporado en los cromosomas. 101 Algunas de las proteínas que pueden ser examinadas por IHQ dependen de la acción de los oncogenes E6 y E7 del VPH. Con la Hibridación in Situ (HinS) y amplificando la señal para los virus de alto riesgo con sondas con tiramida biotinilada, es posible detectar directamente en el epitelio cervical en casos de NIC o de Cáncer de Cuello uterino,

33 21 secuencias de ácidos nucleicos virales muy pequeñas, lo cual hace de esta técnica un instrumento valioso para la investigación sobre la infección y la carcinogénesis viral. 17, 24,102 Se ha determinado la presencia de infección genital con el Virus del Papiloma Humano (VPH) por HinS utilizando sondas biotiniladas de ADN específicas para VPH, de amplio espectro (WS) que comprende los virus tipo 6,11, 16, 18, 31,33,35, 45, 51y 52 ; y de alto riesgo (AR) con los virus tipo 16,18, 31,33,35,39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Igualmente y por separado se ha estudiado la presencia de VPH 16 y 18 en casos de NIC y de Cáncer Cervical con VPH de alto riesgo. Al utilizar esta metodología, los resultados permiten una correlación entre los casos de NIC y CA Epidermoide que se estudian para detectar el VPH y las diversas proteínas cuya actualización sobre sus 35, 103,104 estudios con IHQ han sido previamente discutidas HIPÓTESIS Las lesiones pre-malignas y malignas del cuello uterino, relacionadas con expresión elevada de Ki67, p16 y de p53, se asocian con Infección por Virus Papiloma Humano (VPH) de Alto Riesgo.

34 22 CAPITULO III MARCO METODOLÓGICO Tipo y Diseño de la Investigación Según los objetivos planteados en el problema de la investigación, la misma se define como de tipo retrospectiva y descriptiva 105, 106,107. El diseño de la investigación es No-Experimental, transversal 108, 109,110. En nuestro estudio, en una primera fase, se analizaron los diagnósticos histopatológicos previos de NIC, CA In Situ y CA Epidermoide, asociados con Infección por Virus del Papiloma Humano (VPH), en las muestras de biopsias de cuello uterino seleccionadas y posteriormente se procede a elaborar un instrumento de recolección de datos, el cual nos permitió establecer correlaciones entre los diferentes factores estudiados. En nuestra investigación, el período de recolección de datos se estableció entre febrero-2007 y noviembre Población y Muestra En este estudio, la población estuvo conformada por 223 casos de biopsias de cuello uterino, de los Archivos de Biopsias del Laboratorio de Anatomía Patológica BIMECA, de la Ciudad de Mérida, diagnosticadas como NIC1, NIC2, NIC3/CA In Situ y Carcinoma Epidermoide, asociadas con infección por Virus del Papiloma Humano (VPH). La muestra estuvo representada por 72 casos de biopsias de cuello uterino, diagnosticadas como NIC1, NIC2, NIC3/CAIn Situ y Carcinoma Epidermoide, posterior a la aplicación de los criterios de inclusión y de exclusión.