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1 D E L I A R O S A H E R R E R A H E R N Á N D E Z B a c t e r i ó l o g a B L A N C A L U Z S A L D A R R I A G A G A V I R I A B a c t e r i ó l o g a REVISADO POR APROBADO POR NOMBRE Delia Rosa Herrera Hernández Paulo Andres Gutierrez CARGO Bacterióloga Representante de la Dirección FIRMA FECHA Septiembre de 2010 Septiembre de 2010

2 C0NTENIDO 1. PRUEBA INMUNOLOGÍA DE EMBARAZO (PIE) PIE EN SUERO PIE EN ORINA 5 2. HIV Técnica HIV ½ 3.0 Bio Line Interpretación de los Resultados 6 3. SEROLOGIAS AGLUTINACION (RPR CARBON) Fundamento del Método Conservación Preparación de los reactivos Materiales adicionales Muestras Procedimiento Lectura e interpretación Limitación del Método 9 4. CLASIFICAR GLÓBULOS PARA EL SISTEMA ABO Métodos en Placa Método en Tubo DETERMINACIÓN DEL SISTEMA RH Procedimiento DETERMINACIÓN DEL DU COOMB S DIRECTO COOMB S INDIRECTO PROCEDIMIENTO COOMB S INDIRECTO - POSITIVO PRUEBAS CRUZADAS O DE COMPATIBILIDAD Prueba Cruzada Directa o Mayor Prueba Cruzada Indirecta o Menor TSH NEONATAL CONTROL DE CALIDAD PRUEBA INMUNOLOGICA DE EMBARAZO CONTROL DE CALIDAD INTERNO DE SEROLOGIAS (RPR) 22

3 14. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO DE SEROLOGIAS (RPR) CONTROL DE CALIDAD INTERNO ANTISUEROS Y SOLUCIONES Avidez Especificidad Potencia CONTROL DE CALIDAD INTERNO HIV CONTROL DE CALIDAD INTERNO TSH NEONATAL 28 BIBLIOGRAFIA

4 1. PRUEBA INMUNOLOGÍA DE EMBARAZO (PIE) Prueba rápida para la detección cualitativa de Gonadotropina Coriónica humana (HCG) en orina o suero para el diagnóstico precoz del embarazo PIE EN SUERO El Kit consta de casettes impregnados con partículas anti HCG que recubren la membrana. S T C Casette H C G En el pozo de la izquierda del cassete se echan 3 gotas de suero, se deja que corra la muestra y se dé la reacción la cual se lee a los 5 minutos. Interpretación de los resultados: Si aparece una línea violácea en la C, la prueba se lee como negativa; si aparecen dos líneas violáceas en T y C la prueba se lee como positiva, si no aparece la línea de control C la prueba se lee como no válido.

5 1. 2. PIE EN ORINA En el pozo de la izquierda del cassete, se echan 3 gotas de orina, se deja que corra la muestra y dé la reacción, la cual se lee a los 3 minutos. Interpretación de los resultados: Si aparece una línea violácea en la C, la prueba se lee como negativa; si aparecen dos líneas violáceas en T y C la prueba se lee como positiva, si no aparece la línea de control C la prueba se lee como no válido. Para la realización de la técnica ver: Ficha Anexa del Proveedor con las Especificaciones del Reactivo

6 2. HIV 2.1. Técnica HIV ½ 3.0 Bio Line Esta prueba se realiza en suero de la siguiente manera: - El Kit consta de cassettes y buffer. HIV ½ C 2 1 O S - En el pozo de la izquierda del cassette se depositan 25 µl de suero o plasma del paciente más 1 gota de buffer, se deja que corra la muestra y se de la reacción, la cual se lee a los 20 minutos Interpretación de los Resultados - Negativo: Aparece un línea roja en la región del control (C). No aparece ninguna línea coloreada en la región de la prueba 2, 1. - Positivo: Aparece dos o tres líneas coloreadas según el caso: Aparece línea coloreada en C y en 2: HIV 2. Aparece línea coloreada en C y en 1: HIV 1. Aparece línea coloreada en 2, 1: HIV 1, 2. - No valido: No aparece línea coloreada en la región de control (C). Para la realización de la técnica ver: Ficha Anexa del Proveedor con las Especificaciones del Reactivo

7 3. SEROLOGIAS AGLUTINACION (RPR CARBON) 3.1. Fundamento del Método La prueba rápida para determinación reaginas plasmáticas (RPR) es una técnica no treponémica para la detección serológica de la sífilis. El antígeno una suspensión de micro partículas de carbón sensibilizadas con lípidos complejos aglutina en presencia de reaginas anticuerpos presentes en el suero de pacientes afectados por sífilis. La aglutinación visible es indicativa de la presencia de tales anticuerpos en la muestra Conservación Mantener todos los componentes a 2 8º C, excepto las tarjetas y palillos que pueden guardarse a temperatura ambiente Preparación de los reactivos 1. Agitar suavemente el vial hasta obtener una suspensión homogénea. 2. Retirar la cápsula de aluminio y el tapón de goma. 3. Acoplar la aguja al vial dispensador de plástico y aspirar por succión la cantidad de RPR Carbón que se considere necesario Materiales adicionales Agitador mecánico rotatorio de velocidad regulable a 100RPM Muestras Suero o plasma; estable a 2 8º C durante 48 horas.

8 3.6. Procedimiento 1. Dejar atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. 2. Depositar 50λ de la muestra a ensayar y 1 gota de control en círculos separados de la tarjeta visualizadora. 3. Homogenizar el antígeno con suavidad antes del ensayo. Adaptar la aguja al extremo del vial dispensador de plástico. Invertir el conjunto y presionar ligeramente para eliminar el aire retenido en la aguja. 4. Situar la aguja en posición vertical a la tarjeta y dispensar 1 gota de antígeno al lado de la muestra. 5. Mezclar con ayuda de un palillo desechable, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo. Emplear palillos distintos para cada muestra. 6. Agitar la tarjeta a 100RPM durante 8 minutos Lectura e interpretación Examinar microscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación dentro del minuto siguiente a la parada del agitador. Los resultados se evalúan y anotan de acuerdo con el siguiente criterio. TIPO DE AGLUTINACION LECTURA RESULTADO Agregados grandes o medianos R Reactivo Agregados pequeños W Reactivo débil Ningún agregado o ligera rugosidad N No reactivo

9 Los sueros positivos deben titularse. Para la titulación realizar diluciones en solución salina así: 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 200λ Solución salina 200λ suero 200λ Solución salina 200λ Solución salina 200λ Solución salina 200λ Solución salina Depositar 50λ de cada dilución y agregar 1 gota del antígeno en los círculos separados de la tarjeta visualizadora Limitación del Método - La prueba de RPR carbón no es especifica para el diagnostico de la sífilis. - Es aconsejable ensayar todas las muestras reactivas con técnicas treponémicas tales como: FTA ABS o el TPHA para confirmar los resultados. - Así mismo un resultado no reactivo no excluye el diagnóstico de la sífilis. - Pueden aparecer falsas posibilidades de enfermedades tales como la mononucleosis infecciosa, neumonía viral, toxoplasmosis, embarazo y enfermedades autoinmunes. - Este ensayo es útil para seguir la respuesta a la terapia antibiótica. Notas - Una vez terminados los ensayos retirar la aguja del capuchón, enjuagar con agua destilada y secar al aire. - Es importante mantener la aguja dispensadora en posición perpendicular a la tarjeta visualizadora con el fin de dispensar la cantidad exacta de antígeno. - La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas. Se recomienda trabajar Entre 23-29Cº

10 Temperaturas elevadas pueden provocar la aparición de falsos positivos como consecuencia de la desecación de los componentes del ensayo sobre la tarjeta visualizadora. Se recomienda cubrir la tarjeta con una cámara húmeda.

11 4. CLASIFICAR GLÓBULOS PARA EL SISTEMA ABO Para detectar los antígenos para el sistema ABO, utilizamos para ello antisueros específicos y sangre coagulada. No deben usarse láminas calientes ni colocarlas sobre lámparas de lectura del Rh. Se debe recordar que las aglutininas Anti A y Anti B son anticuerpos fríos y su grado de reacción disminuye cuando la temperatura es superior a 30º C Métodos en Placa Se usa lámina de vidrio la cual tiene sus divisiones; en el área señalada A colocar una gota de suero Anti A y en la zona B una gota de suero Anti B, agregar una gota de sangre pequeña a cada una de las áreas. Mezclar, rotar suavemente la placa para observar la aglutinación, tiempo máximo 2 minutos Método en Tubo De los hematíes lavados una vez, se hace una dilución al 5% con solución salina al 0.85% - Se seleccionan 3 tubos y se marcan A B AB y en cada uno se coloca una gota del Antisuero correspondiente. - Agregar a cada tubo una gota de la suspensión de eritrocitos al 5%. - Mezclar y centrifugar por 1 minuto. - Con movimientos suaves pero firmes desprender el botón de células del fondo del tubo. Para cada lectura debe cuantificarse por cruces y anotar los resultados. 4 +: Aglutinación completa. 3 +: Aglutinación en grumos grandes. 2 +: Aglutinación en grumos pequeños. 1 +: Aglutinación discreta. Si hay ausencia de aglutinación, el resultado es negativo. La doble centrifugación o un tiempo más largo en la misma puede incidir en los resultados.

12 5. DETERMINACIÓN DEL SISTEMA RH Con el uso del suero específico anti D, determinar la presencia o ausencia del antígeno D en la membrana de la célula roja Procedimiento - Colocar una gota del suero anti Rh (D), sobre la lámina. - Agregar una gota de glóbulos rojos en estudio. - Mezclar con aplicador y observarse la aparición de aglutinación macroscópica, la cual debe comenzar a los 30 segundos y ser completa a los 2 minutos Puede hacerse la determinación también en tubo.

13 6. DETERMINACIÓN DEL DU Utilizando la prueba Coomb s indirecta y un anticuerpo específico (Anti D), detectar la presencia de una variante de poca expresividad, denominado antígeno Du. Hacer antes Rh en tubo Suspensión de glóbulos rojos del paciente al 5% CONTROL PROBLEMA 1 gota albúmina bovina 1 gota Anti D 1 gota G. R 5% 1 gota G. R 5% Centrifugar, si el problema aglutina Rh (+). Si da negativo continuo con los dos 2 tubos e incubo a 37º C por 15 minutos y luego lavo 4 veces con solución salina. Al problema agrego 2 gotas reactivo coomb s y al control 2 gotas de solución salina, centrifugar y leer. Problema (-) Control (-) Rh ( - ) Du ( - ) (+) (+) Rh Du positivo

14 7. COOMB S DIRECTO Esta prueba detecta anticuerpos incompletos, que se encuentran unidos al glóbulo rojo y aglutinan con suero anti-globulina (Suero de Coomb s). Se utiliza los glóbulos rojos del paciente y no el suero. Lavar los eritrocitos con solución salina 0.85% cuatro veces. PROBLEMA CONTROL 1 gota G. R paciente 1 gota G. R paciente 2 gotas reactivo Coomb s 2 gotas S. S 0.85% Mezclar y centrifugar a RPM por un minuto. Lectura Para una lectura correcta, las células deben ser desprendidas totalmente del tubo. Si la prueba está positiva quiere decir que el paciente posee anticuerpos y estos se encuentran en entidades como: 1. Enfermedad hemolítica del recién nacido. 2. Anemia hemolítica auto inmune. 3. Investigación de reacciones transfuncionales. Puede dar pruebas positivas procesos virales, reticulocitosis intensa, envenenamiento por plomo, hemólisis por drogas. 4+: Aglutinación en masa compacta. 3+: Aglutinación en grumos grandes. 2+: Aglutinación en grumos pequeños. Negativa: Si no hay aglutinación.

15 8. COOMB S INDIRECTO Se utiliza para buscar anticuerpos en suero. Eritrocitos normales son incubados in Vitro con el suero en estudio. Durante este periodo sí existen anticuerpos, estos se fijan sobre su respectivo determinante antígeno. Una vez fijados, los eritrocitos son lavados y se agrega al respectivo de Coomb s. Glóbulos rojos 0+ lavados 4 veces en solución salina. PROBLEMA CONTROL Suero Paciente 100µl 100ul Células 0+ 5% 50 µl - Células Paciente 5% - 50 µl - Centrifugar inmediatamente PROBLEMA CONTROL Agregar Albúmina 1 gota 1 gota - Incubar 15 minutos a 37º C - Centrifugar y lavar 3 veces con solución salina. PROBLEMA CONTROL Agregar Suero Coomb s 1 gota 1 gota - Centrifugar y leer por aglutinación.

16 9. PROCEDIMIENTO COOMB S INDIRECTO - POSITIVO 1. Hacer diluciones así: 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 100λ Solución Salina 100λ Solución Salina 100λ Solución Salina 100λ Solución Salina 100λ Solución Salina 100λ Suero 2. En otros tubos pasar 50λ de cada dilución. 3. Agregar 2 gotas de células 0+ al 5%. 4. Agregar 2 albúminas. 5. Incubar 15 minutos a 37º C. 6. Centrifugar y lavar 3 veces con solución salina. 7. Agregar 2 gotas de suero Coomb s a cada tubo. 8. Centrifugar 3 minutos. 9. Reportar hasta dónde se observa la aglutinación. 10. Reportar de la siguiente manera: Ejemplo: AGLUTINACIÓN SCORE Tubo: 1:2 1:4 Aglutinación ++ + Score: = 13

17 Reporte Final: Coomb s indirecto: Positivo 1:4 Score: 13

18 10. PRUEBAS CRUZADAS O DE COMPATIBILIDAD Prueba Cruzada Directa o Mayor Detectar anticuerpos en el receptor que puedan dañar los glóbulos rojos que se usan al transfundir. PROBLEMA CONTROL Suero Paciente 100µl 100µl Células Donante 5% - 50µl - Centrifugar inmediatamente 3 minutos. PROBLEMA CONTROL Agregar Albúmina 1gota 1gota - Incubar 15 minutos a 37º C. - Centrifugar y lavar 3 veces con solución salina. PROBLEMA CONTROL Agregar Coomb s Suero 1gota 1gota - Centrifugar 3 minutos y leer por aglutinación.

19 10.2. Prueba Cruzada Indirecta o Menor Es el procedimiento inverso a la prueba mayor, es decir, las células del receptor, se pone en contacto con el suero del donante. PROBLEMA CONTROL Células Paciente 5% - 50µl Suero Donante 5% 100µl 100µl - Centrifugar inmediatamente 3 minutos PROBLEMA CONTROL Agregar Albúmina 1gota 1gota - Incubar 15 minutos a 37º C. - Centrifugar y lavar 3 veces con solución salina. PROBLEMA CONTROL Agregar Coomb s Suero 1gota 1gota - Centrifugar 3 minutos y leer por aglutinación. Interpretación Un resultado negativo en ambas pruebas, puede indicar compatibilidad serológica, solamente si ellas han sido correctamente realizadas.

20 11. TSH NEONATAL Esta prueba en suero se realiza de la siguiente manera: - El Kilt consta de cassetes y Buffer O S T C - En el pozo de la izquierda del cassete se depositan 25 µl de suero del paciente más 4 gotas de Buffer, se deja que corra la muestra y se de la reacción, la cual se lee a los 15 minutos. Interpretación de los resultados Negativo: Aparece una línea coloreada en la región del control (C). No aparece ninguna línea coloreada en la región de la prueba (T). Positivo: Aparecen dos líneas coloreadas en C y en T. No válido: No aparece línea coloreada en la región de control (C). Para la realización de la técnica ver: Ficha Anexa del Proveedor con las Especificaciones del Reactivo

21 12. CONTROL DE CALIDAD PRUEBA INMUNOLOGICA DE EMBARAZO Este control se realiza utilizando un suero positivo conocido y un suero de un paciente masculino para el control negativo. El control de calidad se realiza cada que se inicia un nuevo lote. Para la realización de la técnica ver: Ficha Anexa del Proveedor con las Especificaciones del Reactivo

22 13. CONTROL DE CALIDAD INTERNO DE SEROLOGIAS (RPR) El control de calidad interno que se lleva de las serologías consiste en montar el control positivo y negativo que trae el Kit del reactivo como si fuera una muestra de cualquier paciente. Este control se realiza semanalmente (todos los jueves) y se reporta en un formato diseñado para esta prueba.

23 14. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO DE SEROLOGIAS (RPR) Este control de calidad es realizado por el Laboratorio Departamental y consiste en enviar ocho sueros procesados en el mes a evaluar (abril, julio, octubre), en caso de no tener sueros con serologías reactivas se deben enviar ocho sueros con serologías no reactivas. Se hacen tres envíos en el año (abril julio octubre) al Laboratorio Departamental de Salud Pública los primero diez días del mes asignado. El Laboratorio Departamental también hace otro control mediante el envío de tres sueros en los meses de marzo julio octubre, estos tres sueros se deben procesar y reportar el resultado al Laboratorio Departamental de Salud Pública los diez primeros días del mes siguiente. Se realiza control de calidad externo a: RPR, se analiza los resultados y se toman las medidas necesarias en caso de no concordancia.

24 15. CONTROL DE CALIDAD INTERNO ANTISUEROS Y SOLUCIONES El control y calidad interno que se realiza es para chequear los sueros hemoclasificadores y se hace de la siguiente forma: Se toma sangre de pacientes previamente clasificados, de los tipos A, B, O +, O - y se hacen diluciones de cada grupo al 5% y se guardan en refrigeración. Se realiza tres pruebas control: Avidez Mide el tiempo que demora cada anti suero para aglutinar. Procedimiento: Se coloca una gota de cada anti suero A, B, D en una placa y se le hecha una gota de cada dilución de la sangre al 5% A, B y D, luego se pone en marcha el cronómetro, se anota el tiempo en que inicia la aglutinación y el tiempo en el cual se da la aglutinación franca de cada anti suero. AVIDEZ MES: NOMBRE DEL ANTI SUERO A B D CASA COMERCIAL Nº DE LOTE FECHA DE VENCIMIENTO ANTISUERO A B D TIEMPO DE INICIO DE AGLUTINACION TIEMPO DE AGLUTINACION FRANCA

25 15.2. Especificidad Mide la cualidad y condición específico que posee cada anti suero para reaccionar con cada una de las diluciones al 5% de la sangre A, B, O +, O -. Procedimiento: Se coloca una gota de anti suero A, B, D en una placa y se deposita una gota de la dilución de la sangre al 5% A, B, O +, O -, luego reportamos la aglutinación obtenida en cruces confirmando la especificidad de cada anti suero. ESPECIFICIDAD MES: NOMBRE DEL ANTI SUERO A B D CASA COMERCIAL Nº DE LOTE FECHA DE VENCIMIENTO ANTISUERO CEL A CEL B CEL O + CEL O - Anti A Anti B Anti D Potencia Mide el grado de positividad (aglutinación) que posee cada anti suero A, B, D, de acuerdo al título obtenido. Procedimiento: Se prepara diluciones de la siguiente forma: Marcamos 7 tubos así: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, a cada tubo; agregamos Agregar de S/S 60λ 60λ 60λ 60λ 60λ 60λ 60λ

26 Agregamos 60λ de la dilución de las sangres al 5% conocidas A, B, C, D y hacemos las respectivas diluciones. Luego en la placa se coloca 50λ de cada dilución (A, B, D) y se agrega una gota del respectivo anti suero (A, B, D), se agita 8 minutos y se lee el grado de potencialidad, según el título de aglutinación. POTENCIA MES: NOMBRE DEL ANTI SUERO A B D CASA COMERCIAL Nº DE LOTE FECHA DE VENCIMIENTO ANTI A TITULO GRADO DE POSITIVIDAD ANTI B TITULO GRADO DE POSITIVIDAD ANTI D TITULO GRADO DE POSITIVIDAD 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Estos tres controles (especificidad, potencia, avidez) se hacen mensualmente y diariamente hacemos control de calidad interno de los anti sueros.

27 16. CONTROL DE CALIDAD INTERNO HIV Este control se realiza utilizando un suero positivo para HIV y un suero negativo de una paciente de control prenatal, cuyo resultado haya sido negativo. El control se realiza cada que iniciemos un nuevo lote. Para la realización de la técnica ver: Ficha Anexa del Proveedor con las Especificaciones del Reactivo

28 17. CONTROL DE CALIDAD INTERNO TSH NEONATAL Este control se realiza utilizando un suero de un paciente con resultado negativo y si hay algún paciente positivo también se hace control a dicho suero. El control se realiza cada que iniciemos un nuevo lote. Para la realización de la técnica ver: Ficha Anexa del Proveedor con las Especificaciones del Reactivo

29 BIBLIOGRAFIA -Procedimientos básicos de laboratorio involucrados en la terapia transfusional. Por Marta Inés Baena, Olga Lucia Londoño, Roció Pérez, Zulma Uribe. -Uso terapéutico de la sangre. Dirección Seccional de Salud de Antioquia. -Exámenes de Laboratorio en la práctica corriente. Zoraida Torregroza F.

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