Ensayos de detección de anticuerpos frente al VIH. Carlos Toro Rueda, Aránzazu Amor Aramendía Servicio de Microbiología. Hospital Carlos III, Madrid

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1 Ensayos de detección de anticuerpos frente al VIH Carlos Toro Rueda, Aránzazu Amor Aramendía Servicio de Microbiología. Hospital Carlos III, Madrid Introducción Pruebas de cribado Pruebas confirmatorias Estrategias de cribado y algoritmos diagnósticos Diagnóstico de la infección infantil Diagnóstico de la infección reciente Introducción Los ensayos para la detección de anticuerpos frente al VIH comenzaron en 1985 con la introducción de los enzimoinmunoanálisis (EIA) para el cribado del virus en los bancos de sangre. Tras la comunicación de falsos positivos en los EIA en población de bajo riesgo, se estableció la necesidad de confirmar los resultados. Para ello se propuso un algoritmo secuencial de cribado con EIA y confirmación con Western blot (WB) que se ha mantenido hasta nuestros días. Desde entonces han pasado más de dos décadas de continuo avance en este campo que ha llevado al desarrollo de una amplia variedad de ensayos serológicos. Estas innovaciones han ido dirigidas a dos objetivos fundamentales para el control de la infección: la identificación de los individuos en el periodo agudo de la infección, cuando todavía no han desarrollado anticuerpos y el riesgo de transmisión es más elevado; y la extensión del diagnóstico fuera de los centros hospitalarios mediante pruebas rápidas y de fácil acceso.

2 Pruebas de cribado El diagnóstico de la infección por VIH se basa fundamentalmente en la detección de anticuerpos. Para ello se utilizan en primer lugar las pruebas de cribado caracterizadas por tener una elevada sensibilidad (porcentaje de positivos en sujetos con infección). Posteriormente las muestras reactivas se confirman mediante técnicas más específicas (porcentaje de negativos en individuos no infectados) denominadas de confirmación. Atendiendo a su formato, podemos dividir las pruebas de cribado en técnicas de enzimoinmunoanálisis (EIA) y pruebas rápidas (1, 2). Enzimoinmunoanálisis El EIA es la técnica más frecuentemente empleada en el cribado. Durante la década pasada los EIA evolucionaron considerablemente, con una mejora tanto en la diana antigénica del VIH como en su formato de ensayo. Este hecho se ha traducido en un incremento de su sensibilidad y especificidad. Los EIA de primera generación utilizaban para la detección de anticuerpos antígenos procedentes de un lisado vírico de VIH-1. Los EIA de segunda generación empleaban proteínas recombinantes o péptidos sintéticos que reproducían epítopos del VIH-1/2, con una mejora sobre todo de la especificidad. Los EIA de tercera generación utilizan también proteínas recombinantes o péptidos sintéticos, pero en un formato denominado sándwich. Este diseño permitió detectar todas las clases de inmunoglobulinas, no como los anteriores que solo reconocían IgG, lo que aumentó la sensibilidad al ser la IgM el primer marcador de seroconversión. El último avance han sido los EIA de cuarta generación, algunos de ellos con la sustitución de sustratos enzimáticos por fluorescentes (pruebas ELFA, enzymelinked fluorescent assay). Se caracterizan por la inclusión de anticuerpos frente al antígeno p24, lo que permite la detección simultánea de antígeno y anticuerpo. Esta modificación posibilita el diagnóstico de la infección en el momento agudo, antes de la seroconversión (periodo ventana). Es precisamente en este periodo donde se alcanzan las mayores concentraciones

3 de virus, tanto en sangre como en secreciones genitales, y por lo tanto cuando el riesgo de transmisión es más elevado. De hecho, la identificación de los sujetos con infección aguda se ha convertido actualmente en un objetivo primordial de las estrategias de prevención en la lucha contra el sida (1, 3). Los EIA de tercera y cuarta generación son los actualmente utilizados y cuentan con una excelente sensibilidad y especificidad. Sin embargo, se han descrito ocasionalmente falsos negativos y, más en concreto, una disminución de su sensibilidad al analizar subtipos del VIH-1 distintos del B y para VIH-1 del grupo O (4,5). La especificidad se ve también mermada cuando estos ensayos se realizan en el África subsahariana, probablemente por el estímulo inmunológico que supone la infección con malaria y otras infecciones endémicas, que ocasiona una mayor frecuencia de falsos positivos (6). Pruebas rápidas La Organización Mundial de la Salud estableció en 2005 como una de sus actuaciones prioritarias para la lucha contra el sida la necesidad de extender el diagnóstico fuera de los centros hospitalarios. Esto ha supuesto la difusión de las pruebas rápidas que permiten obtener un diagnóstico presuntivo en pocos minutos sin apenas infraestructura. Aunque no dejan de ser pruebas de cribado, en países con escasos recursos económicos se han establecido algoritmos utilizando varias pruebas rápidas que permiten, de alguna manera, soslayar las pruebas confirmatorias. Los antígenos que se utilizan en las pruebas rápidas son similares a los utilizados en los EIA. Atendiendo al formato de ensayo, las pruebas rápidas se clasifican en pruebas de aglutinación de partículas, inmunoconcentración e inmunocromatografía (7). En el primer caso, la aglutinación se realiza con partículas de látex, gelatina o hematíes sensibilizados con proteínas del VIH. Su principal dificultad reside en la lectura en el caso de aglutinaciones débiles. Las pruebas de inmunoconcentración utilizan antígenos del VIH inmovilizados sobre una membrana porosa. Se han comercializado algunos que además permiten diferenciar entre la infección por VIH-1 y por VIH-2. Las limitaciones importantes de los ensayos de inmunoconcentración son que muchos de ellos

4 solo funcionan con suero o plasma, y que requieren varios pasos y reactivos para su realización. Las pruebas de inmunocromatografía son las más recientes y han desplazado en gran parte a las anteriores, gracias a que la mayoría puede realizarse a partir de sangre total o capilar, suero, plasma e incluso saliva, como es el caso del OraQuick. Además apenas requieren manipulación y se realizan en un solo paso. Consisten en una tira de nitrocelulosa donde está incluido el antígeno del VIH depositado en forma lineal. Al reaccionar con la muestra que presenta anticuerpos específicos tiene lugar una reacción colorimétrica y la línea se vuelve visible. Recientemente se han diseñado pruebas de inmunocromatografía que incorporan la detección tanto de antígeno como de anticuerpos, de forma similar a los EIA de cuarta generación, y que contribuirán por lo tanto a incrementar el rendimiento diagnóstico (8). Aunque la sensibilidad de las pruebas rápidas es excelente y comparable a la de los EIA tradicionales, presenta las mismas limitaciones que estos en cuanto a una menor sensibilidad con determinadas variantes del VIH-1, especialmente para la cepas del grupo O (4, 5, 9, 10). Otro inconveniente es que los criterios para la lectura de las bandas pueden comprometer seriamente la fiabilidad de las pruebas. Dos estudios recientes han encontrado un número elevado de falsos positivos cuando el criterio de positividad incluía también aquellas muestras que presentaban una reactividad débil. En estos casos, los resultados deben interpretarse con precaución y es necesario realizar pruebas confirmatorias (11, 12). Pruebas confirmatorias La técnica más utilizada para la confirmación de los resultados obtenidos en las pruebas de cribado es el Western blot (WB) (1,2). Este ensayo consiste en una tira de nitrocelulosa donde se han transferido los antígenos propios del VIH-1 y algunas proteínas de origen celular a partir de un cultivo viral en linfocitos. Las proteínas virales se han separado en función de su peso molecular y, por tanto, esta prueba permite conocer frente a cuáles de ellas se dirigen los anticuerpos. Se han comercializado WB que incorporan un péptido sintético del VIH-2 (gp36) para orientar el diagnóstico en caso de infección por este virus.

5 Hay diferentes criterios elaborados por distintos organismos para la interpretación del WB en función del patrón de bandas encontrado (Tabla 1). La Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció como criterios de positividad para VIH-1 la detección de al menos dos bandas de la envoltura (gp41 y gp120/gp160). La ausencia de bandas se considera resultado negativo y cualquier otro patrón se cataloga como indeterminado (13). En este último caso, la presencia de ciertas bandas nos puede orientar hacia el diagnóstico adecuado. Los WB indeterminados con alguna banda de la envoltura suelen asociarse a pacientes en los estadios iniciales de la seroconversión o infectados por otras variantes distintas del VIH-1, principalmente por VIH-2. Por el contrario, la detección de bandas del core (p24) suele deberse a reactividades inespecíficas y no a verdaderas infecciones (1, 2). Ante la trascendencia de un resultado indeterminado en una infección de la importancia del VIH, son varios los estudios que han examinado a qué puede obedecer este hallazgo (14). Las causas que pueden producir un WB indeterminado y corresponder a una verdadera infección son principalmente: a) la infección por VIH-2, un virus genéticamente alejado del VIH-1; b) los estadios iniciales de seroconversión, en los que todavía no se ha desarrollado el perfil completo de anticuerpos; c) estadios terminales de sida, y d) individuos tratados con terapia antirretroviral de alta eficacia en la fase aguda o reciente de la infección (15, 16). Entre las causas de WB indeterminado sin infección por VIH, hay que mencionar: a) niños no infectados nacidos de madres seropositivas que todavía no han aclarado totalmente los anticuerpos transmitidos por la madre; b) enfermedades autoinmunitarias; c) sujetos vacunados contra la gripe, y d) usuarios de drogas por vía parenteral. En la Tabla 2 se enumeran las situaciones que se pueden acompañar de WB indeterminado. Para aumentar la sensibilidad y disminuir los resultados indeterminados, se han comercializados WB que incorporan un péptido sintético de la envoltura de VIH- 2 (gp36) cuya reactividad permita sospechar su infección. Con el mismo objetivo, se han desarrollado técnicas de inmunoanálisis lineal (LIA) que incorporan proteínas recombinantes o péptidos sintéticos del VIH-1 y del VIH-2 que permiten una lectura más estructurada y minimizan los resultados indeterminados del WB.

6 Estrategias de cribado y algoritmos diagnósticos Algoritmo estándar El algoritmo estándar para el diagnóstico de la infección por VIH deriva de las guías de los CDC que se empezaron a aplicar a mediados de los años ochenta. Es un algoritmo secuencial que se inicia con un ensayo de cribado y las muestras que son repetidamente reactivas son confirmadas mediante WB. Es aconsejable disponer de al menos dos pruebas de cribado que empleen un principio técnico diferente. Como se ha señalado anteriormente, conviene utilizar como prueba confirmatoria un WB o un LIA que incluyan péptidos del VIH-2. Si se observa reacción en el WB frente a la banda del antígeno del VIH- 2, es necesario confirmar la infección mediante un WB específico para este virus. En los casos en que se obtenga un resultado indeterminado en las pruebas confirmatorias, la actitud diagnóstica a seguir difiere según el patrón hallado: si se detecta alguna de las bandas de la envoltura es urgente solicitar un nuevo suero para descartar seroconversión, así como conocer las características del paciente (por ejemplo, exposición de riesgo reciente) a fin de valorar la realización de una reacción en cadena de la polimerasa. Si por el contrario no presenta bandas de la envoltura, es recomendable hacer un seguimiento serológico durante 3-6 meses para vigilar que no haya alteraciones en su perfil de anticuerpos y descartar la infección (2). A pesar del excelente rendimiento diagnóstico de este algoritmo, su principal inconveniente es la elevada relación coste/eficacia. Por este motivo, se propusieron estrategias alternativas para analizar la presencia de anticuerpos adoptadas posteriormente por la OMS y la ONUSIDA. Algoritmos alternativos

7 La OMS/ONUSIDA ha establecido tres algoritmos diferentes denominados estrategias I, II y III en referencia al número de pruebas que utilizan (17). Estos algoritmos fueron diseñados con el objeto de eliminar las pruebas confirmatorias y así reducir costes en los países con escasos recursos económicos. La estrategia a utilizar depende del propósito del estudio (seguridad biológica, vigilancia epidemiológica o diagnóstico) y la prevalencia de la infección. Además, si el objetivo es el diagnóstico, debemos tener en cuenta también la presencia de síntomas clínicos relacionados con la infección (Tabla 3). Este último factor, junto con la prevalencia de la infección, afectan al rendimiento de las pruebas, ya que es más probable obtener resultados falsos positivos si se analizan poblaciones sanas con escasa prevalencia. En general, si lo que queremos es descartar la infección, como en los casos de seguridad biológica, nos bastará con una sola prueba (estrategia I), ya que el valor predicitivo negativo (la probabilidad de que siendo negativo en la prueba no exista enfermedad), apenas se afecta por la prevalencia. Si, por el contrario, lo que queremos es confirmar la infección, tendremos que minimizar el riesgo de falsos positivos y emplear generalmente estrategias con más de una prueba, sobre todo si es con fines diagnósticos. Por último, hay que reseñar que recientemente se han propuesto otros algoritmos alternativos basados en la combinación de los EIA tradicionales con las pruebas rápidas y la reacción en cadena de la polimerasa, también con el propósito de evitar los problemas que ocasiona confirmar con WB. Los resultados obtenidos fueron comparables con el algoritmo estándar e incluso se obtuvo una disminución de los resultados discordantes junto con una mejora en el diagnóstico de la infección reciente (18). Diagnóstico de la infección infantil El diagnóstico de la infección por VIH en el niño recién nacido mediante técnicas serológicas se ve comprometido por la transferencia pasiva de anticuerpos de la madre infectada. Por este motivo, para realizar el diagnóstico en el recién nacido se acude a técnicas virológicas como la reacción en cadena

8 de la polimerasa y, en menor medida, al cultivo viral (19). Sin embargo, en zonas con escasos recursos económicos estás técnicas no están habitualmente disponibles, por lo que, a pesar de sus limitaciones, los ensayos serológicos pueden servir de orientación. En los niños no infectados nacidos de madre seropositiva, los anticuerpos maternos desaparecen paulatinamente y se observa una serorreversión. Es importante conocer el tiempo que tarda en ocurrir la serorreversión porque hasta esa fecha la serología no puede utilizarse para el diagnóstico de la infección por VIH. En 1994 los CDC revisaron las guías diagnósticas pediátricas y fijaron en 18 meses el tiempo en que tiene lugar la pérdida completa de los anticuerpos maternos en el niño y, por lo tanto, el límite para tener un resultado serológico indicativo de infección. Sin embargo, estudios posteriores indican que la mayoría de niños no infectados pierden los anticuerpos maternos antes de los 12 meses e incluso a los 6 meses. Actualmente las guías norteamericanas recomiendan hacer una prueba serológica a los niños nacidos de madre con infección por VIH a los 6 meses y, si continúa siendo positivo, repetirla entre los 12 y 18 meses, con objeto de documentar la serorreversión cuanto antes. Dos pruebas negativas antes de los 18 meses en ausencia de otros síntomas clínicos u otros datos de laboratorio descartarían la infección por VIH (19). Este abordaje en niños menores de 18 meses, incluyendo un cribado inicial mediante una prueba rápida como paso previo para conocer si es necesario realizar un diagnóstico por reacción en cadena de la polimerasa, ha demostrado tener un buen rendimiento en la relación coste/eficacia en países con recursos limitados (20). Por otro lado, aunque se considera que los niños mayores de 18 meses en los que se confirma la presencia de anticuerpos están infectados, hay una minoría de casos de niños no infectados por encima de esa edad en los que pueden detectarse anticuerpos (21). Aún más, estos falsos positivos se pueden incrementar si se emplean EIA más sensibles, como los de cuarta generación (22). Diagnóstico de la infección reciente

9 El diagnóstico de los casos de infección reciente, es decir, pacientes que se han infectado hace menos de seis meses, tiene un indudable interés epidemiológico. Aparte de que permite conocer la incidencia de la infección, posibilita analizar las características virológicas de las cepas causantes de las nuevas infecciones (principalmente la presencia de mutaciones de resistencia y el subtipo viral). La respuesta serológica en el paciente infectado por VIH se caracteriza por la aparición, a las dos o tres semanas de la infección, de anticuerpos IgM específicos, que alcanzan su máximo con rapidez para luego desaparecer definitivamente dos o tres semanas más tarde. La respuesta mediada por IgG comienza a la vez que la de IgM y, aunque sin ese pico abrupto, se convierte en la predominante a las cinco o seis semanas de la infección y acompañará ya al individuo de forma permanente. En los primeros meses que siguen a la infección, se produce un incremento gradual del título de IgG específica a la vez que una mayor afinidad de estos anticuerpos frente al virus. Los EIA que se utilizan para el diagnóstico de la infección reciente explotan estas características. Los EIA denominados detuned y BED (así llamado por contener antígenos del subtipo B, recombinante AE y subtipo D) se basan en el aumento del título de anticuerpos y son los más empleados. Son EIA menos sensibles, de manera que los pacientes seropositivos que no reaccionen a estos ensayos, pero sí lo hagan a los EIA tradicionales, habrán sido infectados hace poco y serán diagnosticados de infección reciente. Los ensayos fundamentados en la afinidad de los anticuerpos son los de avidez. Emplean EIA utilizados en el diagnóstico pero con modificaciones en el tratamiento de la muestra que reduzcan la afinidad antígeno-anticuerpo (23). Se han propuesto otras alternativas para diagnosticar la infección reciente sin tener que acudir a la utilización de los EIA descritos anteriormente, entre ellas las pruebas confirmatorias basadas en péptidos sintéticos, donde determinados patrones se han relacionado con la infección reciente (24). Esta aproximación es útil, sobre todo si ya se emplean estas pruebas confirmatorias en la rutina diagnóstica. El rendimiento de estas pruebas para el diagnóstico de la infección reciente todavía no es óptimo. Entre los factores que limitan su fiabilidad se encuentran la distinta respuesta serológica que puede variar entre subtipos, los pacientes

10 con sida terminal que pueden tener un descenso en el título de anticuerpos, o el tratamiento antirretroviral en la que la supresión del estímulo antigénico puede acarrear una menor producción de anticuerpos y un título disminuido. Dada la importancia que tiene conocer la incidencia de la infección por VIH, es probable que en los próximos años asistamos a nuevos ensayos y algoritmos diagnósticos destinados a mejorar su fiabilidad (23, 25).

11 Bibliografía 1. Constantine NT, Zink H. HIV testing technologies after two decades of evolution. Indian J Med Res 2005;121: López Bernaldo de Quirós JC, Delgado R, García F, Eiros JM, Ortiz de Lejarazu, R. Diagnóstico microbiológico de la infección por el VIH. Enferm Infecc Microbiol Clin 2007;25: Pilcher CD, Christopoulos KA, Golden M. Public health rationale for rapid nucleic acid or p24 antigen tests for HIV. J Infect Dis 2010;201(S1):S7- S Toro C, Amor A, Soriano V. Diagnóstico de las infecciones por subtipos no B del VIH-1 y por VIH-2. Enferm Infecc Microbiol Clin 2008;26(Supl 13): Plantier JC, Djemai M, Léeme V, et al. Census and analysis of persistent false-negative results in serological diagnosis of human immunodeficiency virus type 1 group O infections. J Clin Microbiol 2009;47: Everett DB, Weiss HA, Changalucha J, et al. Low specificity of the Murex fourth-generation HIV enzyme immunoassay in Tanzanian adolescents. Trop Med Int Health 2007;12: Greenwald JL, Burstein GR, Pincus J, Branson B. A rapid review of rapid HIV antibody tests. Curr Infect Dis Rep 2006;8: Pilcher C, Louie B, Keating S, et al. A clinical study of antigen/antibody rapid testing for acute HIV infection. En: Program and abstracts of the 16 th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (Montreal, Canadá) Abstract Holguín A, Gutiérrez M, Portocarrero N, Rivas P, Baquero M. Performance of OraQuick Advance Rapid HIV-1/2 Antibody Test for detection of antibodies in oral fluid and serum/plasma in HIV-1+ subjects carrying different HIV-1 subtypes and recombinant variants. J Clin Virol 2009;45: Aghokeng AF, Mpoudi-Ngole E, Dimodi H, et al. Inaccurate diagnosis of HIV-1 group M and O is a key challenge for ongoing universal access to

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14 TABLA 1. Criterios de positividad del Western blot para el diagnóstico de la infección por VIH-1 OMS Dos bandas de la envoltura (gp120/gp160, gp 41) FDA p24 + p32 + (gp41 o gp120/gp160) CDC Al menos, dos bandas de las siguientes: p24, gp41 y gp120/gp160 CRSS Al menos, una banda del core (p24 o p32) y otra de la envoltura (gp41 o gp120/gp160) OMS: Organización Mundial de la Salud; FDA: Food and Drug Administration; CDC: Centres for Disease Control; CRSS: Consortium for Retrovirus Serology and Standardization

15 TABLA 2. Causas de Western blot indeterminado 1. Con infección por VIH Estadios iniciales de seroconversión (periodo ventana) Sida terminal Infección por VIH-2 u otras variantes Sujetos que iniciaron tratamiento antirretroviral en la fase aguda o reciente de la infección Terapia inmunosupresora prolongada 2. Sin infección por VIH Enfermedades autoinmunitarias Lepra Bilirrubina elevada, nucleoproteínas y factor reumatoide Componentes celulares (HLA) Participantes en ensayos de vacunas frente al VIH Niños no infectados nacidos de madres con infección Infección con HTLV Muestra hemolizada Muestras con bilirrubina elevada Sueros posvacunales (gripe, hepatitis B) Usuarios de drogas por vía parenteral Error técnico

16 TABLA 3. Recomendaciones de OMS/ONUSIDA sobre estrategias de análisis para VIH según objetivo de la prueba y prevalencia de infección Objetivo Prevalencia VIH Estrategia Transfusión o trasplantes Todas I Vigilancia >10% I 10% II Diagnóstico Con signos/síntomas clínicos de VIH >30% I 30% II Asintomáticos >10% II 10% III

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