CONTRIBUCIÓN DE LA PRUEBA DE MICRONÚCLEOS EN EXFOLIADOS CERVICALES PARA DIAGNÓSTICO PREVENTIVO DE CÁNCER

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1 CONTRIBUCIÓN DE LA PRUEBA DE MICRONÚCLEOS EN EXFOLIADOS CERVICALES PARA DIAGNÓSTICO PREVENTIVO DE CÁNCER Guadalupe MARTÍNEZ 1 Guillermo CABRERA 1, Ma. Eugenia GONSEBATT 2, Leticia ZÁRATE 1. Centro de Estudios Académicos sobre Contaminación Ambiental (CEACA), Facultad de Química, UAQ. Cerro de las Campanas s/n, C.P , Querétaro, Qro. México. Tel y Fax: 01(442) ext.5538, gpemtzg@uaq.mx. 1 CEACA, Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro, México. 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional Autónoma de México. RESUMEN Las células de exfoliación epitelial han sido ampliamente usadas en citología para detectar morfología anormal, cambios premalignos y cáncer. La mayoría de los cánceres se originan en tejidos epiteliales y estos tejidos son típicamente los órganos blanco de los carcinógenos responsables de la formación de tumores. El cáncer cervical resulta de la progresión de lesiones precursoras preinvasivas -llamadas lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (LEIBG)- a lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado (LEIAG). El paso de LEIBG a LEIAG es caracterizado por el aumento de atípias nucleares y fallas en la diferenciación celular en niveles más superficiales del epitelio. Se ha formulado la hipótesis de que estos cambios fenotípicos presentan una incrementada inestabilidad genética que puede ser evaluada con el ensayo de micronúcleos (MN) en células de exfoliación cervical. En este estudio se evaluó la frecuencia de células micronucleadas (FCMN) en muestras cervicales de mujeres con alto riesgo a desarrollar cáncer cervical. La evaluación de la FCMN se realizó en frotis preparados a partir del procesamiento de las muestras y su tinción mediante la técnica de Feulgen; y de la lectura de MN de frotis previamente evaluados para la prueba de Papanicolaou (Pap). Muestras de 397 pacientes que asistían para su diagnóstico y control a dos instituciones de salud (pública y privada) de la ciudad de Querétaro, fueron codificadas y analizadas para la evaluación de la FCMN y a través del Pap se clasificaron por grado de lesión de acuerdo a Bethesda. Las muestras de LEIBG, LEIAG y carcinoma epidermoide invasivo (CEI) presentaron diferencias en la FCMN altamente significativas (P<0.0001) con respecto a las muestras control (negativas en la prueba de Pap). Los resultados indican que la frecuencia de MN en células de exfoliación cervical puede ser un criterio adicional para establecer riesgo a padecer cáncer cervical. Palabras clave: Células epiteliales, genotoxicidad, cáncer. INTRODUCCIÓN El cáncer es una patología conocida como neoplasia maligna que involucra diversos factores relacionados con la regulación, la apoptosis y el crecimiento celular. Hace poco más de 25 años cuando la "guerra contra el cáncer" se inició, con la esperanza anticipada de que las tasas de mortalidad de las formas más comunes de la enfermedad se habrían de reducir en forma significativa para el año 2000, meta que no se logró. Sin embargo, la gran inversión empleada en la investigación básica ha proporcionado los conocimientos suficientes que permiten el diseño racional de nuevos enfoques para su prevención. Algunas evidencias indican que entre el 50 y el 80% del cáncer humano es potencialmente prevenible debido a que los factores que determinan su incidencia son sobre todo agentes exógenos, que han sido plenamente relacionados con el cáncer en los humanos como el humo de tabaco, químicos

2 ocupacionales y ambientales, radiaciones, factores dietéticos, factores socioeconómicos y estilos de vida, así como virus, bacterias y parásitos específicos. En México, el cáncer cérvico uterino es una de las principales causas de muerte en mujeres de más de 25 años. La OMS reporta que México ocupa el primer lugar de mortalidad por cáncer cérvico uterino, 3 mujeres mueren al día a causa de esta enfermedad (Secretaría de Salud, 1999). El Papanicolaou, es la prueba de rutina que detecta con certeza este tipo de cáncer, sin embargo la calidad de obtención de especímenes de Papanicolaou es deficiente. En una muestra aleatoria de especimenes, se notificó que el 64% carecían de células endocervicales, moco y metaplasia epidermoide, correlacionados con error diagnóstico en 0.87 (P<0.001). Respecto a la precisión diagnóstica en Papanicolaou, existen centros de lectura con un índice de resultados falsos negativos hasta del 54%. El Programa de Detección Oportuna de Cáncer en México previene menos del 13% de los casos potencialmente prevenibles (Lazcano et al., 1996). La detección de mutaciones o de expresión alterada de algunos genes en tejidos aparentemente normales o con lesiones precancerosas, podría ayudar a identificar individuos con alto riesgo de desarrollar cáncer, de ahí la importancia del empleo de bioensayos que evalúen el daño genotóxico en células de exfoliación. (Guzmán et al., 1997). La evaluación de micronúcleos en células de exfoliación de epitelio nasal, bucal, de esófago cérvix; ha sido validada como un dosímetro específico para exposición a carcinógenos en el hombre (Rosin, 1992). El propósito de este estudio es el de contar con una prueba complementaria a la prueba de Papanicolaou que permita incrementar la certeza en la detección temprana del cáncer, correlacionando los resultados de la evaluación genotóxica con los factores de alto riesgo para este tipo de cáncer. MATERIALES Y MÉTODOS Las muestras analizadas fueron obtenidas de 397 pacientes, 177 del Hospital de Especialidades del Niño y la Mujer (HENM, SSA), 48 del Hospital Los Ángeles ambos de la ciudad de Querétaro; y 172 muestras de la SSA de la ciudad de México del programa de detección temprana de cáncer cérvico. Las participantes no recibieron tratamiento previo de quimioterapia ó radioterapia, además de no presentar una historia clínica de infecciones crónicas, uso de drogas (incluyendo anticonceptivas), ó que estuvieran expuestas a radiaciones. Las muestras citológicas fueron obtenidas con un cepillo citológico del área del ectocérvix y endocérvix, y colectadas en 5 ml de buffer de fosfatos y centrifugado a 1200 rpm por 5 min. El botón celular fue resuspendido en una solución de metanolácido acético en una proporción 3:1 y centrifugado dos veces a las mismas condiciones. Posteriormente, el botón celular se resuspendió en 1 ml de la solución de metanol-ácido acético y la suspensión se goteó sobre portaobjetos limpios dejándose secar al aire. (Leal Garza et al., 2002). Posteriormente los frotis fueron teñidos mediante el método de Feulgen (Reactivo de Shiff s) (Tolbert et al., 1992) y fueron analizados por el conteo de al menos 1000 células por muestra, en un microscopio óptico con el objetivo de inmersión. El análisis de micronúcleos para los dos métodos empleados fue realizado de acuerdo a los criterios descritos por Sarto et al (1987) y Tolbert et al (1992). Quienes sugieren tres criterios específicos que incluyen: morfología, histoquímica y localización en la célula.

3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las muestras que no cumplieron con los criterios establecidos por Tolbert et al (1992), donde al menos por muestra se tuviera un conteo de 1000 células, obteniéndose así, un total de 77 muestras procesadas mediante la técnica de Feulgen y 191 casos para el análisis de células micronucleadas en Pap s. Las muestras se agruparon por grado de lesión de acuerdo a la clasificación de Bethesda, comparándose las FCMN de todos los grupos contra el control con el análisis de Kruskal-Wallis, ANOVA de una vía y la prueba post-hoc de Dunn s. La FCMN en las muestras teñidas con Feulgen, LEIBG no presentó diferencia significativa (P>0.05) con el control, contrario a LEIAG donde si se presentó una diferencia altamente significativa (P<0.001), entre LEIBG y LEIAG también se obtuvo una diferencia significativa pero no tan alta (P<0.01), ver Cuadro I. Cuadro I. Frecuencia de células micronucleadas en exfoliados cervicales de acuerdo a la clasificación Bethesda en la población total estudiada empleando la tinción de Feulgen. En el Cuadro II se muestran los datos obtenidos para los frotis de Pap s analizados, donde se observa como el promedio de la FCMN es mayor cuanto mayor es el grado de lesión, disminuyendo en el grupo clasificado con CEI pero aún manteniéndose superior al control negativo. Guzmán en 2003, reporta que la FCMN incrementa en paralelo con la severidad de los cambios fenotípicos (grado de lesión displásica) en la transición de bajo a alto grado de lesión. Para este grupo de frotis de Pap s cuando el control se comparó contra LEIAG en la prueba de Kruskal-Wallis se obtiene un valor de P< considerado extremadamente significativo. Cuadro II. Frecuencia de células micronucleadas en frotis de Pap s de acuerdo a la clasificación Bethesda. Se obtuvo una correlación entre los grados de lesión y la FCMN en las muestras teñidas con Fuelgen y en los frotis de Pap s de (r 2 =73.9) y (r 2 =65.61) respectivamente (Figura 1 A y B). Esta correlación indica la FCMN incrementa en paralelo con la severidad de los cambios fenotípicos en la transición de lesiones de bajo a alto grado, datos esperados hipotéticamente en este estudio.

4 A B FRECUENCIA CMN's N E G A T IV O LE IB G LE IA G GRADO DE LESION FRECUENCIA CMN's NEGATIVO LEIBG LEIAG GRADO DE LESION Figura 1. Correlación de frecuencia de células micronucleadas contra grado de lesión en A) muestras con tinción de Feulgen, B) en muestras en frotis de Pap s El cáncer cérvico uterino resulta de la progresión de lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (NIC I) -ó displasia leve- a lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado (NIC II y III) -ó displasia moderada y severa-. El paso de bajo a alto grado de lesión es caracterizado por incremento en atípias nucleares y fallas en la diferenciación celular progresivamente en capas superficiales del epitelio (IARC, 1995; Shiffman y Brinton, 1995). Estos cambios fenotípicos son acompañados por incremento en la inestabilidad cromosómica, así como pérdida ó ganancia de cromosomas ó fragmentación de cromosomas (Southern et al.,1997; Giannoudis et al., 2000), esto explica los resultados obtenidos en el incremento de la frecuencia de células micronucleadas de acuerdo a la severidad de la lesión. Amplia información epidemiológica muestra que la mayoría de LEIBG puede tener una regresión espontánea a la normalidad en 3 años y únicamente del 15 al 25% progresa a LEIAG, mientras que del 33 al 50% de LEIAG eventualmente podría pasar a CEI si no son tratadas, de ahí la importancia de contar con una prueba complementaria a la prueba de Papanicolaou que permita incrementar la certeza en la detección temprana del cáncer cérvico uterino. Los incrementos significativos de células micronucleadas en epitelio cervical de acuerdo a la severidad de la displasia, sugieren que esta prueba que evalúa micronúcleos puede ser de gran utilidad en el diagnóstico y evaluación de cáncer cérvico uterino y contribuye a la validación de este ensayo como un posible biomarcador de riesgo a cáncer (Guzmán et al., 2003).

5 CONCLUSIÓN El análisis microscópico de frotis de Pap s resultó práctico, sencillo y efectivo para la evaluación de células micronucleadas. El sistema de Bethesda es el más adecuado para la clasificación del grado de lesión, ya que demostrado ser muy útil para los estudios epidemiológicos de carcinogénesis cervical de multietapas (Shiffman y Brinton, 1995). De acuerdo a la hipótesis planteada, se observó un incremento significativo de micronúcleos en epitelio cervical de acuerdo al desarrollo neoplásico, sin embargo debido a la gran variabilidad de datos observada en los diferentes grados de lesión, se concluye que la prueba que evalúa la FCMN puede ser una valiosa herramienta para predecir presencia o ausencia de displasia pero no el nivel de la lesión. BIBLIOGRAFÍA 1. Giannoudis A., Evans M.F., Southern S.A., Herrington C.S. (2000) Basal keratinocyte tetrasomy in lowgrade squamous intra-epithelial lesions of the cervix is restricted to high and intermediate risk HPV infection but is not type-specific. Br. J Cancer 82: Guzmán, P., Gonsebatt, M. E., Vega L., Salazar, A. M., Montero, R., Blas, J., Del Razo, L. M., García- Vargas, G., Albores, A., Cebrián, M. E., Kelsh, M. and Ostrosky-Wegman, P. (1997). Cytogenetic effects in human exposure to arsenic, Mutat Res 386: Guzmán, P., Sotelo-Regil, R.C., Mohar, A., Gonsebatt, M. E. (2003) Positive correlation Between the Frecuency of Micronucleated Cells and Dysplasia in Papanicolaou Smears. Environ and Mol Mutag IARC. (1995). Monograph on the evaluation of carcinogenic risks in Human. Human papillomavirus. Vol.64. Lyon, France International Agency for Research on Cancer. World Health Organization. 5. Lazcano, P.E.C., Nájera, A.P., Alonso, R.P., Buiatti, E. y Hernández, A.M. (1996) Programa de Detección Oportuna de Cáncer Cervical en México. Diagnóstico situacional. Cancerología, Vol. 42, Núm. 3, pp Leal-Garza, C.H., Cerda-Flores, R.M., Leal-Elizondo, E. and Cortés-Gutierrez, E.I. Micronuclei in cervical smears and peripheral blood lymphocytes from women with and without cervical uterine cancer. Mutat. Res. 515: (2002): Mittelman, F., Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer, 5th. Edn., Wiley, N.York. 8. Rosin, M., (1992). Micronuclei as intermediate endpoints in intervention, In: The biology and prevention of aerodigestive tract cancers, Newell and Hong (Eds.), Plenum Press, N.York pp Sarto, F., Finotto, S., Giacomelli, L., Mazzotti, D., Tomanin, R. and Levis, A.G The micronucleus assay in exfoliated cells of the human buccal mucosa. Mutagenesis 2: Schiffman, M. H., Brinton, L.A The Epidemiology Cervical Carcinogenesis. Cancer Supplement 76: Secretaría de Salud. Dirección General de Epidemiología, Histopathological Registry of Malignant, SSA México, (1999). 12. Southern S., Evans M., Herrington S., (1997) Basal cell tetrasomy in low-grade cervical squamous intraepithelial lesions infected with hig-risk human papillomavirus. Cancer Res 57: Tolbert, P.E., Shy, C.M., and Allen, J.W.(1992). Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears methods development. Mutat Res 271: