El Laboratorio de Microbiología frente a las Emergencias Víricas: Virus Respiratorios (Re-)Emergentes

Transcripción

1 El Laboratorio de Microbiología frente a las Emergencias Víricas: Virus Respiratorios (Re-)Emergentes Andrés Antón Pagarolas aanton@vhebron.net Unidad de Virus Respiratorios - Servicio de Microbiología Hospital Universitari Vall d Hebron

2 Infección Respiratoria. Agentes Etiológicos / Infección Respiratoria. Las infecciones respiratorias, destacando la NAC, están causadas por diferentes microorganismos patógenos, como bacterias, virus, hongos y parásitos. En menos de un 50% de los casos se llega a un diagnóstico del agente etiológico causal (aún con los métodos moleculares). Semin Respir Crit Care Med 2012;33: Nuevos métodos diagnósticos más sensibles Nuevos métodos moleculares independientes de secuencia (NGS) Vacunación: S. pneumoniae, H. influenzae B (menor %) Bacterias Virus

3 Infección Respiratoria. Agentes Etiológicos. Los virus respiratorios más comunes asociados a infección respiratoria son: Virus de la gripe (A, B y C) Virus respiratorio sincitial (VRS-A y B) Virus parainfluenza (HVPI-1, 2, 3, 4a, 4b) Coronavirus (HCoV-229E, NL63, OC43, HKU1) Enterovirus (HEVA, B, C y D) Rinovirus (HRV-A, B y C) Parechovirus (HPeV1-6) Adenovirus (HAdVA-F) Metapneumovirus (HMPVA y B) Bocavirus (HBoV1-4) Poliomavirus (PyV KI y WU) Otros virus con menor frecuencia: Virus varicela-zoster Hantavirus Virus de Epstein Barr Herpesvirus 6 y 7 Virus del herpes simple Mimivirus Citomegalovirus (CMV) Virus del sarampión Curr Opin Pulm Med 2012, 18: En realidad el papel de algunos de los virus respiratorios ya reconocidos como causa etiológica de IRA todavía es discutido.

4 Infección Respiratoria. Virus (re)emergentes Virus zoonóticos: Cruzan barrera interespecie adaptación: Causa de brotes epidémicos (c/ o s/ estacionalidad) Causa de enfermedad respiratoria grave (casos esporádicos). Subtipos Virus de la Grip A: Drifted-seasonal viruses, H5N1, H3N2v, H7N9, H5N1, H5N8 SARS-CoV MERS-CoV EV-D68 HAdV-14 Virus respiratorios humanos: Desconocidos hasta el momento de ser revelada su presencia con los nuevos métodos moleculares de diagnóstico.

5 Infección Respiratoria. Métodos de Diagnóstico Microbiológico. En la mayoría de los casos, la inespecificidad del cuadro clínico hace necesaria la realización de un diagnóstico microbiológico para determinar el agente etiológico. Características Principales: Rápido: Herramienta apropiada en el manejo temprano de la infección. En caso de alerta sanitaria: detección precoz medidas Salud Pública. Fundamental: coordinación entre epidemiólogos, clínicos y microbiólogos. Preciso: Permite determinar el agente etiológico causal. Para: Tratamiento antiviral, si es posible. Cambio pauta antibiótica. Medidas de control para evitar transmisión nosocomial. Reducir coste pruebas diagnósticas adicionales. Mayor información (+ caracterización genética / fenotípica, + info clínica): Presentación clínica asociada a la infección. Coinfecciones virales / bacterianas asociadas (pronóstico) Gravedad / grupos de riesgo / estado inmunitario de la población Estacionalidad / vigilancia virológica / evolución genética. Diseño de vacunas / antivirales (gripe, VRS, hadv, )

6 Diagnóstico microbiológico. Opciones Disponibles. Recepción Muestras 0 días sem- meses POC-PCR Detección Antígeno PCR de Diagnóstico Aislamiento Cultivo celular Técnicas serológicas Detección Caracterización Tipado / Subtipado Resistencia Antivirales (M. genotípico) Epidemiología Molecular Adaptado de Bertelli C and Greub C. CMI 2013 NGS Resistencia Antivirales (M. fenotípico) Base datos local Identificación Sensibilidad Factores virulencia Tipado Base datos

7 Diagnóstico microbiológico. Alerta Sanitaria. Pero sin duda lo principal frente a una alerta sanitaria es actuar como muchos de los virus emergentes (virus ARN)... EVOLUCIÓN Y ADAPTACIÓN de nuestra metodología, recursos y conocimientos.

8 Diagnóstico microbiológico. Alerta Sanitaria. Y la primera pregunta antes de proceder a realizar/solicitar las primeras determinaciones para el diagnóstico: Sospecha clínica / Epidemiología MERS-CoV H7N9 La confirmación de laboratorio para virus emergentes debe realizarse en paralelo a la detección de los agentes etiológicos habitualmente detectados en la comunidad (sin demoras).

9 Diagnóstico microbiológico. Sospecha / Probable / Confirmado (MERS-CoV). Consultar definición de caso: MERS-CoV (14 July 2014): Confirmed case A person with laboratory confirmation of MERS-CoV infection,1 irrespective of clinical signs and symptoms. Laboratory confirmation: detection of viral nucleic acids or serology. Probable case A febrile acute respiratory illness with clinical, radiological, or histopathological evidence of pulmonary parenchymal disease (e.g. pneumonia or Acute Respiratory Distress Syndrome) AND Direct epidemiologic link with a confirmed MERS-CoV case AND Testing for MERS-CoV is unavailable, negative on a single inadequate specimen 3 or inconclusive 4 A febrile acute respiratory illness with clinical, radiological, or histopathological evidence of pulmonary parenchymal disease (e.g. pneumonia or Acute Respiratory Distress Syndrome) AND The person resides or travelled in the Middle East, or in countries where MERS-CoV is known to be circulating in dromedary camels or where human infections have recently occurred AND Testing for MERS-CoV is inconclusive. An acute febrile respiratory illness of any severity AND Direct epidemiologic link with a confirmed MERS- CoV case AND Testing for MERS-CoV is inconclusive. Direct Epidemiologic Link: The epidemiological link may have occurred within a 14-day period before or after the onset of illness in the case under consideration.

10 Diagnóstico microbiológico. Toma de la Muestra. Nuevos Métodos Diagnóstico & Viejos Problemas Toma de muestra: Determina en buena medida la sensibilidad de una técnica. Factores a tener en cuenta: Localización: tracto respiratorio superior (TRS) / inferior (TRI). Virus con gran tropismo TRI (MERS-CoV): las muestras de TRI (AT, BAL, esputo) presentan mayor carga viral, por lo que es posible TRS (-) / TRI (+). Tipo de muestra condiciona sensibilidad: ANF > FNF >> FOF / FF / FN. En el caso de algunos virus como MERS-CoV, se recomienda recoger otras muestras como sangre (suero), orina y heces (menor carga viral no Dx). Cuando (días desde inicio de los síntomas): A más días desde +0, menor excreción viral. Conservación en condiciones óptimas.

11 Diagnóstico microbiológico. Detección de Antígeno. Detección de antígeno (IC / IFA): Métodos basados en la detección directa/indirecta del antígeno viral utilizando anticuerpos monoclonales (inmunocromatografía capilar, IC; enzimoinmunoanálisis, EIA; o inmunofluorescencia, IF). Técnicas relativamente sencillas, rápidas y económicas. Presentan menor sensibilidad (IC: 10-75%; IFA: 50-80%) vs. los métodos moleculares (no se recomiendan en el paciente adulto: menor carga viral, menor periodo excreción, ). VPP elevado en periodo epidémico. Inconveniente: Posibles reacciones cruzadas entre virus relacionados (antigénicamente). Métodos comerciales: IFA: VGA, VGB, HAdV, HVPI-1, 2, 3, VRS y HMPV. IC: VGA, VGB y VRS. Para virus de la gripe las técnicas IC presentan una variabilidad en la sensibilidad según subtipos (especialmente para subtipos no estacionales) ==> NO SE RECOMIENDA su utilización. MERS-CoV (IFA): no disponibles (pendiente de diseño y comercialización)

12 Diagnóstico microbiológico. Métodos Moleculares. Métodos Moleculares: Demostración de la presencia de un virus respiratorio a partir de la detección de su material genético (ARN / ADN): PCR simple, PCR multiple, Nested-PCR, PCR en tiempo real, NASBA, LAMP, PCR+microarrays, PCR+EIA Ventajas: Rápido, sensible (5x). Identificar / detectar diferentes dianas (diferentes canales) (multiplex). No se ve afectado por pequeñas concentraciones residuales de antiviral. Capacidad para detectar virus no viables. Posibilidad de automatización: menor RRHH, menos errores, mayor rendimiento. Capacidad de adaptación de dianas / incorporación nuevas dianas. Inconvenientes: Presencia de inhibidores en algunas muestras. Exige revisión periódica para evitar perdida de sensibilidad por acumulación de mutaciones en las regiones diana (iniciadores y sondas) en cepas circulantes (problema: sistemas comerciales). Capacidad de cuantificación: valorable. Elevado coste vs. métodos detección de antígeno (IF).

13 Diagnóstico microbiológico. Métodos Moleculares. Métodos Moleculares: Métodos rápidos: VENTAJAS Simplicidad de uso Extracción + PCR + lectura Resultado rápido. Alta sensibilidad / especificidad. INCONVENIENTES Coste elevado. Patógeno-específico.

14 Métodos Moleculares. Influenza Virus (tipado / subtipado) Muestras clínicas Alícuotas Extracción ARN Colección PCR A/B (M, NP) Positiva PCR HA (16) / NA (9) Estudios adicionales Todas las muestras no tipables con Cts bajas (carga viral elevada) deben ser especialmente caracterizadas Negativa 5% Aislamiento CC

15 Métodos Moleculares. Influenza Virus (caracterización genética) Secuenciación (parcial / completa):

16 Métodos Moleculares. Influenza Virus (drifted viruses y reordenamientos) Secuenciación (parcial / completa):

17 Métodos Moleculares. Influenza Virus (Resistencia Antivirales) Métodos genotípicos: Emerg Infect Dis. 2015;21(1): Most patients infected with an oseltamivirresistant influenza A(H1N1)pdm09 virus had no prior exposure to oseltamivir. These findings are consistent with a low, and locally variable, level of circulation of resistant viruses. A(H1N1) H275Y Temp VIGILANCIA VIROLÓGICA (paciente hospitalizado)

18 Métodos Moleculares. Influenza Virus (Resistencia Antivirales) Scientifica (Cairo). 2014;2014: Mutaciones de Compensación (+H275Y): R222Q, V234M y D344N (ausencia de presión farmacológica) A(H1N1)pdm09 H275Y viruses was detected among patients without prior oseltamivir exposure V241I, N369K y N386S mutaciones de compensación? US A(H1N1)pdm : All had V241I and N369K. 10% of resistant viruses and 20% of susceptible viruses had an additional substitution (N386K) Emerg Infect Dis. 2015;21(1):136-41

19 C 100% Métodos Moleculares. Influenza Virus (Resistencia Antivirales) T:100% C:0% T 0% Secuenciación Sanger (parcial o completa de NA). RT-PCR Restriction-Fragment Length Polymorphism (RFLP) Real time RT-PCR: 5 Discriminación alélica (SNPs). C 81% Ultra-Deep Sequencing (por ejemplo, pirosecuenciación) E S G C A T C G A T A T 19% Ventajas: rapido, directo de muestra, sencillo. Desventajas: solo SNPs caracterizados, mezclas, correlación con fenotipo. C 24.9% T 75.1% C 0% T 100% Secuenciación Sanger (>20 %) Ultra-Deep Sequencing

20 Métodos Moleculares. MERS-CoV Caso confirmado: (1)Detección de al menos de dos dianas, o (2)Detección de una diana + secuenciación a partir de otra. Hasta el momento no se han detectado falsos resultados positivos al detectar otros coronavirus humanos (crossreactivity). Considerado muy sensible (screening) Confirmación Dos regiones genómicas: RNA dependent RNA polymerase (RdRp):muy conservada en hcov, y, gen Nucleocapside (N) No concluyente NC TGEV (G1a) 100 AY FIPV (G1a) 100 AF FIPV (G1a) DQ PRCV (G1a) EF btcov-hku2 (G1b) 100 NC HCoV-NL63 (G1b) AY NC btcov-hku8 (G1b) Alfa-CoV NC BtCoV/ 512/ 2005 (G1b) 100 NC BtCoV1A (G1b) NC BtCoV1B(G1b) NC PEDV (G1b) 100 AF AF HCoV-229E (G1b) 100 NC NC Gamma-CoV NC TCoV (G3a) AF TCoV (G3a) Gamma-CoV 84 NC IBV (G3a) 100 Z30541 NC MuCoV-HKU13 (G3c) NC BuCoV-HKU11 (G3c) Delta-CoV 99 NC ThCoV-HKU12 (G3c) 79 NC btcov-hku5 (G2c) NC btcov-hku4 (G2c) London1novelCoV2012nsp12(partial) N: nucleocapsed; Orf: open reading frame; RdRp: RNA-dependent RNA polymerase 79 0, NC btcov-hku9 (G2d) NC bat-sars-cov (G2b) AY SARS-CoV (G2b) 100 NC NC HCoV-HKU1 (G2a) 100 NC MHV (G2a) 99 X51939 AF SDAV NC ECoV (G2a) 97 AF BCoV (G2a) NC AY CRCV AF PHEV (G2a) NC AY HCoV-OC43 (G2a) 95 NC Beta-CoV

21 Métodos Moleculares. EV-D68 Phylogeny and GENETIC classification of thepicornaviridae. Shown is a maximum likelihood phylogeny of 38 picornaviruses representing species diversity based on the family-wide conserved proteins 1B, 1C, 1D, 2C, 3C, and 3D. J. Virol. April 2012 vol. 86 no Importante: Necesidad de revisar la sensibilidad y especificidad de nuestros métodos moleculares (también los comerciales).

22 Métodos de diagnóstico microbiológico. Aislamiento Cultivo Celular Aislamiento Cultivo Celular / Huevo Embrionado: Diagnóstico (3 21 días), en diferentes líneas celulares (según virus). Método más universal que métodos moleculares (no dependiente de secuencia), aunque sensible a divergencia genética (H3N2: MDCK / MDCK-SIAT1). Permite recuperar la cepa para estudios posteriores (selección de variantes in-vitro). Viabilidad / capacidad infectiva del virus. Confirmación aislamiento: IFA / IHA / Actividad Neuraminidasa. No se recomienda utilización de PCR para la confirmación del aislamiento. Nivel bioseguridad: gripe estacional (BSL-2), otros subtipos, MERS-CoV (BSL-3).

23 Métodos de diagnóstico microbiológico. Caracterización antigénica. Inhibición Hemaglutinación (IHA)

24 Influenza Virus. Resistencia Antivirales (métodos no moleculares) Métodos fenotípicos: Method Speed* Sensitivity Robust Reagent Cost Specialist Equipment Skill Level Standardised SOP Kit Available MUNANA 4-6 hrs $ Fluorimeter + No No NA Star 1-2hrs a $$$ Luminometer + Yes Yes, ABI Ventajas: Se puede cuantificar el perfil de resistencia de una cepa (actividad enzimática NA). Detecta cualquier cambio de sensibilidad: nuevas mutaciones, sinergia entre mutaciones, pérdida de actividad requiere asociación con carac. molecular. Inconvenientes: Siempre a partir de aislamiento en cultivo celular. Requiere estandarización (panel WHO). Requiere equipamiento adicional / entrenamiento. Los resultados no son comparables entre ambos métodos.

25 Métodos de diagnóstico microbiológico. Influenza A Virus Existe correlación entre la presencia (en diferentes % de una mezcla de variantes para una mutación caracterizada) y el perfil de resistencia observado.

26 Métodos de diagnóstico microbiológico. Métodos serológicos. Inhibición Hemaglutinación (Micro)neutralización Establece la presencia de anticuerpos frente a diferentes tipos / subtipos. Utilizado para virus de la gripe y otros con capacidad de hemaglutinación. Los títulos de los anticuerpos neutralizantes son fiables y representan estado real de protección (para virus capaces de replicar in-vitro) Diagnóstico (sueros pareados): suero fase aguda suero fase convalescente. Estudios sero-epidemiológicos: seroprevalencia. No se acostumbran a utilizar en laboratorio para diagnóstico (laboratorios de referencia). Dificil disponibilidad de reactivos comerciales para virus de la gripe no-estacionales. Se pueden necesitar condiciones BSL-3 para neutralización.

27 Métodos de diagnóstico microbiológico. Next Generation Sequencing (NGS) Los procesos en un laboratorio de Microbiologia se pueden clasificar en: 1. Detección. Aislamiento en cultivo celular. Detección de antígeno. Métodos moleculares. 2. Identificación. 3. Estudios de sensibilidad (antivirales). 4. Epi. / Caract. Molecular. Factores de virulencia. Mutaciones de resistencia. Estudios de epidemiologia molecular. Aplicaciones potenciales: Descubrimiento de patógenos (Metagenómica): independiente de secuencia de referencia. PLoS Pathog 2012;8: e Análisis de diversidad viral entre- y intra-huesped, y evolución(ultra-deep sequencing / Whole Genome Sequencing): Sensibilidad antivirales; Genotipado viral; Epidemiología molecular; Diseño nuevas antivirales y vacunas Estudios de interacción huesped-parásito (RNA-sequencing). Análisis del transcriptoma (factores virales con capacidad inmunomoduladoras, por ejemplo) Factores del huesped asociados a mayor susceptilidad / virulencia a la infección. Investigación factores del huesped y asociación con una mayor predisposición a la infección (genes involucrados en respuesta inmune), farmacogenómica (medicina personalizada). VIGILANCIA VIROLÓGICA

28 Virus (Re-)emergentes. Informació Adicional / Informació Actualitzada Influenza. World Health Organization (WHO) Coronavirus Infections. Global Alert and Response. WHO. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. WHO Global Influenza Surveillance Network. European Influenza Surveillance Network (EISN). European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). ECDC Communicable Disease Threats Reports (CDTR). _threatcommunicationcdtr.aspx

29 Andrés Antón Pagarolas Unitat de Virus Respiratoris / Secció de Virologia Laboratori de Microbiologia (segona planta, box 220) Hospital Universitari Vall d Hebron Grup de Recerca Consolidat (2014 SGR 1194) Passeig de la Vall d Hebron, Barcelona Tel (ext 6918)