11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C07K 14/ Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C07K 14/43 A61K 38/17 G01N 33/68 A61P 37/08 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación: Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Procedimiento para la producción de alergenos del veneno de la avispa con reactividad IgE reducida. Prioridad: DE Titular/es: MERCK PATENT GmbH Frankfurter Strasse Darmstadt, DE 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Suck, Roland; Cromwell, Oliver y Fiebig, Helmut 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Procedimiento para la producción de alergenos del veneno de la avispa con reactividad IgE reducida La invención se refiere a un procedimiento para la producción de alergenos, antígeno, de veneno de avispa recombinantes, pudiéndose diferenciar dichos alergenos mediante plegamientos (conformaciones) de naturaleza idéntica o de naturaleza diferente en función de la realización del procedimiento de producción. Una aplicación de las formas de plegamiento que se corresponden con la molécula natural, consiste en el diagnóstico diferencial de alergenos individuales (in vitro o in vivo) de alérgicos, especialmente de alérgicos a los venenos de insectos. Las formas de plegamiento de naturaleza diferente pueden utilizarse como medicamentos con pocas reacciones adversas para el tratamiento inmunológico específico. De esta forma, estas variantes de plegamiento recombinantes podrían constituir un tratamiento más seguro que las sustancias naturales. El procedimiento está ideado de manera que pueda llevarse a cabo una producción biotecnológica en condiciones que son obligatorias para los fármacos (BMP). Las avispas y las abejas de miel son las principales causas de alergias a la picadura de insectos y pueden conducir a síntomas sistémicos graves hasta la anafilaxia, que puede causar la muerte (Müller, U.R., en: Insect sting allergy, editorial Gustav Fischer; 1990). En cuanto a las sustancias que desencadenan la alergia de tipo 1, se trata de proteínas, glucoproteínas o polipéptidos del veneno del insecto. Estos alergenos reaccionan tras la inyección con las moléculas de IgE unidas a la superficie de los mastocitos en las personan sensibilizadas. Si este tipo de moléculas de IgE unidas a FcεRI se reticulan entre sí mediante un alergeno, esto conduce a una liberación de mediadores (por ejemplo, histamina, leucotrienos) y citocinas por la célula efectora y con ello a los síntomas clínicos correspondientes. Además del péptido melitina, actúan como componentes alergénicos del veneno de las abejas las enzimas hialuronidasa y fosfolipasa A2 (Habermann, E, 1972, Science 177, ). En el caso de las avispas, también aparecen como alergenos principales enzimáticamente activos una hialuronidasa, que es similar a la del veneno de las abejas (Hoffmann, D. R., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, ) y una fosfolipasa A1. El alergeno principal más importante del veneno de avispa es el antígeno para el que hasta la fecha no se podía demostrar ninguna actividad enzimática (King et al., 1978, Biochemistry 17, ). Ya se han caracterizado mediante biología molecular todos los alergenos mencionados y se han clonado las moléculas de ADNc correspondientes (entre otros Fang et al., 1988, PNAS, ; Soldatova et al., 1993, FEBS, ; Kuchler et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184, ). Con ayuda de las secuencias de ADNc es posible producir alergenos recombinantes que podrían encontrar aplicación en el diagnóstico y tratamiento de alergias (Scheiner y Kraft, 199, Allergy 0, ). En relación con la presente invención, el alergeno principal, antígeno, tiene una importancia especial, ya que la invención usa esta molécula. En este sentido, se trata de una proteína no glicosilada, de aproximadamente 2 kda de tamaño. La secuencia primaria comprende 8 restos de cisteína, que remite a cuatro puentes de disulfuro (Hoffman, D.R., 1993, J. Allergy Clin Immunol. 92: ). La inmunoterapia o hiposensibilización específica representa un enfoque clásico del tratamiento terapéutico eficaz de las alergias al veneno de los insectos (Müller, U.R., en: Insect sting allergy, editorial Gustav Fischer; 1990). En ese sentido, se inyecta a los pacientes dosis crecientes subcutáneas de extractos de alergeno naturales. En este método, existe sin embargo el peligro de reacciones alérgicas hasta choque anafiláctico. Como justamente en el caso de las hiposensibilizaciones en picaduras de insecto hay que contar con reacciones fuertes, por el momento se trata exclusivamente mediante hospitalización. Con los alergenos recombinantes, sería posible una optimización del tratamiento, especialmente en el caso de alergia a la picadura de insectos. Extractos de fuentes naturales de alergenos podrían desprender combinaciones definidas, dado el caso, ajustadas a patrones individuales de sensibilización de los pacientes, de alergenos altamente puros, producidos de manera recombinante (Scheiner y Kraft, 199). Las perspectivas realistas que pueden conducir a una hiposensibilización segura con tales alergenos recombinantes, ofrecen alergenos recombinantes, mutados de manera encauzada, en los que se eliminan específicamente los epítopos de IgE, sin dañar los epítopos de las células T esenciales para el tratamiento (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162, ). A partir de la expresión heteróloga en E. coli, se sabe que la mayoría de las proteínas eucarióticas no adoptan la conformación natural o sólo en una pequeña medida. Con frecuencia, una consecuencia de estos plegamientos inadecuados es la insolubilidad de estas proteínas. Esto se observa especialmente en el caso de las proteínas que contienen cisteína (Kuchier et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184, ). Se ha informado especialmente sobre el antígeno que la expresión en bacterias conduce a agregados insolubles, que no poseen la conformación natural (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif. 16(3):4-416). Tales agregados insolubles no son útiles ni para el diagnóstico ni para el tratamiento. King et al. (J. Immunol. 14(199) 77-84) describen un método para la producción recombinante de alergenos del veneno de avispón Dol m.02 en bacterias. Con frecuencia, las proteínas insolubles en E. coli se representan en un sistema de expresión eucariótico para fines de investigación, como por ejemplo levaduras o células de insectos (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif 16 (3):4-416; Soldatova et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol 1: ). Sin embargo, representan desventajas de los sistemas de expresión eucarióticos sobre todo posibles hiperglucosilaciones (Grobe et al., 1999, Eur J Biochem 263:33-), procesos proteolíticos de degradación y comparativamente pequeños rendimientos de producto (Glover y Hames (eds.), 199, Expression Systems, IRL Press, Oxford-Nueva York-Tokio). Por eso, tales proteínas no son en su 2

3 mayoría adecuadas para la aplicación alergológica en término de diagnóstico y tratamiento farmaceútico-médicos Los productos del procedimiento según la invención que poseen la conformación natural pueden aplicarse de manera ventajosa en el diagnóstico in vitro e in vivo de las alergias a picadura de avispa. Esta forma de plegamiento idéntica a la natural está disponible para la detección de anticuerpos IgE en procedimientos establecidos. Por otro lado, las variantes producidas con ayuda de la invención, que se caracterizan esencialmente por una conformación no reactiva mediante IgE o sólo parcialmente, pueden aplicarse como componentes hipoalergénicos en preparados para la inmunoterapia específica. Por la expresión hipoalergénicos, se entiende anteriormente y a continuación, según la invención una alergenicidad (frente al alergeno natural) de reducida a ausente, preferiblemente reducida del al 9%, especialmente del al 8%, que se produce por una respuesta de IgE reducida. En cuanto a la presente invención, se trata de un procedimiento con el que pueden producirse alergenos recombinantes en bacterias (E. coli). Mediante acumulación elevada de los agregados de proteína insolubles tiene lugar una primera etapa de purificación. Estos agregados se desnaturalizan entonces sin adición de medios de reducción. Se obtienen diferentes formas de plegamiento, en función de las condiciones de diálisis que se siguen. En este sentido, es decisivo que se trate de monómeros y moléculas solubles. Una de las variantes de plegamiento solubles posee una reactividad IgE comparable al alergeno natural y por consiguiente, puede utilizarse con fines diagnósticos. Un producto de este tipo se obtiene mediante diálisis con solución que contiene cisteína. Las otras variantes de plegamiento solubles alternativas son estructuralmente diferentes del alergeno natural y destacan por una reactividad IgE disminuida o ausente. Por esta razón, tales variantes son adecuadas para posibilitar una inmunoterapia mejorada. Un producto hipoalergénico de este tipo se obtiene según la invención mediante diálisis con tampones ácidos, preferiblemente en un intervalo de valores de ph entre 3, y 6,, especialmente entre 4,0 y,. El alergeno de veneno de avispa, antígeno, recombinante producido mediante un procedimiento según la invención se caracteriza porque posee una reactividad IgE o alergenicidad disminuida. Según la invención, la alergenicidad de esta proteína se reduce hasta el 9%, en comparación con el alergeno natural. Según la invención, se prefiere un alergeno de insecto avispa, antígeno, recombinante correspondiente de Vespula vulgaris y Vespula germanica. Además, es objeto de la invención un procedimiento para obtener alergenos de veneno de avispa, antígeno, recombinantes, esencialmente puros con alergenicidad o reactividad IgE disminuida, caracterizado porque - las proteínas alergenas se producen en células bacterianas en forma insoluble como inclusion bodies (cuerpos de inclusión), - dichos agregados insolubles se desnaturalizan sin adición de medios de reducción, - los productos desnaturalizados se convierten mediante diálisis en alergenos monoméricos, solubles utilizando tampones ácidos y - se lleva a cabo una diálisis final frente a agua destilada. Preferiblemente, dicha desnaturalización tiene lugar con cloruro de guanidinio. Preferiblemente, para la diálisis se utilizan tampones ácidos, preferiblemente tampón acetato de sodio con un valor de ph entre 4, y,0. Pero también es objeto de la invención un procedimiento para obtener alergenos de veneno de avispa recombinantes con alergenicidad o reactividad IgE normal, utilizándose en la primera diálisis soluciones que contienen cisteína en vez de tampones ácidos. Además, es objeto de la invención una preparación farmacéutica que contiene un correspondiente alergeno recombinante con reactividad IgE disminuida o atenuada, así como correspondientes sustancias adyuvantes y excipientes. Finalmente, es objeto de la invención el uso de alergenos de veneno de avispa, antígeno, con alergenicidad o reactividad IgE normal, que pueden obtenerse según un procedimiento descrito de manera correspondiente anteriormente o a continuación para el diagnóstico in vitro de alergias a picadura de avispa. A continuación, se describe el procedimiento en detalle: A modo de ejemplo, se clonaron los alergenos de veneno de avispa, antígeno de Vespula vulgaris (Ves v ) y antígeno de Vespula germanica (Ves g ) en el vector de expresión pse4 y se transformaron en la cepa bacteriana K12 M1 prep4. En la figura 1 se encuentra un esquema de flujo del procedimiento. Para la producción de los alergenos recombinantes se necesita un cultivo previo de la cepa para inocular el cultivo de expresión. La expresión, inducida mediante IPTG, tiene lugar en un matraz con deflector a 37ºC en medio LB y aporte limitado de oxígeno (90 rpm/min). Las bacterias se recogen mediante centrifugación después de expresión 3

4 1 2 durante horas (000 xg, min, ºC). La disgregación de las bacterias se produce después de la resuspensión de las células en tampón (Tris / HCl 0 mm, 2% (p/v) de sacarosa, ph 8,0) mediante adición de lisozima ( µg/g de peso seco). Le sigue la adición del mismo volumen de solución detergente (NaCl 0,2 M, 1% (p/v) de DOC, 1% (p/v) de Nonidet P). Esta solución de disgregación se trata a continuación con ultrasonidos (3 min sobre hielo, 1 vatios, 0, s de impulso). Como los productos de expresión se presentan principalmente como agregados insolubles (cuerpos de inclusión, inclusion bodies ), debido a su alta densidad pueden separarse de una gran parte de los componentes restantes (fragmentos de pared celular, ribosomas, etc.) mediante centrifugación a 00 xg. La otra purificación tiene lugar mediante tres etapas de lavado sucesivas con soluciones que contienen detergente (1% de Triton X-0). A continuación, se desintegran los cuerpos de inclusión purificados mediante adición de tampón de desnaturalización (cloruro de guanidinio 6M, Tris / HCl mm, ph 8,0) y se agitan durante 2 h a temperatura ambiente. Para obtener formas de plegamiento reactivas por IgE, la mezcla básica de desnaturalización se llena en un tubo flexible de diálisis (límite de disgregación kda) y se dializa frente al volumen de solución de cisteína 0 veces mayor (cisteína mm) durante 12 h, con agitación a temperatura ambiente. A continuación, tiene lugar una diálisis frente a agua destilada para eliminar la cisteína. Para obtener conformaciones con reactividad IgE disminuida, la primera diálisis se lleva a cabo frente a tampón acetato de sodio mm (ph,0). También aquí tiene lugar otra diálisis frente a agua destilada. Tras la extracción, los alergenos solubles en agua se separan de los agregados precipitados mediante centrifugación. El sobrenadante contiene los alergenos recombinantes solubles deseados. En vez de tampón acetato de sodio también pueden utilizarse otros tampones ácidos que tienen capacidad tampón en un intervalo de 3, a 6,, preferiblemente entre 4,0 y,. Ejemplos de tales sistemas tampón se describen de manera suficiente en la bibliografía. Los alergenos recombinantes precipitados que se producen en ambos métodos pueden desnaturalizarse de nuevo y tratarse según el mismo esquema. De esta forma se aumenta claramente el rendimiento. Después de las etapas de diálisis, los productos son en casi un 9% puros. Otras etapas de purificación de los alergenos de veneno de insectos básicos son cromatografía de intercambio de cationes (tampón ph 7,2) con por ejemplo Source S (Pharmacia, Friburgo, Alemania) y filtración en gel. La filtración en gel sirve, además de para separar impurezas mínimas de peso molecular alto y bajo, también para desalar. Los controles de calidad de los productos se basan en las siguientes propiedades características, que se recogen a modo de tabla para el antígeno : nantígeno = antígeno natural 3 Propiedad Plegamiento con reactividad IgE Plegamiento con reactividad IgE natural disminuida PM aparente en la SDS-PAGE 2 kda kda (condición no limitante) Concentración de sal para la NaCl 3 mm NaCl 0 mm elución en la Source S 4 0 Escisión con proteasa V8 Fragmento 1 kda + Péptido Péptido < kda Anticuerpos monoclonales Detección mediante 8E3, 1E11 Detección sólo posible con 8E3 específicos para el antígeno Frecuencia de reactividad IgE > 9% < % con sueros de alérgicos Potencia alergénica Similar a nantígeno > veces inferior a nag El experto conoce y tiene acceso a las técnicas de purificación utilizadas, así como a las técnicas de clonación y expresión recombinantes que pueden sustituirse mediante técnicas de procedimiento similares conocidas. 6 4

5 REIVINDICACIONES Procedimiento para obtener alergenos de veneno de avispa, antígeno, recombinantes, esencialmente puros con alergenicidad y reactividad IgE disminuida, caracterizado porque - las proteínas alergenas se producen en células bacterianas en forma insoluble como inclusion bodies (cuerpos de inclusión), - dichos agregados insolubles se desnaturalizan sin adición de medios de reducción, - los productos desnaturalizados se convierten mediante diálisis en alergenos monoméricos, solubles utilizando tampones ácidos y - se lleva a cabo una diálisis final frente a agua destilada. 2. Procedimiento según al reivindicación 1, caracterizado porque la desnaturalización tiene lugar con cloruro de guanidinio. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se utiliza un tampón con un valor de ph entre 3, y 6, en la diálisis. 4. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utilizan alergenos de la especie Vespula spp., especialmente Vespula vulgaris y Vespula germanica y Paravespula spp.. Preparación farmacéutica que contiene un alergeno recombinante, producido según uno de los procedimientos descritos en las reivindicaciones 1 a 4, así como sustancias adyuvantes y excipientes correspondientes. 6. Uso de alergeno de veneno de avispa, antígeno, obtenido según uno de los procedimientos descritos en las reivindicaciones 1 a 4, para la producción de un medicamento para la inmunoterapia o hiposensibilización específica de alérgicos al veneno de avispa. 7. Procedimiento para obtener alergenos de veneno de avispa, antígeno, recombinantes con alergenicidad o reactividad IgE normal, caracterizado porque las etapas de procedimiento se llevan a cabo según una o varias de las reivindicaciones 1 ó 2, utilizándose sin embargo en la primera diálisis soluciones que contienen cisteína en vez de tampón ácido. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque se utilizan alergenos de la especie Vespula spp., especialmente Vespula vulgaris y Vespula germanica y Paravespula spp. 9. Uso de alergenos de veneno de avispa, antígeno, que se obtienen según uno de los procedimientos descritos en las reivindicaciones 7 u 8, para el diagnóstico in vitro de alergias a la picadura de avispa

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