IMITAN LAS CÉLULAS CANCERÍGENAS LA ESTRATEGIA DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS PARA SER INMORTALES?

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1 IMITAN LAS CÉLULAS CANCERÍGENAS LA ESTRATEGIA DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS PARA SER INMORTALES? Investigadores principales: Dra. Matilde Ester Lleonart Pajarín Hospital Universitari Vall d Hebron Dr. Zhao-Qi Wang Internacional Agency for Research on Cancer, Lyon Dr. David Hugh Beach Oncology Laboratory at the WIBR, UCL, London Duración:3 años

2 1. Resumen Las células embrionarias poseen un genoma normal en contraposición con las células cancerígenas, que poseen un genoma con múltiples mutaciones. Sin embargo, ambas crecen indefinidamente y son, por tanto, inmortales. Objetivo La finalidad de este proyecto es investigar si los genes expresados por las células madre embrionarias son capaces de burlar la senescencia en células primarias (por ejemplo, MEF). Dado el similar comportamiento en términos de inmortalidad de las células madre embrionarias y las células cancerígenas, hipotetizamos que genes expresados por células madre embrionarias pudiesen desempeñar un papel importante en procesos proliferativos como el cáncer. Genes característicos de células madre se descubrirán al llevar a cabo una búsqueda genética, de los cuales determinaremos si poseen un papel relevante en tumores humanos. Este proyecto posee importantes aplicaciones en cáncer que podrán abrir el campo a nuevas aplicaciones en terapia génica. Metodología Células primarias MEF se infectarán con una biblioteca de cdna procedente de células embrionarias murinas. Para ello emplearán los vectores retrovirales MaRx. Tras la infección, las células MEF se sembrarán a baja densidad y los clones proliferativos emergerán a las 3-4 semanas. Los clones se aislarán, se extraerá el DNA, RNA y se amplificará por PCR el fragmento clonado. Dicho cdna se clonará en vectores retrovirales, con los cuales infectaremos a su vez células primarias y de tal modo procederemos a su completa caracterización. Resultados esperables Nuevos genes serán identificados y exhaustivamente caracterizados. Dicha caracterización revelará futuras herramientas moleculares para tratar y 2

3 combatir el cáncer mediante la inhibición de las posibles proteínas oncogénicas resultantes. 2. Resultados Células madre embrionarias son células inmortalizadas cuya tasa proliferativa es comparable a las células carcinogénicas. Por tanto, hemos estudiado la expresión de genes característicos de células madre embrionarias, en células primarias. Con este propósito se ha llevado a cabo una búsqueda genética infectando células MEF con una biblioteca de cdna de células madre embrionarias. Esto ha dado lugar a la identificación y caracterización de varios genes. Uno de ellos, la proteína ribosomal Rplp1, pertenece al tipo de proteínas ribosomales del grupo P. Nuestros resultados han mostrado que Rplp1 incrementa tanto la expresión del promotor de E2F como la expresión de su principal diana, la ciclina E, en MEF. Por tanto, nuestro estudio ha sido pionero en demostrar que la sobreexpresión de una única proteína ribosomal, Rplp1, es causa y no consecuencia de inmortalización celular. Además, la coexpresión de Rplp1 con un mutante del gen ras Val12, contribuye a la transformación en células NIH3T3 tal y como hemos comprobado por la aparición de colonias en soft agar. Es importante observar que la expresión de Rplp1 aumenta en diferentes líneas celulares (MEF, NIH3T3) tras la expresión de un mutante negativo del gen p53 (p53 R175H ). Por tanto, la mutación de p53 puede facilitar la inmortalización in vitro mediante la inducción de Rplp1. Es interesante el hecho de que Rplp1 en mrna y proteína están sobreexpresados en diferentes tipos de tumores humanos, un descubrimiento que puede abrir nuevos campos terapéuticos en cáncer. Hemos de resaltar que la expresión de las proteínas P que aparte de Rplp1 incluye Rplp0 y Rplp2 pueden ser un indicador pronóstico clave en subtipos histológicos específicos de tumores ginecológicos. Otro gen identificado por su habilidad de burlar la senescencia replicativa en MEF es CIRP. Hemos demostrado que la sobreexpresión de CIRP aumenta la 3

4 fosforilación de ERK1/2 y el tratamiento con un inhibidor de MEK disminuye la proliferación celular causada por la sobreexpresión de CIRP. En contraposición, la inhibición de CIRP mediante RNAi disminuye la proliferación celular, implicando la inhibición de P-ERK1/2. Nuestras investigaciones son la primera evidencia de que la activación de P-ERK1/2 un mecanismo que se activa con la sobreexpresión de un mutante del gen ras Val12 para inducir senescencia prematura es capaz de burlar la senescencia replicativa. Nuestras investigaciones muestran además que CIRP funciona estimulando la síntesis general de proteínas, aumentando los niveles de fosforilación de S6 y 4E-BP1 y resultando un efecto global de la sobreexpresión de CIRP en MEF, que se traduce en un incremento de la actividad quinasa de los complejos ciclinad1-cdk4. Es de gran interés que CIRP se sobreexpresa en RNA y proteína en diversos tumores humanos, un descubrimiento con perspectivas en cuanto a aplicabilidad clínica. Por otro lado, con la idea de descubrir nuevos genes supresores de tumor, hemos llevado a cabo una búsqueda genética para estudiar los genes cuya pérdida de función provoca inmortalización. El estudio se ha enfocado a la caracterización exhaustiva de SAHH (S-adenosylhomocysteine hydrolase). La inactivación de SAHH confiere resistencia a la parada inducida tanto por p53 como por p16 INK4A. Además, hemos demostrado que la inactivación de SAHH inhibe la actividad transcripcional e impide la activación del gen supresor de tumor p21 Cip1 tras el tratamiento con agentes que dañan el DNA. Dado que la inhibición de SAHH modula senescencia en células primarias, también estudiamos la expresión de SAHH en tumores humanos. La expresión del mrna de SAHH se pierde en un 50% de los tipos de tumores de un total de 206 pacientes con los cánceres más frecuentes (colon, mama, pulmón, riñón, etc.). Además, en otros pacientes la proteína SAHH aparece sobreexpresada; lo cual puede indicar dos tipos diferentes de regulación para este potencial gen supresor de tumor. 4

5 Por otro lado, la sobreexpresión de ras G12V en células primarias induce senescencia prematura (senescencia inducida por oncogenes). Basados en este tipo de senescencia, hemos sobreexpresado en células mamarias humanas parcialmente inmortalizadas una biblioteca de microrna y de RNAi (RNA interferentes) para identificar mediadores de la senescencia inducida por ras G12V. Hemos descubierto que la inhibición únicamente del gen supresor p21 Cip1 burla la senescencia inducida por ras G12V. Además hemos identificado un total de 28 microrna que producen el mismo efecto, de entre los cuales hay una gran mayoría que pertenecen a la familia del 106b. De forma evidente hemos demostrado que la mayoría de estos 28 microrna son capaces de burlar la senescencia inducida por oncogenes debido a la inhibición, indirecta en la mayoría de los casos, de p21 Cip1. Nuestros datos establecen un papel clave para p21 Cip1 como inhibidor del ciclo celular en la proliferación celular en el modelo celular de HMEC (Human mamalian epithelial cells) y extendemos el repertorio de microrna que modulan la actividad de este gen supresor de tumor. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Mediante el uso de sistemas genéticos complejos que incluyen el diseño y uso de bibliotecas de cdna, hemos caracterizado varios genes implicados en senescencia/inmortalización cuyo papel es clave en cánceres humanos: Rplp1, CIRP, SAHH. Hemos descubierto que la sobreexpresión de Rplp1 y CIRP burla la senescencia replicativa en células primarias, provocando inmortalización celular. Estas proteínas se comportan como proteínas oncogénicas (Artero-Castro et al., 2009a; Artero-Castro et al., 2009b). Por el contrario, dado que la inhibición de SAHH provoca inmortalización, SAHH es un posible gen supresor de tumor (Leal et al., 2008). Por otro lado, hemos descubierto un total de 28 microrna que burlan la senescencia inducida por ras Val12 ; un efecto que ocurre a través de la inhibición del gen supresor p21 Cip1 (Lleonart et al., 2010). 5

6 Con este proyecto hemos demostrado que la inhibición de CIRP reduce la proliferación de las células cancerígenas tales como las HeLa y TERA2. Nuestros resultados han sido recientemente corroborados por Zeng (Zeng et al., 2009), que ha demostrado que la inhibición de CIRP en líneas celulares de próstata no sólo impide la supervivencia celular, sino que sensibiliza las células al tratamiento de agentes quimioterápicos como el cisplatino y la adriamicina. La posibilidad de que la inhibición de CIRP una proteína que se activa en respuesta a estrés y en condiciones de hipoxia pueda causar in vivo la reversibilidad tumoral es un reto a alcanzar próximamente en tratamientos anticáncer. Por último, Rplp1 se ha revelado igualmente como una proteína oncogénica y al igual que CIRP se ha observado sobreexpresado en cánceres humanos tanto en RNA como proteína. Por tanto, la mayor relevancia de nuestros resultados radica en que la modulación farmacológica de CIRP, Rplp1, SAHH y/o los 28 microrna descubiertos puedan representar una nueva estrategia terapéutica contra el cáncer como recientemente hemos propuesto para alguno de ellos Lleonart ME, 2009). Nuestra finalidad ahora es diseñar compuestos químicos que inactiven CIRP, Rplp1 o los microrna con mayor potencial oncogénico, lo cual representa un reto en el futuro a medio/largo plazo. Ya que muchos de los microrna descubiertos se han asociado a procesos inflamatorios y metástasis, su inactivación mediante moléculas antimir representa un campo de perspectivas innovadoras y un reto a seguir en biología, medicina y terapia en el futuro. 4. Publicaciones 1. A Artero-Castro, J Castellvi, A García, J Hernández, S Ramón y Cajal and ME Lleonart. Expression of the ribosomal proteins Rplp0, Rplp1 and Rplp2 in gynecological tumors Human Pathology ((segunda revisión). 6

7 2. Lleonart ME, Borgoff V, Bishop C, Fessart D, Bergin A-M, Beach DH. Multiple micrornas bypass ras-induced senescence. Oncogene, 2010, 25 Jan. 3. Lleonart ME. Cold-inducible RNA binding proteins: A new generation of proto-oncogenes. BBA Rev Cancer, 2010, 1805: L López, G Armengol, B Pons, E Argelaguet, ME Lleonart, J Hernández, I Torres, S Ramon y Cajal. Regulation of replicative and stress-induced senescence by RSK4, which is downregulated in human tumors. A potencial hallmark factor of senescence mediating pathways. Clinical Cancer Research, 2009, 15(14): Artero-Castro b A, Kondoh H, P Fernández-Marcos, Serrano M, Ramón y Cajal S and Lleonart ME. Rplp1 bypasses replicative senescence and contributes to transformation. Experimental Cell Research, 2009, 315(8): Artero-Castro a A, FB Callejas, J Castellvi, H Kondoh, A Carnero, PJ Fernández-Marcos, M Serrano, S Ramón y Cajal and ME Lleonart. CIRP modulates life-span in primary MEFs. Molecular and Cellular Biology, 2009, 29(7): Lleonart ME, Artero-Castro A, Kondoh H. Senescence induction; a possible cancer therapy. Molecular Cancer. 2009, 8;8(1):3. 8. H Kondoh, ME Lleonart, Y. Nakashima, T. Maruyama, M. Yokode, M. Tanaka, D Bernard, J. Gil. Essential metabolic characteristics in murine ES and primary cells to bypass 7

8 senescence. Invited review. Medical Hypotheses and Research, 2008, 4, Leal JF, Fominaya J, Cascón A, Guijarro MV, Blanco-Aparicio C, Lleonart M, Castro ME, Ramon Y Cajal S, Robledo M, Beach DH, Carnero A. Cellular senescence bypass screen identifies new putative tumor suppressor genes. Oncogene, 2008, Mar 27;27(14): H Kondoh, T Maruyama and ME Lleonart. Senescence as a target for cancer therapy. Invited review. Open Pathology, 2008, Vol. 2: Castro ME, Ferrer I, Cascón A, Guijarro MV, Lleonart ME, Cajal SR, Leal JF, Robledo M, Carnero A. PPP1CA contributes to the senescence program induced by oncogenic Ras. Carcinogenesis, 2008 Mar; 29(3): Castro ME, Leal JF, Lleonart ME, Ramon Y Cajal S, Carnero A. Loss-of-function genetic screening identifies a cluster of ribosomal proteins regulating p53 function. Carcinogenesis, 2008 Jul;29(7): Leal JF, Blanco-Aparicio, C, Ferrer, I, Hernández-Losa J, Ramón y Cajal S, Carnero A, and Lleonart ME. S-Adenosyl homocytein hydrolase downregulation contributes to tumorigenesis. Carcinogenesis, (7): Guijarro MV, Leal JF, Blanco-Aparicio C, Alonso S, Fominaya J, Lleonart M.E., Castellvi J, Ramon Y Cajal S, Carnero A. MAP17 enhances the malignant behaviour of tumor cells through ROS increase. 8

9 Carcinogenesis, 2007 Oct;28(10): Guijarro MV, Leal JF, Fominaya J, Blanco-Aparicio C, Alonso S, Lleonart M.E., Castellvi J, Ruiz L, Ramon y Cajal S, Carnero A. MAP17 overexpression is a common characteristic of carcinomas. Carcinogenesis, 2007 Aug;28(8): Lleonart M.E., Kondoh H, Nakashima Y, Yokode M, Tanaka M, Bernard D, Gil J, Beach D. A High Glycolytic Flux Supports the Proliferative Potential of Murine Embryonic Stem cells. Antioxidant Redox Signaling 2007 Mar;9(3): Kondoh H, Lleonart M.E., Bernard D, Gil J. Protection from oxidative stress by enhanced glycolisis, a possible mechanism of cellular immortalisation. Histology & Histopathology, 2007 Vol. 22(1):