Investigador principal: Dr. Santiago Ramón y Cajal Hospital Universitari Vall d Hebron Duración: 3 años

Transcripción

1 ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS GENES DE SENESCENCIA Y FACTORES PIVOTE O COMODÍN EN SEÑALIZACIÓN CELULAR, ANGIOGÉNESIS E INVASIVIDAD EN CARCINOMAS DE COLON Y MAMA. UNA CORRELACIÓN CLÍNICO- PATOLÓGICA Investigador principal: Dr. Santiago Ramón y Cajal Hospital Universitari Vall d Hebron Duración: 3 años

2 1. Resumen Objetivos principales: 1. Estudiar las proteínas principales de cada vía bioquímica central (ciclo celular, apoptosis, señalización, angiogénesis e invasividad) e identificar el factor pivote o comodín que refleja el rol oncogénico de cada una, independientemente de la alteración oncogénica previa desencadenante del tumor. 2. Estudio de alteraciones en genes de senescencia y su relación en la transformación tumoral, dada la inmortalidad y falta de senescencia de las células malignas. Metodología Se estudiarán 200 pacientes con carcinoma de mama y 200 colorrectales. Además se incluirán 50 lesiones displásticas y 50 metástasis ganglionares de los dos grupos y 50 metástasis a distancia colorrectal. Los pacientes estarán clínicamente protocolizados con seguimiento mínimo de tres años. La expresión proteica se analizará mediante inmunohistoquímica en arrays tisulares y Western Blot. Para los genes de senescencia se estudiarán niveles de mrna por RT-PCR cuantitativa a tiempo real. Se analizarán: Senescencia: RSK4, HTATIP/TIP60, HDAC4, KIAA0828, CCT2, Arasa, Csn2, HBRF y p53. Señalización: receptores de factores de crecimiento, pakt, PTEN, pmapk, cascada de mtor. Ciclo celular: ciclina D1-CDK4, pprb, Ki-67. Apoptosis: survivina, livina. 2

3 Invasividad y angiogénesis: receptores de proteina quinasa-c (RACK1), Src, HIF1alfa, VEGF. Centrosomas y estabilidad genética: pericentrina, gama-tubulina. Resultados esperados: después de estudiar los factores más representativos de cada vía, intentaremos identificar la impronta oncogénica y el factor comodín de cada vía, independientemente de la alteración oncogénica que haya determinado el tumor. Nuestros resultados pueden servir para proponer un modelo sencillo y estandarizado para el estudio molecular funcional del carcinoma mamario y colorrectal. El seguimiento clínico de los pacientes permitirá realizar una correlación clínico-patológica y molecular. 2. Resultados a) Estudio de factores embudo de la señalización celular en tumores. A lo largo de todo el estudio se realizó una selección retrospectiva de casos y la reevaluación patológica correspondiente. Se diseñaron microarrays de tejido con las muestras seleccionadas y los diferentes anticuerpos han sido validados mediante estudios de Western Blot. Se estudiaron 203 casos de cáncer de mama mediante inmunohistoquímica en microarrays de tejido para las proteínas HER2/neu, EGFR, ER, PR, ERK1/2, Akt, 4EBP1, eif4y, p70s6k1, S6 y Ki67, eif4e y eif4g, corroborando los resultados en 50 tumores de mama mediante estudios de Western Blot. Un 82% de los tumores expresaban p4ebp1, pero en un 17% de estos tumores no se detectó activación concomitante de las vías de señalización. Es interesante destacar que p4ebp1 se expresaba principalmente en tumores pobremente diferenciados y se correlacionaba con el tamaño del tumor, presencia de metástasis en nódulos linfáticos y aumento de recurrencia loco-regional. 3

4 También se realizó el mismo estudio en 129 tumores epiteliales. Mientras que EGFR, p-akt, p-mapk y p-s6 no mostraron diferencias entre tumores benignos, borderline y malignos, c-erbb2, p-4bebp1 y p-p70s6k se expresaban más frecuentemente en los casos malignos, de forma significativa. Sólo la expresión de p-4ebp1 mostró una significancia en el pronóstico, y en el análisis multivariado sólo se correlacionaron significativamente el estadio quirúrgico y la expresión de p-4bp1. El estudio también incluía 130 tumores de endometrio, 85 gliomas y 120 tumores de colon. En todos ellos se realizó a nivel inmunohistóquímico el estudio completo de los diferentes factores. Del análisis de nuestras series y su correlación clínico-patológica se constataba que la sobreexpresión de la forma fosforilada del factor 4EBP1 se asociaba a grado de malignidad y pronóstico en los tumores de mama y de ovario y en los gliomas. En los tumores de colon se asociaba a metástasis linfáticas y en los de endometrio con grado de malignidad. Dado que la sobreexpresión de factor 4EBP1 se observó en más de un 30% de tumores que no mostraban una concomitante sobreexpresión de HER1 y/o HER2 y/o MAPK y/o p-akt, se postuló que la fosforilación de 4EBP1 podía ser intervenida por otras quinasas. Por ello, se realizaron experimentos para caracterizar la expresión de 4EBP1 in vitro. Por un lado, se analizaron posibles candidatos a activar esta quinasa mediante screening de 50 sirna de diferentes quinasas y se ha analizado el estado de fosforilación de 4EBP1 en respuesta a la inhibición de las diferentes quinasas escogidas y, por otro lado, se utilizaron diferentes mutantes de 4EBP1 que eran capaces de fosforilarse y se estudió la sobreexpresión de estas formas junto con el factor eif4e. Del estudio de las quinasas 4

5 activadoras de 4EBP1, han aparecido varias candidatas, como LRRK2, RAF-1, p38γ, GSK3β, AMPKα, PRKACA, PRKACB i PRKACB1 las cuales disminuyen los niveles totales de 4EBP1 y apareció otra serie de quinases, como son SRC, PAK2, p38β, JNK2 y AKT1, que bajaban los niveles de fosforilación de 4EBP1. De todas ellas hemos empezado a caracterizar LRRK2, cuya activación hace disminuir los niveles de 4EBP1 y no así de 4EBP2. Tras los estudios de sobreexpresión in vitro, se observó que tanto las formas wt y mutante de 4I-BP1, tenía un efecto tóxico en células de carcinoma de mama. Posteriormente se amplió el estudio a ratones desnudos, dónde se analizó y comparó la expresión de 4EBP1 fosforilado con su mutante, concluyendo, al igual que pasaba in vitro, que ambas construcciones ralentizaban el crecimiento tumoral. b) Estudio de las alteraciones de los genes implicados en senescencia celular. Se estudiaron 40 carcinomas de colon, 20 de próstata, 20 de riñón y 20 de pulmón para investigar los genes RPS6KA6, HDAC4, KIAA0828, TCP1 y Tip60. Se extrajo RNA de tejido tumoral y normal de cada paciente y se realizó RT-PCR a tiempo real con sondas para estos genes y para p53. En los carcinomas de colon, los genes RPS6KA6, HDAC4, KIAA0828 y Tip60 estaban reprimidos en el tejido tumoral comparado con el normal. En los carcinomas de pulmón HDAC4, KIAA0820 y Tip60 también estaban reprimidos. En los carcinomas de próstata no se observaron diferencias significativas. La expresión del mrna de estos genes puede controlar la función de p53, así como la vía RAS-MAPK y los programas de metilación i transcripción celular. Estos resultados pueden revelar un nuevo grupo de genes relacionados con p53 y senescencia en tumores humanos. Centrándonos en el papel de RSK4, se han estudiado los mecanismos bioquímicos que conducen a la senescencia en las células 5

6 sobreexpresando este gen. En un primer estudio se observó que los niveles endógenos de RSK4 aumentaban tanto en senescencia replicativa como en senescencia prematura. Asimismo se observó que la inhibición de RSK4 mediante shrna inmortalizaba parcialmente la línea de fibroblastos humanos diploides IMR90, confería resistencia a la senescencia prematura inducida con dosis subcitotóxicas de cisplatino e impedía que las células entraran en senescencia tras la activación del oncogén Braf. Esta última parte se realizó en colaboración con el Dr. Daniel Peeper (The Netherland Cancer Institute, Amsterdam). Finalmente, para estudiar la implicación de RSK4 en alguna de las dos grandes vías de señalización que comportan a la senescencia celular, se generaron líneas celulares que no expresaran p53, p21 o Rb. En éstas se sobreexpresó RSK4 y se observó que la senescencia a través de RSK4 es independiente de p53, pero dependiente tanto de p21 como de Rb. Con todos estos datos obtenidos tanto del estudio en tumores como in Vitro, proponemos RSK4 como un posible gen supresor de tumores. El hecho de que RSK4 se exprese en menor cantidad en fases tempranas de la tumorigénesis puede permitir a las células su inmortalización y evitar la senescencia tras alteraciones genéticas como la activación del oncogén Braf, favoreciendo la transformación tumoral. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Tras el estudio desarrollado a lo largo de los 3 años, se ha conseguido demostrar que la sobreexpresión de la forma fosforilada del factor 4EBP1 se asocia con el grado de malignidad y pronóstico en los tumores de mama y de ovario y en los gliomas. En los tumores de colon se ha asociado con la presencia de metástasis linfáticas y en los 6

7 de endometrio con grado de malignidad. De esta manera se ha establecido un nuevo y potente marcador pronóstico que en el futuro deberá ser evaluado con detalle en estas entidades tumorales y que, como se ha visto hasta la fecha, se da de manera independiente de las diferentes alteraciones moleculares establecidas upstream de su vía de señalización, confirmando su papel de factor canalizador o embudo de diferentes rutas de transducción de señales. Por otro lado, se ha establecido el papel del gen RSK4 no solamente como candidato a ser supresor de tumores per se, sino un papel activo en los procesos de senescencia celular, cuya ausencia puede contribuir de manera significativa a la transformación tumoral en presencia de activaciones moleculares de genes como B-RAF presentes en un gran porcentaje de tumores de colon y riñón. Con la incorporación de estos nuevos marcadores moleculares, se amplía el conocimiento de la evolución de las diferentes neoplasias estudiadas, estableciendo una mayor fiabilidad en el pronóstico de estas entidades. Además, este estudio será la base de diferentes líneas de investigación que planteen nuevos abordajes farmacológicos frente a estos marcadores. 4. Publicaciones ME Lleonart, F Vidal, D Gallardo, M Diaz-Fuertes, F Rojo, M Cuatrecasas, L López-Vicente, H Kondoh, C Blanco, A Carnero, S Ramón y Cajal (2006) New p53 related genes in human tumors: significant downregulation in colon and lung carcinomas. Oncology Reports 16(3):

8 J Castellvi, A Garcia, F Rojo, C Ruiz-Marcellan, A Gil, J Baselga and S Ramon y Cajal (2006) Identification of phospho 4EBP1 as a hallmark of cell signaling pathway that associates with survival in ovarian cancer. Cancer 107(8): S Ramón y Cajal, F Rojo, B Pons, M Cuatrecasas, J Castellví, C Iglesias, G Armengol (2007) Targeting protein translation in human tumors. P-4EBP1 as a key clinical-molecular factor AACR annual meeting education book. Rojo F, Najera L, Lirola J, Jimenez J, Guzman M, Sabadell MD, Baselga J, Ramon y Cajal S. 4E-binding protein 1,a cell signaling hallmark in breast cancer that correlates with pathologic grade and prognosis. Clin Cancer Res Jan 1;13(1):81-9. Scaltriti M, Rojo F, Ocana A, Anido J, Guzman M, Cortes J, Di Cosimo S, Matias-Guiu X, Ramon y Cajal S, Arribas J, Baselga J. Expression of p95her2, a truncated form of the HER2 receptor, and response to anti-her2 therapies in breast cancer. J Natl Cancer Inst Apr 18;99(8): Abal M, Llaurado M, Doll A, Monge M, Colas E, Gonzalez M, Rigau M, Alazzouzi H, Demajo S, Castellvi J, Garcia A, Ramon y Cajal S, Xercavins J, Vazquez-Levin MH, Alameda F, Gil-Moreno A, Reventos J. Molecular determinants of invasion in endometrial cancer. Clin Transl Oncol May;9(5): Armengol G, Rojo F, Castellví J, Iglesias C, Cuatrecasas M, Pons B, Baselga J, Ramón y Cajal S. 8

9 4E-binding protein 1: a key molecular "funnel factor" in human cancer with clinical implications. Cancer Res Aug 15;67(16): Guijarro MV, Leal JF, Fominaya J, Blanco-Aparicio C, Alonso S, Lleonart M, Castellvi J, Ruiz L, Ramon y Cajal S, Carnero A. MAP17 overexpression is a common characteristic of carcinomas. Carcinogenesis Aug;28(8): Guijarro MV, Leal JF, Blanco-Aparicio C, Alonso S, Fominaya J, Lleonart M, Castellvi J, Ramon y Cajal S, Carnero A. MAP17 enhances the malignant behavior of tumor cells through ROS increase. Carcinogenesis Oct;28(10): Leal JF, Fominaya J, Cascón A, Guijarro MV, Blanco-Aparicio C, Lleonart M, Castro ME, Ramon y Cajal S, Robledo M, Beach DH, Carnero A. Cellular senescence bypass screen identifies new putative tumor suppressor genes. Oncogene (14); Castro ME, Leal JF, Lleonart ME, Ramon Y Cajal S, Carnero A Loss-of-function genetic screening identifies a cluster of ribosomal proteins regulating p53 function. Carcinogenesis (7); Leal J, Ferrer I, Blanco-Aparicio C, Hernández-Losa J, Ramón Y CS, Carnero A, Lleonart M. S-Adenosylhomocysteine hydrolase downregulation contributes to tumorigenesis. Carcinogenesis (11);

10 Laura López-Vicente, Gemma Armengol, Berta Pons, Laura Coch, Elisabet Argelaguet, Matilde Lleonart, Javier Hernández-Losa, Inés de Torres, Santiago Ramon y Cajal. Regulation of replicative and stress-induced senescence by RSK4, which is downregulated in human tumors. Clinical Cancer Research 2009 Jul 15;15(14): Castellvi J, Garcia A, Ruiz-Marcellan C, Hernández-Losa J, Peg V, Salcedo M, Gil-Moreno A, Ramon y Cajal S. Cell signaling in endometrial carcinoma: phosphorylated 4E-binding protein-1 expression in endometrial cancer correlates with aggressive tumors and prognosis. Hum Pathol Oct;40(10): Benavente S, Vergés R, Hermosilla E, Fumanal V, Casanova N, García A, Ramón Y Cajal S, Giralt J. Overexpression of Phosphorylated 4E-BP1 Predicts for Tumor Recurrence and Reduced Survival in Cervical Carcinoma Treated with Postoperative Radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys Apr