INGENIERÍA GENÉTICA 2013

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1 GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS INGENIERÍA GENÉTICA 2013 Inducción génica, interacciones proteínaproteína y proteína-adn en el marco de la respuesta al daño al ADN Docentes: Lic. Daiana Sapochnik (Ay.1ra) Lic. Nicolás Nieto Moreno (Ay.2da) Dr. Juan José Bonfiglio (Ay.1ra) Dr. Manuel J. Muñoz (JTP) Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA 1

2 Índice Introducción 5... El daño al ADN... 6 Modelo de estudio 9... PARTE I Proteínas Producción y purificación de proteínas recombinantes Estudio de interacciones proteína proteína Análisis de interacciones proteína-proteína por Western blot Trabajo Práctico de Ingeniería Genética Purificación de proteínas fusionadas a GST Protocolo de purificación de proteínas.. 23 Protocolo de preparación de geles de poliacrilamida, siembra y corrida 24 electroforética... Protocolo de tinción con Coomassie brillant blue GST Pull-down Protocolo de pull-down bis. Co-inmunoprecipitación 28 Protocolo de co-inmunoprecipitación Western blot Western blot incubación con anticuerpos Western blot- revelado PARTE II Ácidos Nucleicos Purificación de ARN total Cuantificación de ARN Integridad del ARN Detección de un ARNm específico Northernblot Ensayo de protección a la RNasa (RPA, RNaseProtectionAssay) Retro-transcripción + PCR PCR en tiempo real (real time PCR, quantitative PCR o qpcr) Preparación de ARN total de células de mamífero (HCT116), visualización y cuantificación Protocolo de preparación de ARN total Retro-Transcripción Protocolo de retro-transcripción PCR en tiempo real... 48

3 Protocolo de PCR en tiempo real PARTE III Interacción Proteínas-Ácidos Nucleicos Interacciones proteínas-ácidos nucleicos..... EMSA (DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay). DNA pull-down Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina. 7. Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina. Protocolo de inmunoprecipitación de cromatina. 8. Amplificación por PCR. Protocolo de PCR de punto final.. Bibliografía Algunas reglas básicas de higiene y seguridad en laboratorios

4 Introducción El ADN es el único bio-polímero que no es desechable ni reciclable y debe ser, por lo tanto, reparado al ser dañado. Esto representa una necesidad única en la célula ya que todos los otros polímeros celulares, incluyendo el ARN, las proteínas y los polisacáridos, son regularmente reemplazados, o sea degradados y re-sintetizados, gracias a la información contenida en el ADN (actuando de manera indirecta en el caso de los polisacáridos). Por lo tanto, el mantenimiento de la integridad del ADN es vital para el correcto funcionamiento de las células ya que, si el ADN está dañado, tanto el presente de la célula (transcripción del ADN) como el futuro (duplicación del ADN) se comprometen. Es por esto que el daño al material genético está inexorablemente asociado al mal funcionamiento celular. El daño al ADN se da tanto por agentes internos (estrés oxidativo entre otros) como externos, (exposición a la luz solar ultravioleta, etc). Ante el ataque de su material genético, la célula recibe y procesa señales que la conducen, generalmente, al arresto del ciclo celular o a la muerte (ya sea programada o no). Ambas posibilidades impiden que se propaguen mutaciones, lo cual tiene un gran valor adaptativo. La elección de uno u otro camino depende de innumerables factores: i) tipo de daño, ii) cantidad de daño, iii) tipo celular, iv) fase del ciclo celular, v) background genético, etc. Incluso con la incalculable cantidad de dólares que se invierten año a año en comprender cómo son las vías que conducen a la muerte celular inducida por daño al ADN (dada su estrecha relación con el cáncer), hoy en día no está muy claro cómo es posible que una determinada célula elija ante un estímulo el camino apoptótico, mientras que otra ante el mismo estímulo inhiba la progresión del ciclo celular. Lo que sí está claro es que las complejas respuestas celulares dependen, de manera muy resumida, de qué hay y de cómo interacciona eso que hay. Así, el estudio de los patrones de expresión génica (cuándo se expresa un determinado gen, cuánto se expresa, quién/es induce/n la expresión, cuál variante de splicing o poliadenilación es la inducida, etc.) y de las complejas redes de interacción entre proteínas (quién interacciona con quién, cómo, cuándo, dónde y cómo se ve afectada esa interacción por distintas modificaciones post-traduccionales, etc.) son preguntas que, en distintos marcos teóricos, se realizan en prácticamente todos los laboratorios de investigación básica o aplicada del mundo. 5

5 El objetivo general del trabajo práctico es estudiar, en el contexto del daño al ADN, técnicas utilizadas para analizar la inducción génica, la interacción entre proteínas y la interacción ADN-proteína. El daño al ADN La respuesta celular al daño en el ADN involucra numerosas proteínas que incluyen: Proteínas sensoras: Detectan lesiones en el ADN tales como rupturas en la doble hélice, presencia de ADN simple cadena, estructuras aberrantes (ej.: dímeros de timidina), nucleótidos mal apareados, etc. Proteínas transductoras: Una vez reclutadas a los sitios de daño, son activadas por las proteínas sensoras e inician cascadas de señalización que propagan y amplifican la señal de daño. Incluyen quinasas como ATM, ATR, Chk1, Chk2. Proteínas efectoras: Son blanco de fosforilación por las quinasas transductoras y ejecutan el programa de la respuesta al daño, culminando, como se comentó anteriormente, en el arresto celular y la activación de los mecanismos de reparación o bien en la apoptosis de la célula dañada. Figura 1. Esquema del impacto del daño al ADN sobre la activación de p53. En respuesta al daño al ADN (aquí ejemplificado como radiación ionizante (IR) o ultravioleta (UV)), se activan las quinasas ATM/ATR, las cuales activan a Chk1/Chk2. Esto resulta, en última instancia, en la fosforilación y consecuente estabilización de p53. La proteína efectora más conocida, y con seguridad una de las proteínas más intensamente estudiadas hasta la fecha, es el factor de transcripción de respuesta a estrés p53. Este factor regula la transcripción de genes involucrados en distintos procesos como el control del ciclo y la apoptosis, entre otros, y resulta vital en la prevención del desarrollo de neoplasias. En este sentido, p53 se encuentra mutado en al menos el 50% de los tumores desarrollados en zonas de la piel expuestas al sol y ratones knock-out para p53 desarrollan espontánea y tempranamente una gran variedad de tumores. Un factor central en la regulación de p53 es Mdm2 (o su versión humana Hdm2). En condiciones normales, los niveles celulares de p53 son reducidos debido a que es 6

6 constantemente degradado a través del proteasoma 26S tanto en el núcleo como en el citoplasma, por una vía dependiente de ubiquitina. Mdm2 es la principal enzima E3 ligasa de ubiquitina que regula la estabilidad de p53 al unirse a su extremo N-terminal y ubiquitilar varias lisinas en su extremo C-terminal. A través de esta unión, Mdm2 también inhibe la actividad transcripcional de p53, cuyo dominio de transactivación se encuentra en el extremo N-terminal. La importancia de la regulación de p53 por Mdm2 se ve reflejada en el hecho de que ratones knock-out para Mdm2 son letales embrionarios debido a una apoptosis excesiva, siendo este fenotipo rescatado por deleción simultánea de p53. En respuesta a diversos estímulos, p53 sufre numerosas modificaciones post-traduccionales que incluyen fosforilación, acetilación, sumoilación, NEDDilación, metilación y glicosilación. Estas modificaciones afectan prácticamente todos los aspectos de la función de p53: su estabilidad, localización celular, unión al ADN, actividad transcripcional e interacciones proteína-proteína. Durante la respuesta celular al daño, tanto p53 como Mdm2 son fosforilados. Estas modificaciones post-traduccionales interrumpen la interacción entre estos factores y permite, por lo tanto, la estabilización y activación de p53. Por otra parte, p53 induce la expresión de Mdm2 generándose de esta manera un feedback negativo que modula la intensidad y duración de la respuesta. Uno de los principales genes inducidos por p53 es el inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas, p21. La inducción de p21 dependiente de p53 controla la progresión a través del ciclo celular. En este sentido, el checkpoint G1/S es controlado por inhibición de los complejos cdk2/ciclina E y cdk2/ciclina A (Fig. 2) mientras que, aunque de manera menos clara, el checkpoint G2/M es controlado por inhibición del complejo cdk1/ciclina B. De manera similar a lo que ocurre con p53, Mdm2 también promueve la degradación de p21 por el proteasoma, pero a través de un mecanismo independiente de ubiquitina. Figura 2. p53 induce el arresto del ciclo en la fases G1 y S. Una vez activado, p53 induce la expresión de p21, el cual inhibe los complejos cdk2/ciclina E y cdk2/ciclina A. Esto da como resultado un arresto del ciclo celular en G1. Si bien no se esquematiza en la figura, la inducción de p21 también puede arrestar el ciclo en la fase G2 (ver texto). Por último, hnrnp K (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K), inicialmente identificada como un componente de complejos hnrnp, participa en la regulación de la transcripción, el remodelamiento de la cromatina, el splicing, exportación y traducción del ARNm, entre otros procesos. Estas funciones aparentemente reflejan la habilidad de hnrnp K de interaccionar con una gran variedad de moléculas incluyendo ADN, ARN y proteínas. En 7

7 forma similar a p53, hnrnp K es constantemente ubiquitilada por Mdm2 y degradada por la vía del proteasoma. En respuesta al daño al ADN, esta regulación es interrumpida conduciendo, de esta manera, a la estabilización de la proteína hnrnp K. Por último, este factor es reclutado por p53 al promotor de sus genes target, entre ellos p21, y es necesario para la actividad transcripcional e inducción del arresto del ciclo celular por parte de p53. Figura 3. p53, Mdm2, hnrnp K y la respuesta celular al daño al ADN. En condiciones normales, p53 y hnrnp K son constantemente ubiquitilados por Mdm2 y degradados por el proteasoma. En respuesta al daño al ADN, la activación de distintas cascadas de señalización conduce, entre otras cosas, a la fosforilación de p53 y Mdm2. Como resultado, p53 y hnrnp K se disocian de Mdm2, se estabilizan y son reclutados a los promotores de distintos genes como p21. 8

8 Modelo de estudio Células HCT116 (ATCC #CL ): Línea celular derivada de un carcinoma colorectal humano. Presentan un cariotipo casi diploide y relativamente alta estabilidad cromosómica. Tienen deficiencias en el sistema de reparación de mismatches (MMR) lo que se ha correlacionado con un aumento en la capacidad de recombinación homóloga en células somáticas humanas y de roedores. Esta característica ha sido explotada para crear líneas isogénicas (mismo background genético) knock-out para una gran cantidad de genes. Doxorubicina (Adriamicina ): Antibiótico antraciclino utilizado como agente quimioterapéutico para el tratamiento de una gran variedad de tipos de cáncer. La doxorubicina actúa como agente intercalante en el ADN bloqueando su síntesis y transcripción. Además, inhibe a la topoisomerasa II que relaja el superenrollamiento del ADN. La doxorubicina estabiliza a la topoisomerasa II luego de realizado el corte de la cadena de ADN. De esta manera impide que la enzima vuelva a unir la cadena de ADN y bloquea la replicación. Debido a su mecanismo de acción, la doxorubicina induce generalmente un arresto en G2 ya que, para actuar, requiere que las células hayan transitado por la fase S (replicación del ADN). 1 Sitio web de la American Type Culture Collection: 9

9 PARTE I Proteínas 10

10 Producción y purificación de proteínas recombinantes Existen distintas posibilidades en cuanto al sistema a utilizar a la hora de producir proteínas recombinantes, y la elección del sistema es clave para las posteriores aplicaciones en las que se hará uso de la proteína. Por ejemplo, la utilización de la bacteria Escherichia coli se caracteriza por altísimos rendimientos de producción (fácil transformación, alta tasa de duplicación), sin embargo las proteínas producidas en bacterias no poseerán modificaciones post-traduccionales. Esto debe ser tenido en cuenta, dado que la gran mayoría de las proteínas de mamíferos sufren al menos una modificación post-traduccional. Estas modificaciones post-traduccionales pueden consistir en la adición de i) un grupo pequeño como fosfato, metilo, acetilo, ii) moléculas más grandes como lípidos o hidratos de carbono ó iii) péptidos (ubiquitina, SUMO, NEDD, atg15, etc.). En la siguiente tabla se resumen las características de los sistemas de células más utilizados para producir proteínas, junto con sus respectivas ventajas y desventajas. 11 Características E. coli Levaduras Crecimiento Rápido (30 min) Rápido (90 min) Complejidad del medio de crecimiento Costo del medio de crecimiento Células de insecto Lento (18-24 hs) Células de mamífero Lento (24 hs) Mínima Mínima Alta Alta Bajo Bajo Alto Alto Nivel de expresión Alto Bajo - Alto Bajo - Alto Bajo - Moderado Plegamiento Puede requerir re-plegado Puede requerir re-plegado N-glicosilación No Alta manosa Correcto Simple (NO ácido siálico) Correcto Compleja O-glicosilación No Sí Sí Sí Fosforilación No Sí Sí Sí Acetilación No Sí Sí Sí Acilación No Sí Sí Sí Rendimiento (mg/litro de cultivo) Tasa de éxito (%) (soluble o funcional) , Costo total Bajo Bajo Medio Alto Uso recomendado Ventaja Antígenos, proteína standard, proteínas funcionales. Simple, robusto, menor costo, mejor rendimiento. Proteínas con glicosilación, vacunas, proteínas secretadas, entre otros. Simple, bajo costo, bueno para ciertas proteínas. Alternativa al sistema de levaduras. Relativamente alto rendimiento, útil para MPT. Estudios funcionales, estudios de modif. posttraduccionales (MPT), entre otros. Configuración natural de la proteína, el mejor sistema para MPT.

11 Desventaja No útil para MPT. Mayor tiempo, pocas MPT. Mayor tiempo, alto costo. El mayor costo, bajo rendimiento. En el TP nos centraremos en el sistema bacteriano, pero se puede encontrar una muy completa descripción de todos los métodos en Dentro del sistema bacteriano, se debe empezar eligiendo la cepa a utilizar para producir altas cantidades de la proteína de interés. Con el tiempo, las empresas han generado un número muy grande de cepas de E. coli modificadas para incrementar el rendimiento. Una cepa muy utilizada es la denominada BL21(DE3). Esta cepa contiene el lisógeno DE3 del fago, lo que permite la inducción de la T7 ARN polimerasa en respuesta a IPTG (Studier y Moffatt, 1986). Una vez inducida, la T7 ARN polimerasa transcribe nuestro vector de interés (clonado río abajo de un promotor reconocido por esta polimerasa) y los ribosomas bacterianos se encargan de traducir la proteína de interés. Hoy en día existen cepas como la BL21(DE3)-pLys, la cual cuenta con un vector que codifica para un inhibidor de la T7 ARN polimerasa (Moffatt y Studier, 1987) con la finalidad de disminuir la cantidad de proteína de interés en condiciones de no-inducción, lo cual es particularmente útil para la producción de proteínas que resultan tóxicas para la bacteria (Zhang y Studier, 1997). Adicionalmente, esta cepa es deficiente en los genes de las proteasas lon y omp-t. Otra cepa muy utilizada en la actualidad es la denominada Rosetta. La misma es derivada de la cepa BL21(DE3) pero contiene un plásmido extra que aporta seis ARNs de transferencia que están sub-representados en E. coli y son comunes en proteínas de mamíferos - aquellos que reconocen los codones AUA, AGG, AGA, CUA, CCC y GGA (ver tablas de uso de codones en E. coli y humanos, Fig. 4). Figura 4. Comparación del uso de codones entre humanos y bacterias. Se muestran las proporciones de utilización de cada codón por aminoácido. Los valores de la tabla izquierda corresponden a E. coli y los de la 12

12 derecha a Homo sapiens. Una vez que se ha elegido la cepa en la cual se expresará la proteína de interés, hay que transformar las bacterias con el vector de expresión apropiado. En caso de no contar con el plásmido, hay que generarlo de manera que nuestra proteína de interés quede en marco de lectura generalmente con un tag que permita la posterior purificación cromatográfica. En nuestro caso, dicho tag es un fragmento de la enzima glutatión S transferasa, GST, que es capaz de unirse a su sustrato, una molécula pequeña llamada glutatión (Smith y Johnson, 1988). Los métodos de transformación de cualquiera de las cepas de expresión mencionadas son los estándar (ejemplo, aquel famoso protocolo usado en IBMC). Una vez obtenidos los clones recombinantes de interés, se induce la expresión de la proteína de fusión mediante la expresión de la T7 ARN polimerasa. El gen que codifica para la T7 ARN polimerasa se puede encontrar incorporado en el genoma de la bacteria o en un plásmido, junto con el operador y el gen LacI que codifica para la proteína represora del operón lactosa (Fig. 5). Figura 5. Sistema de expresión bacteriano basado en el operón lac y la ARN polimerasa del fago T7. Se muestra esquemáticamente una bacteria cuyo genoma ya posee el gen de la ARN polimerasa T7 bajo control de los elementos regulatorios del operón lac. De este modo, mediante la adición de lactosa o su derivado sintético, el IPTG, se induce la expresión de la T7 ARN polimerasa. El gen de interés será transcripto por esta ARN polimerasa lo que llevará a grandes cantidades de nuestra proteína de interés (Fig. 6). Luego, se procede con la lisis de las bacterias y la purificación de la proteína mediante la utilización de una matriz de glutatión-sefarosa. Otra alternativa a la expresión en sistemas vivos es la traducción in vitro. Existen numerosos kits comerciales que consisten en lisados de reticulocitos de conejo, germen de trigo y E. coli. Todos ellos son preparados como extractos crudos conteniendo todos los componentes macromoleculares requeridos para la traducción de ARNs exógenos: ribosomas (70S u 80S), ARNt, aminoacil-arnt sintetasas, factores de iniciación/elongación y terminación, etc., y carecen de ARNs endógenos. Para asegurar una traducción eficiente, los extractos deben ser suplementados con aminoácidos, fuentes de energía (ATP y GTP), sistemas regeneradores de ATP y otros co-factores (Mg 2+, K +, etc.). Como material genético de partida se puede utilizar tanto ARN como ADN (dependiendo del kit, obviamente). Los sistemas originales usan ARN como templado pero los sistemas acoplados más modernos utilizan ADN, el cual es transcripto a ARN por una polimerasa recombinante. 13

13 Figura 6. Inducción de la expresión Luego de transformar las bacterias con el vector de interés, se agrega IPTG (fuerte inductor del operón lac) lo que conduce a la producción de grandes cantidades de ARN polimerasa T7, la cual transcribirá grandes cantidades del gen de interés (X). La maquinaria traduccional de la bacteria se encarga de producir la proteína recombinante. pgex-4t-3 es un vector de expresión bacteriano comercial (GE Healthcare). Sea un sistema de traducción o de transcripción/traducción, se debe tener especial cuidado con las distintas secuencias necesarias para llevar a cabo dichos procesos de acuerdo al organismo del que proviene el lisado. En el caso de lisados de E. coli, se debe incluir el ribosome bindings ite (Shine y Dalgarno, 1975), mientras que en lisados eucariotas debe existir una secuencia Kozak (Kozak, 1986) (Fig. 7). Figura 7. Secuencias consenso para el inicio de la traducción. En los ARNs procariotas existe un sitio de unión al ribosoma (RBS, del inglés ribosome binding site) seguido de una secuencia espaciadora y luego el AUG iniciador. En eucariotas, la subunidad menor del ribosoma reconoce el 5 cap y escanea el ARNm hasta llegar a un AUG, donde se ensamblará el ribosoma. Para cuantificar y verificar la integridad de las proteínas producidas, se utilizan tinciones de proteínas totales. Dentro de los métodos más utilizados se destacan dos variantes del colorante Coomassie brillant blue (R-250 y G-250) y la tinción con nitrato de plata. A continuación se detallan los límites de detección de los distintos métodos de tinción. Método Coomassie R-250 Coomassie G-250 Plata Límite de detección 100 ng 10ng 1 ng Luego de una corrida electroforética en un gel desnaturalizante, el gel es sometido a una fijación, luego a una tinción y finalmente a un desteñido. De esta manera, las proteínas son reveladas de distintos colores según el método. Corriendo las muestras de proteínas purificadas junto con cantidades conocidas de alguna proteína (en general, BSA) se puede estimar la concentración de nuestra proteína de interés. 14

14 En Ingeniería Genética 2013 Los alumnos recibirán un lisado bacteriano en un buffer específico y llevarán a cabo la purificación de distintas proteínas fusionadas al tag GST. Una vez obtenidas las proteínas recombinantes, se procederá al análisis de calidad y cantidad de las mismas por medio de SDS-PAGE seguido de tinción con el colorante Coomassie R-250. En la Figura 8 se esquematiza una preparación de proteínas recombinantes corrida en un gel desnaturalizante. La preparación de recombinantes, del gel y su posterior tinción se llevó a cabo exactamente como se detalla posteriormente en la guía. Figura 8. Preparación de las proteínas recombinantes del TP. Se sembraron cantidades crecientes de GST (calles 1 y 2), de GST-hnRNP K (calles 3 y 4) y de GST-MDM2 (calles 5 y 6). Las calles 7, 8 y 9 fueron sembradas con cantidades crecientes de BSA y en la calle 10 se muestra el marcador de peso molecular (Precision Plus de Biorad). 15

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16 Estudio de interacciones proteína-proteína Imaginemos una célula en la cual, de repente, las interacciones específicas entre proteínas desaparecieran. Esta célula desafortunada se convertiría en sorda, ciega, paralítica y finalmente moriría, porque las interacciones (o redes de interacción) proteína-proteína están involucradas en (casi) todos los procesos fisiológicos. Existen varios métodos para el estudio de interacciones proteína-proteína (Berggard et al., 2007, Phizicky y Fields, 1995, Salwinski y Eisenberg, 2003). Dentro de los métodos más clásicamente usados se destacan el ensayo de doble híbrido, la filtración en gel, el GST pulldown y la co-inmunoprecipitación. En los últimos años se ha extendido también el uso del FRET (Transferencia de energía de resonancia de Förster) como una herramienta muy sensible para determinar interacción proteína-proteína. El ensayo de doble híbrido se basa, en su protocolo estándar, en la transformación de levaduras con tres construcciones distintas: 1) Un plásmido codificando el dominio de unión al ADN del factor de transcripción de levaduras GAL4 (GAL4 BD) fusionado a una proteína X (bait), 2) otro plásmido que codifica al dominio de transactivación del factor GAL4 (GAL4 AD) fusionado a una proteína Y (prey), 3) un plásmido reportero conteniendo sitios de unión para el factor GAL4 río arriba del gen de la -galactosidasa. Como puede observarse en la figura de la izquierda, si X e Y interaccionan, se activa la transcripción del gen reportero por restablecerse la función del factor de transcripción GAL4. La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de cromatografía sólidolíquido que permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño. Las moléculas de pequeño tamaño difunden a través de los poros 17

17 de las partículas del gel y por ello son retardadas en su paso por la columna. Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello eluyen rápidamente en lo que se denomina volumen vacío de la columna (son excluidos del gel). De esta forma, las moléculas se separan en función de su tamaño, eluyendo en orden decreciente de peso molecular. Para explicar la utilidad de esta técnica para el estudio de las interacciones proteína-proteína, elegimos a X, nuestra proteína favorita ( en la figura). X tendrá un determinado perfil de elución al correr en una columna de filtración en gel (fracciones 8, 9 y 10 en la figura). Al incubar a X con su interactuante, Y ( en la figura), ambas proteínas forman un complejo de mayor peso molecular que las proteínas por separado. De este modo, al analizar el perfil de elución de X en presencia de Y, el mismo cambia ahora, obteniendo X en las fracciones 4, 5 y 6. El método de co-inmunoprecipitación se basa en el mismo principio que una inmunoprecipitación, pero lo que se busca al inmunoprecipitar una proteína X es recuperar, no sólo a X, sino a proteínas con las cuales interacciona. Esto demanda mayores cuidados a lo largo del protocolo con el fin de preservar las interacciones proteicas. Si bien este método tiende a acercarse más a lo que podría ser una interacción in vivo, hay que tener bien en claro que la interacción está ocurriendo en un tubo de ensayos y que, en ese tubo, pueden también ocurrir interacciones que no ocurren in vivo. Otra técnica muy utilizada para evaluar interacciones proteicas es el ensayo de GST pulldown. El principio básico de esta técnica es muy similar al de la co-inmunoprecipitación. La diferencia radica en la modalidad de la purificación de los complejos proteicos. Mientras que en el caso de la co-inmunoprecipitación los complejos conteniendo a la proteína X se recuperan con un anticuerpo específico anti-x, en este caso se utiliza una proteína de fusión glutatión-s-transferasa (GST)-X. Esta proteína recombinante debe ser producida y purificada previo al ensayo. Una vez que uno quiere purificar los complejos se hace uso de una 18

18 matriz de glutatión-sefarosa (la sefarosa es marca registrada de GE Healthcare, es un derivado de agarosa en forma de bolitas o beads). El glutatión es sustrato natural de la enzima GST y su interacción es muy fuerte. De este modo, al agregar la proteína de fusión GST-X, las proteínas capaces de interaccionar con X son purificadas a partir de un lisado celular. En primer lugar se preparan los extractos proteicos de una línea celular. Una vez que los lisados están cuantificados, una porción de éstos se incuba con la proteína de fusión GST-X. Luego de una incubación para permitir que se produzcan las interacciones, se agrega la matriz de glutatión-sefarosa. La matriz precipitada lleva consigo la proteína GST-X y, dependiendo de las condiciones del ensayo, a proteínas que interaccionan con ella. Luego de unos lavados para eliminar las proteínas celulares que no interaccionaron con GST-X, las muestras ya pueden ser analizadas por SDS-PAGE. En Ingeniería Genética 2013 Los alumnos realizarán ensayos de GST pull-down (con proteínas recombinantes previamente preparadas y cuantificadas) y de co-inmunoprecipitación. 19

19 Análisis de interacciones proteína-proteína por Western blot El análisis de la mayor parte de los experimentos para medir interacciones proteicas consiste en el uso de técnicas que nos permitan revelar la presencia de una proteína Y, la cual interacciona con nuestra proteína de interés. De conocer a Y, esto se puede lograr por medio de la técnica de Western blot, si se cuenta con un anticuerpo específico anti-y. En el caso de que uno esté interesado en identificar nuevas proteínas capaces de interaccionar con nuestra proteína de interés, el método de revelado de elección será una tinción de proteínas totales. Por lo general, se utilizan las tinciones de proteínas totales de Coomassie brillant blue o la de nitrato de plata. En el caso del Coomassie, existen dos variantes del mismo colorante, el R-250 y el G-250. En el caso de la tinción con nitrato de plata también existen variantes pero asociadas a la modificación del protocolo para hacerlo compatible con la posterior identificación de bandas de proteínas por espectrometría de masa. A diferencia de las tinciones de proteínas, las cuales suelen aplicarse directamente sobre el gel, el protocolo de Western implica la transferencia (o blotting) de las proteínas desde el gel a una matriz denominada membrana. Esta membrana puede ser de distintos materiales, siendo la nitrocelulosa y el polivinilidenofluoruro (PVDF) las más utilizadas. Una vez terminada la corrida electroforética, las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana mediante una corriente eléctrica. Como se observa en la Figura 9, se arma un sandwich en el cual el gel y la membrana quedan en íntimo contacto para que, al aplicar una diferencia de potencial, las proteínas migren desde el gel a la membrana (Recuerden que las proteínas siguen cargadas negativamente por el SDS). Figura 9. Armado de la transferencia. Se esquematiza el orden de ensamblado de los distintos componentes necesarios para transferir las proteínas de un gel a una membrana y la dirección de la corriente eléctrica. Una vez que las proteínas se encuentran en la membrana (específicamente en su superficie), la misma es sometida secuencialmente a distintas incubaciones: bloqueo, anticuerpo primario y anticuerpo secundario. Este último suele estar acoplado a alguna enzima de manera de permitir el revelado de las bandas específicas por medio de una 20

20 reacción enzimática. Las enzimas más utilizadas son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa. El acoplado de anticuerpos secundarios a fluoróforos también es una herramienta para el revelado de Western blot. En este caso, la señal se analiza mediante herramientas de detección de fluorescencia en distintas longitudes de onda (acorde al fluoróforo al que se encuentre acoplado). Bloqueo. Dado que la membrana une proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza peptídica) empleado en la detección podría unirse a ellos, dificultando la identificación del complejo antígeno-anticuerpo. En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino o leche en polvo, junto con una pequeña cantidad de detergente, como Tween-20 o Tritón X-100 (típicamente entre 0,05 y 0,2%). Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ya ocupados por las proteínas transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo. Incubación con anticuerpos. Típicamente en un Western blot se utilizan secuencialmente dos anticuerpos: el primario que reconoce específicamente la proteína que se quiere detectar; y el secundario que reconoce al anticuerpo primario y nos da la posibilidad de revelar la presencia del complejo proteína de interés-anticuerpo primario. Las incubaciones de la membrana con las soluciones de anticuerpo son un punto clave para un resultado exitoso a la hora de realizar un Western blot. Las mismas se hacen en una solución buffer que consiste en Tris-HCl y NaCl (TBS, por Tris-buffered saline) o fosfato y NaCl (PBS, por phosphate-buffered saline). La dilución del anticuerpo, el tiempo y la temperatura de la incubación, junto con la cantidad y duración de los lavados entre incubaciones, son parámetros que dependen de cada complejo antígeno-anticuerpo. Es una práctica común de las empresas que comercializan los anticuerpos, adjuntar una hoja indicando el protocolo optimizado para el anticuerpo comprado. Revelado. Una vez realizadas las incubaciones, existen complejos ternarios antígenoanticuerpo 1 rio -anticuerpo 2 rio. En el sistema de revelado más utilizado, el anticuerpo 2 rio está asociado covalentemente a la enzima peroxidasa la cual, en presencia de peróxido de hidrógeno, cataliza la oxidación del sustrato Luminol generando así emisión de luz. De esta manera, la luz generada será captada por una placa radiográfica revelando la presencia del antígeno. Las principales desventajas de este sistema son las variaciones de la actividad enzimática en función del tiempo así como el rango lineal de detección de la placa radiográfica, el cual no sólo no es muy sensible sino que es fácilmente saturable. Así, no es sencillo obtener conclusiones cuantitativas y, por lo tanto, se deberían tomar recaudos como por ejemplo curvas de dilución internas para conocer el rango lineal de detección del sistema. Si bien la aparición de equipos electrónicos que permiten la detección de quimioluminiscencia 21

21 presenta una mejora en cuanto a la sensibilidad en comparación a las placas radiográficas, no deben dejar de tenerse en cuenta las desventajas que implican el revelado con un método enzimático (cinética, concentraciones de sustrato y producto, etc). Recientemente se ha desarrollado un nuevo sistema de detección que mejora algunas de las desventajas de los sistemas basados en reacciones enzimáticas: El equipo Odyssey Infrared Imaging System es un escáner capaz de producir imágenes a partir de excitación y emisión de moléculas fluorescentes (no enzimaticas) en el rango infrarrojo cercano (IR). El equipo está constituido por un sistema de dos canales de detección independientes: un canal de 700 nm y otro de 800 nm de longitud de onda. Esta caracteristica permite la detecccion simultánea de dos blancos en la misma membrana o en las mismas células utiizando dos anticuerpos (uno acoplado a un fluoroforo que emite a 680nm y otro a 800nm). Aplicaciones: Deteccion por anticuerpos 2 rios infrarojos (IRDye) de proteinas, ADN, ARN, etc. Las aplicaciones mas comunes son i) deteccion de proteinas totales en gel, tipo coomassie, gracias al IRDye blue protein stain, ii) Westerns, iii) deteccion de ácidos nucleicos totales, tipo bromuro de etidio, gracias a los colorantes SYTO (Invitrogen) o bien de secuencias particulares (tipo Southern o Northern) gracias al uso de una sonda biotinilada y un IRDye- Streptavidinay iv) visualización de sección de tejidos o de pequeños animales (como ratas o ratones). Ventajas por sobre la deteccion por quimioluminisencia: Mayor sensibilidad: Las membranas y los plásticos pueden producir una alta señal de ruido en el espectro visible debido a la autofluorescencia y a la dispersión de luz de los materiales. Esto limita la sensibilidad de la fluorescencia visible y complica la detección de proteínas poco abundantes. Mayor relación señal:ruido en comparación a la quimioluminisencia. No se requieren sustratos, soluciones reveladoras ó películas fotográficas. La señal de los anticuerpos 2 rios infrarojos (IRDye) es muy estable por lo que, si la membrana se almacena correctamente, puede ser visulaizada tiempo después. De manera similar, el tiempo no influye en la intensidad de la señal a diferencia de la quimioliminiscencia, donde es una variable a tener en cuenta dado que la intensidad de la señal no es constante Links: Western blot: Odyssey: 22

22 En Ingeniería Genética 2013 Los alumnos realizarán corridas de SDS-PAGE con las muestras del ensayo de GST pull-down o de co-inmunoprecipitación. Posteriormente las proteínas serán transferidas a una membrana de nitrocelulosa para luego revelar la presencia de distintas proteínas, según se detalla en los protocolos (ver más adelante). 23

23 Trabajo Práctico de Ingeniería Genética 1. Purificación de proteínas fusionadas a GST En esta sección se describe el protocolo de purificación de las proteínas GST, GST-hnRNP K y GST-MDM2, las cuales serán utilizadas en el ensayo de GST pull-down. En síntesis, el protocolo consiste en los siguientes pasos: i) inducción del cultivo bacteriano, ii) lisis de las bacterias, iii) incubación del lisado con la resina de glutatión-sefarosa, iv) lavado de la resina. En este TP, los alumnos utilizan bacterias (cepa BL21(DE3)-pLys) previamente transformadas con plásmidos que codifican para las proteínas GST, GST-hnRNP K o GST- MDM2. Previamente al TP, los docentes indujeron los cultivos de bacterias con IPTG, luego cosecharon las bacterias, congelaron los pellets en un freezer a -80ºC, resuspendieron el pellet bacteriano en 10 ml de Buffer de Lisis, sonicaron, centrifugaron para deshacerse de todos los restos bacterianos (pared celular, membrana plasmática, ácidos nucleicos, etc) y se quedaron con el sobrenadante que contiene, en gran proporción, proteínas solubles. Los alumnos reciben este sobrenadante (lisado soluble) y continúan el protocolo a partir de ese punto. Protocolo de purificación de proteínas (todos los grupos) 1. Tomar alícuota de 30 µl para INPUT y agregarle 30µl de cracking buffer de SDS-PAGE. 2. Agregar al tubo falcon de 15ml con el lisado soluble (sobrenadante) 100 µl de la resina de Glutatión-sefarosa (50% en PBS). (!) EN TODOS LOS PASOS QUE IMPLICAN MANIPULACIÓN DE LA RESINA DE GLUTATIÓN-SEFAROSA, UTILIZAR TIPS CON LA PUNTA CORTADA PARA NO DAÑAR LA RESINA. 3. Incubar por 2 h a temperatura ambiente con rotación. 4. Centrifugar 5 min a 500 g y descartar el sobrenadante con pipeta (de 10mL al principio, y cuando el volumen sea menor, con p1000), SIEMPRE TENIENDO ESPECIAL CUIDADO DE NO LLEVARSE RESINA (es preferible que quede un pequeño volumen de líquido a llevarse resina). 5. Resuspender la resina en 10 ml de PBS (con pipeta de 10 ml), mezclar suavemente (por inversión) y centrifugar 5 min a 500 g. 24

24 6. Descartar el sobrenadante con bomba de vacío y resuspender la resina en 1 ml de PBS. 7. Pasar a tubo eppendorf de 1,75 ml (tip azul cortado!) y centrifugar 5 min a 500 g. 8. Descartar el sobrenadante con bomba de vacío, agregar 50 µl de PBS y guardar SOLUCIONES Buffer de lisis: PBS 1X ph 7,5, -mercaptoetanol 1 mm, EDTA 1 mm, PMSF 1 mm, Cocktail de inhibidor de proteasas 1X (Complete, Roche). PBS 10X: 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4 y 2,4 g de KH 2 PO 4 Ajustar ph a 7,4 y llevar a 1 litro con H 2 O deionizada. Protocolo de preparación de geles de poliacrilamida, siembra y corrida electroforética 1. Se prepararán, cada dos grupos, 2 geles de acrilamida desnaturalizantes (8% y 15%) de acuerdo con los números que se muestran a continuación. 2. Homogeneizar la resina (con tip cortado!) y pasar 20 l de cada una a un tubo nuevo. 3. Centrifugar 5 min a 500 g y descartar el sobrenadante. 4. Agregarle 40l de cracking buffer de SDS-PAGE a los 10 l de resina compactada. 5. Calentar a 95 C por 5 min, mezclar suavemente y centrifugar 5 min a 500 g. 25

25 6. Resolver las muestras en SDS-PAGE que corresponda: a. En el gel 8% (15 calles) sembraremos (uno por cada dos grupos): 40µl de Input de GST-hnRNP K, 2µl y 6µl de GST-hnRNP K 40µl de Input de GST-MDM2, 6µl y 12µl de GST-MDM2 OJO: 1 de los grupos NO sembrará su Input de GST-hnRNP K, pues no alcanzan las calles del gel b. En el gel 15% (10 calles) sembraremos (uno por cada dos grupos): 40µl de Input de GST, 2µl y 6µl de GST 7. En cada gel se sembrarán 2,5, 5 y 25l de BSA (100 ng/l) como estándar de masa y marcadores de peso molecular 3µl ó 5µl para los geles 8% y 15% respectivamente - (Precision Plus Protein All Blue Standards ( kda), BIO-RAD. Fig. 11). 8. Correr las muestras a 200 V por 1 h. (!) CADA GRUPO TENGA BIEN IDENTIFICADO CUÁL ES SU GEL Y EN QUÉ ORDEN SEMBRÓ SUS MUESTRAS 9. Proceder con la tinción con Coomassie brillant blue (ver protocolo a continuación). Figura 11. Patrón de corrida de los marcadores de peso molecular. SOLUCIONES 26

26 Cracking Buffer de SDS-PAGE: Tris-HCl 62,5 mm ph 6,8;-mercaptoetanol 5%, SDS 2%, Glicerol 20%, azul de bromofenol 0,01% Protocolo de tinción con Coomassie brillant blue 1. Una vez finalizada la corrida, separar el gel de los vidrios, cortar cuidadosamente el stacking gel. 2. Sumergir el gel en H 2 O mq por 5 minutos para remover el SDS. 3. Sumergir en solución de Coomassie durante 30 minutos.(!) (!) Tener especial cuidado al manipular METANOL: Producto inflamable. Tóxico por inhalación o ingestión. Conservar alejado de las llamas o fuente de chispas. Evitar el contacto con la piel. En caso de ingestión, beber etanol 40% y acudir a un médico. Usar guantes. 4. Tapar con film el recipiente de tinción. 5. Sumergir el gel en solución de desteñido (lavados) hasta obtener la relación deseada entre intensidad de las bandas e intensidad del color de fondo. SOLUCIONES Solución de Coomassie: Coomassie R-250 0,1% en metanol 50%, ácido acético 10% Solución de desteñido: metanol 50%, ácido acético 10% 27

27 2. GSTPull-down (algunos grupos) Los alumnos recibirán lisados de células HEK293 y llevarán a cabo distintos experimentos de pull-down, de acuerdo con la siguiente tabla: Lisado GST GST-hnRNP K GST-MDM2 WB HEK293 X --- X HEK293/myc-MDM2 X X --- hnrnp K p53 myc (MDM2) p53 En el caso del pull-down con GST-hnRNP K, el lisado que utilizarán proviene de células transfectadas con un plásmido codificando para MDM2 fusionado al tag c-myc, y la interacción de MDM2 con GST-hnRNP K será revelada mediante un Western blot con un anticuerpo anti-c-myc. Protocolo de pull-down 1. Separar 20 µl de lisado como input y agregarle 20 µl de cracking buffer de SDS-PAGE. 2. Incubar 500 µl de lisado con 4 µg de GST y 40 µl de glutatión-sefarosa 50% por 30 min. 3. Centrifugar 5 min a 500 g y pasar el sobrenadante a tubo eppendorf nuevo, teniendo especial cuidado en NO tomar nada de resina de glutatión-sefarosa. EN ESTE PASO ELIMINAMOS PROTEÍNAS QUE RECONOCEN AL GST Y AQUELLAS QUE SE UNEN INESPECÍFICAMENTE A LA MATRIZ 4. Dividir el sobrenadante en dos partes iguales (250 µl a cada eppendorf). 5. Agregar las beads de GST / GST-hnRNP K / GST-MDM2 (2 µg) acopladas a glutatiónsefarosa respectivamente y llevar a un volumen final de 40 µl de glutatión-sefarosa (50%). Concentración l a agregar (para 2 g) l de Glutatión-sefarosa GST GST-hnRNP K GST-MDM2 6. Incubar 1h a temperatura ambiente con agitación. 28

28 7. Centrifugar 5 min a 500 g y remover cuidadosamente el sobrenadante con bomba de vacío. 8. Agregar 1ml de buffer de lisis, mezclar por inversión y centrifugar por 5 min a 500 g. 9. Remover cuidadosamente el sobrenadante con bomba de vacío y repetir el paso 8 una vez de manera de efectuar un lavado más. 10. Remover cuidadosamente el sobrenadante con bomba de vacío, agregar 1ml de PBS. 11. Centrifugar 5 min a 500 g y descartar el sobrenadante con bomba de vacío. 12. Agregar 20 µl de cracking buffer de SDS-PAGE a las beads. 13. Calentar 5 minutos a 95 C, vortexear, spinear y sembrar 15 µl de la muestra y 10 µl del input en un SDS-PAGE 8%. SOLUCIONES Buffer de lisis: PBS 1X ph 7,5, -mercaptoetanol 1 mm, EDTA 1 mm, PMSF 1 mm, Cocktail de inhibidor de proteasas 1X (Complete, Roche) 2bis. Co-inmunoprecipitación (dos grupos) Los alumnos recibirán lisados de células HEK293 y llevarán a cabo el siguiente experimento de co-inmunoprecipitación de acuerdo con la tabla: Lisado IgG no inmune -Myc WB HEK293/myc-MDM2 1µg 1µg hnrnp K Protocolo de co-inmunoprecipitación 1. Separar 20 µl de lisado como input y agregarle 20 µl de cracking buffer de SDS-PAGE. 2. Incubar 500 µl de lisado con 60 µl de Proteína A/G agarose (Santa Cruz Biotechnologies, #sc-2003) por 1 hora. 3. Centrifugar 5 min a 500 g y pasar el sobrenadante a tubo eppendorf nuevo. 4. Dividir el sobrenadante en dos partes iguales (250 µl a cada eppendorf). 29

29 5. Agregar 10 µl de anticuerpos inmunoprecipitantes de IgG no inmune / -Myc (1 µg) e incubar a 4º C durante toda la noche. 6. Agregar 30 µl de Proteína A/G agarose (Santa Cruz Biotechnologies, #sc-2003) a cada tubo. 7. Incubar 1h a 4º C con agitación. 8. Centrifugar 5 min a 500 g y remover cuidadosamente el sobrenadante con bomba de vacío. 9. Agregar 1ml de buffer de lisis, mezclar por inversión y centrifugar por 5 min a 500 g. 10. Remover cuidadosamente el sobrenadante con bomba de vacío y repetir el paso 9 dos veces de manera de efectuar dos lavados más. 11. Remover cuidadosamente el sobrenadante con bomba de vacío, agregar 1ml de PBS. 11. Centrifugar 5 min a 500 g y descartar el sobrenadante con bomba de vacío. 11. Agregar 20 µl de cracking buffer de SDS-PAGE a las beads. 12. Calentar 5 minutos a 95 C, vortexear, spinear. 13. Se prepararán, cada dos grupos, 2 geles de acrilamida desnaturalizantes (10%) de acuerdo con los números que se muestran a continuación: 30

30 14. Sembrar, cada tres grupos, con el siguiente orden: Gel 1 (10% - 15 calles) Grupo X Grupo Y CB In GST GST- K Grupo Z In GST GST- K Mr In GST 20µl 10µl Todo Todo 10µl Todo Todo 3µl 10µl Todo Todo 20µl Gel 2 (10% - 15 calles) Grupo X Grupo Y CB In GST GST- Mdm Grupo Z In GST GST- Mdm Mr In GST GST- K GST- Mdm 20µl 10µl Todo Todo 10µl Todo Todo 3µl 10µl Todo Todo 20µl CB CB 3. Western blot 1. Luego de la corrida sumergir el gel en buffer de transferencia (!). 2. Cortar membrana de nitrocelulosa del tamaño del gel (8,5 x 5,5 cm). 3. Armar un sandwich sumergido en buffer de transferencia en el siguiente orden (de abajo hacia arriba, sobre la parte negra del sandwich). 1 esponja tipo Scotch Brite embebida en buffer de transferencia. 2 hojas de papel filtro Whatman 3MM embebidas en buffer de transferencia. Gel. membrana de nitrocelulosa. 2 hojas de papel filtro Whatman 3MM embebidas en buffer de transferencia. 1 esponja tipo ScotchBrite embebida en buffer de transferencia. IDENTIFICAR CADA LA MEMBRANA!!!! 4. Para evitar la formación de burbujas se hace rodar un tubo de ensayo de vidrio o una pipeta limpia sobre cada capa del sandwich. 31

31 5. Se ensambla en el cartucho de transferencia y se coloca dentro de la cuba de electrotransferencia (Biorad, ver la figura de la próxima página) que luego se llena de buffer de transferencia. Se agrega el recipiente refrigerante, se coloca la tapa y se conecta a una fuente de poder. La transferencia se hace a un voltaje constante de 100 V durante 1 hora. (!) Tener especial cuidado al manipular METANOL: Producto inflamable. Tóxico por inhalación o ingestión. Conservar alejado de las llamas o fuente de chispas. Evitar el contacto con la piel. En caso de ingestión beber etanol 40% y acudir a un médico. Usar guantes. SOLUCIONES Tris-Glicina 10X: Tris base 30,3 g, Glicina 144,0 g. Llevar a 1 litro con agua deionizada Buffer de corrida: Tris-Glicina 1X + SDS 0,1% Buffer de transferencia: Tris-Glicina 1X + metanol 20% Western blot incubación con anticuerpos Dependiendo de las proteínas recombinantes utilizadas para el ensayo de GST pull-down, se realizarán los ensayos de Western blot con distintos anticuerpos, de acuerdo con la siguiente tabla: 32 Interacción GST pull-down Western blot

32 MDM2/hnRNP K GST-MDM2 -hnrnp K MDM2/p53 GST-MDM2 -p53 hnrnp K/p53 GST-hnRNP K -p53 hnrnp K/myc-MDM2 GST-hnRNP K -Myc Para el caso de la co-inmunoprecipitación, se realizarán los ensayos de Western blot de acuerdo con la siguiente tabla: Interacción IP Western blot hnrnp K/myc-MDM2 -Myc -Myc (IP) -hnrnp K (co-ip) 1. Incubar la membrana durante 1 h. con solución de bloqueo a temperatura ambiente. 2. Incubar con el anticuerpo primario durante toda la noche con agitación a 4 C, según detalla la siguiente tabla: Anticuerpo companía Dilución especie -p53 (clon DO-1) Santa Cruz Biotechnology 2 1:2000 en sl. A ratón -myc (clon 9E10) Santa Cruz Biotechnology 3 1:2000 en sl. A ratón -hnrnp K (R332) Cell Signaling Technology 4 1:2000 en TTBS/3% BSA conejo 3. Recuperar los anticuerpos (ya que son muy caros y pueden reutilizarse) y lavar la membrana 3 veces con agitación durante 10 minutos con TTBS a temperatura ambiente. 4. Hacer 3 lavados de 10 minutos cada uno con TTBS a temperatura ambiente y con agitación. 5. Incubar con el anticuerpo secundario anti-igg para la especie correspondiente diluído 1: en solución A durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación 5. Los anticuerpos que se utilizan para revelar en el Odyssey están acoplados a un fluoróforo por lo que es fundamental protegerlos de la luz. PRESTAR ATENCIÓN AL ANTICUERPO SECUNDARIO Goat Anti-Mouse IgG 800nm cat y Donkey Anti-Rabbit IgG 680nm cat (Li-Cor) 33

33 QUE LE CORRESPONDE A CADA MEMBRANA. PROTEGER DE LA LUZ. 6. Lavar 3 veces con TTBS durante 10 minutos. 7. Lavar 1 vez con TBS durante 10 minutos. Western blot - revelado El revelado del Western blot será realizado mediante el sistema Odyssey. Este es un lector de fluorescencia que posee 2 canales, uno para longitudes de onda de 700nm y otro para longitudes de onda de 800nm. Los anticuerpos utilizados para el revelado están acoplados a un fluoróforo que emite a 680nm o a un fluoróforo que emite a 800nm. Para el revelado, colocaremos la membrana en un scanner lector de fluorescencia y analizarán los resultados mediante el software Image Studio. SOLUCIONES TBS 10X: Tris-HCl 0,25 M ph 7.4, NaCl 1,5 M. Mezclar 30,28 g de Tris base con 87,7 g de NaCl Ajustar ph a 7,4 y llevar a 1 litro con H 2 O deionizada TTBS: TBS 1X + Tween 20 0,1% Solución de Bloqueo: Leche en polvo descremada 5% (Svelty 0% grasa) en TBS Solución A: Leche en polvo descremada 5% (Svelty 0% grasa) en TTBS 34

34 PARTE II Ácidos Nucleicos 35

35 El simple hecho de que la mayoría de las células de un organismo contengan el mismo genoma, pero distinto proteoma, hace del estudio de los patrones de expresión génica un tópico vital para comprender el funcionamiento de los organismos vivos. De las distintas preguntas que pueden realizarse sobre la expresión génica, las más generales son si un determinado gen se expresa en una dada condición o como varía su expresión en respuesta a un agente interno o externo. De manera práctica, en general se mide tanto el nivel de ARNm acumulado como de proteínas, y raramente el gen en sí es el objeto de medición al tratar de responder cuáles son sus niveles de expresión. Objetivo general: En esta parte del trabajo práctico estudiaremos la inducción del gen p21 en células tratadas con el agente de daño al ADN doxorubicina. Para esto se utilizarán células HCT116 tanto salvajes como mutantes para el factor de transcripción de respuesta a estrés p53, el cual modula la expresión de p21. Purificación de ARN total El enriquecimiento de un determinado componente celular por sobre otros plantea el inconveniente de cómo evitar la co-purificación de especies similares en su naturaleza química. Este mismo problema le fue planteado a usted en los primeros años de la carrera al intentar purificar ADN plasmídico en detrimento del ADN genómico de la bacteria E. coli. Así, unos de los dos principales retos en la purificación de ARN total es evitar la copurificación con ADN mientras que el otro es evitar la degradación del ARN que se desea obtener. Los pasos lógicos en la purificación de ARN total a partir de un cultivo celular son: 1. Homogeneización del cultivo 2. Extracción 3. Precipitación 4. Solubilización 1. La gran mayoría de los métodos desarrollados en los últimos treinta años utilizan un agente caotrópico (capaz de desnaturalizar macromoléculas por interrupción de uniones débiles) para homogeneizar el cultivo celular. En el caso de trabajar con tejidos es necesario, en algunos casos, pre-tratar el tejido con homogeneizadores de vidrio y teflón o similares. Las soluciones desnaturalizantes basadas en sales de guanidinio se utilizan con este propósito y favorecen no sólo la formación del homogenato por ruptura celular y solubilización de sus componentes sino también la inmediata inactivación de las ribonucleasas (RNasas) intracelulares. 36

36 2. La extracción del ARN puede lograrse por distintos métodos como por ejemplo ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio en la cual el ARN migra hacia el fondo del tubo (Glisin et al., 1974). Utilizando este método, muy popular en los 80 s, se obtiene ARN de gran pureza pero sin embargo posee una gran desventaja: la imposibilidad de trabajar simultáneamente con muchas muestras. En 1987 Chomczynski y Sacchi introdujeron un paso de extracción con fenol ácido gracias al cual la gran mayoría del ADN se acumula en la fase orgánica mientras que el ARN lo hace en la fase acuosa (Chomczynski y Sacchi, 1987). La diferente polaridad del ADN y el ARN debido a la presencia de un grupo oxidrilo extra en el C2 de este último genera que a phs levemente ácidos ambos tipos de moléculas particionen diferencialmente, a diferencia de lo que ocurre a phs básicos en los cuales los grupos oxhidrilos del ADN y ARN están cargados negativamente favoreciéndose así su interacción con la fase acuosa. La separación de las fases es favorecida por el agregado de cloroformo el cual, a su vez, permite la disolución de los lípidos y la desnaturalización de las proteínas encontrándose éstas en la interfase y en la fase orgánica. Por último, el agregado de alcohol isoamílico proporciona una interfase discreta gracias a la reducción en la formación de espuma. 3. La precipitación del ARN de la fase acuosa se consigue gracias al agregado de acetato de sodio e isopropanol. Las cargas positivas aportadas por el sodio en combinación con la baja polaridad del isopropanol favorecen la precipitación del ARN. 4. La resuspensión del ARN precipitado se realiza típicamente en agua autoclavada libre de ribonucleasas, buffer TE ph 7 o simplemente EDTA 0,1 mm ya que si bien las ribonucleasas no utilizan cationes divalentes como cofactores, el calentamiento del ARN a 80 C en presencia de cationes divalentes como Mg 2+ o Ca 2+ induce la ruptura del mismo. La resuspensión es favorecida por el congelado/descongelado seguido de vortex. El ARN así obtenido se guarda a -80 C y es estable por meses. La presencia de un grupo oxidrilo en el C2 del ARN hace que esta molécula sea más reactiva que el ADN y, sumado a esto, las ribonucleasas son enzimas estables y abundantes. Así, el trabajo con ARN requiere de algunos cuidados que no son necesarios al trabajar con ADN, proteínas u otras biomoléculas. Las ribonucleasas están presentes tanto dentro de la célula como fuera de ella (especialmente aportadas por microorganismos) y recuperan en una gran proporción la conformación activa incluso luego de autoclavar las soluciones utilizadas. La rápida inactivación de las ribonucleasas intracelulares depende de la velocidad de homogeneización de la muestra. En un cultivo celular este punto es resuelto eficientemente por el rápido agregado de la solución desnaturalizante al cultivo. Si se trabajase con un tejido de difícil ruptura, como por ejemplo corazón, cerebro, timo o bazo, la homogeneización previa debe ser realizada con equipos debidamente esterilizados y tratados con soluciones estabilizadoras de ARN como las comercializadas por Ambion, Invitrogen, etc. Por otra parte, algunas soluciones pueden ser tratadas con el inhibidor de ribonucleasasdietilpirocarbonato (DEPC) pero deben ser luego autoclavadas para destruir el 37

37 compuesto. Un inconveniente es que el tratamiento de soluciones que contengan Tris no es efectivo dado que el DEPC se degrada rápidamente en presencia de este buffer. De manera general, un método de purificación deberá elegirse según las siguientes variables: i) calidad y cantidad requerida del producto final, ii) el tiempo que insume el protocolo y iii) el costo. Así, la opción más cara, rápida y de excelente pureza/cantidad es el kit de Qiagen RNeasy kit. De esta manera, luego de un primer paso de homogeneización se utilizan mini-columnas las cuales unen específicamente ARN el cual es luego eluído gracias al agregado de agua y una breve centrifugación. Una opción más económica, pero no tan rápida, es el uso de TRIzol (Invitrogen) o equivalentes, en el cual se basa el protocolo utilizado en este trabajo práctico. La ventaja de estos compuestos es que casi no requieren agregados extras (como β-mercaptoetanol, AcONa, fenol, etc.) ya que están incluidos en la solución comercializada por el fabricante. Cuantificación de ARN Existen diversos métodos para cuantificar ARN. Dada la naturaleza aromática de las bases nitrogenadas, tanto el ADN como el ARN absorben eficientemente luz ultravioleta, y esta propiedad es utilizada hace años para cuantificar ambos tipos de moléculas. Este método es sencillo pero su utilización depende de la pureza de la muestra, dado que a la misma longitud de onda (260 nm) que absorbe el ARN lo hace también el ADN, el EDTA o el fenol. La relación de absorbancias 260 nm/280 nm se utiliza en general como indicador de contaminación con proteínas (las cuales absorben a 280 nm gracias a los aminoácidos aromáticos) donde una relación de 1,8 a 2 es indicativa de una buena preparación. Relaciones menores a los valores mencionados previamente son asociadas a contaminación con proteínas o fenol. Al momento de medir en el espectrofotómetro es importante que la cubeta de cuarzo esté limpia ya que pequeñas partículas de polvo afectan significativamente la dispersión de la luz y por ende la medición de la absorbancia. La dilución del ARN que se usará para cuantificar debe realizarse en un buffer levemente alcalino (TE: Tris-HCl 10 mm ph 7,5-8, EDTA 0,1 a 1 mm), ya que la baja fuerza iónica y el ph influencian notoriamente la relación absorbancia 260/280. Los valores de absorbancia a 260 nm (OD 260 ) deben estar entre 0,1 y 1, ya que fuera de ese rango los valores de absorbancia no son linealmente proporcionales a la concentración de la muestra. Un valor de OD 260 = 1 es equivalente a 40 µg/ml de ARN en tanto y cuanto la relación OD 260 /OD 280 este entre 1,8 y 2. La contaminación con ADN puede representar un real problema si se quiere cuantificar ARN obtenido de células apoptóticas o transfectadas con plásmidos. Esto se debe a que pequeñas moléculas de ADN contaminan más fácilmente la fase acuosa ya que éstas son más polares que los grandes fragmentos de ADN genómico. En este caso, la muestra de ARN puede ser tratada con desoxiribonucleasas (DNasas) o bien utilizar un método de cuantificación capaz de discriminar entre ADN y ARN. En este sentido, numerosas empresas (Invitrogen, Ambion, etc.) comercializan métodos fluorescentes más sensibles y capaces de discriminar ADN de ARN. 38

38 Desde hace unos años la marca Thermo Scientific comercializa una línea de equipos llamados NanoDrop, desarrollados para cuantificar pequeños volúmenes de distintos tipos de moléculas y muestras. Se trata de un espectrofotómetro con un pequeño pedestal en el que se colocan entre 1 y 2 μl de la muestra a cuantificar. Al bajar el brazo móvil del equipo, se establece una columna de líquido. El equipo arroja un haz de luz a través de la columna de líquido y realiza un barrido por distintas longitudes de onda midiendo la absorbancia de la muestra. Finalmente, arroja un gráfico que corresponde al perfil de absorbancia. El software posee programas pre-configurados para medir ADN, ARN, proteínas y densidad de cultivos celulares, entre otras aplicaciones. Según qué tipo de muestra esté cuantificando, arroja la concentración y otros valores relevantes (como la relación de absorbancia 260 nm/280 nm para ácidos nucleicos). Figura 12. Perfil de absorbancia de una muestra de ARN y datos informados por el NanoDrop. Integridad del ARN El método mayormente utilizado para analizar la integridad del ARN es una simple electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante teñido con bromuro de etidio. El agregado de formaldehído desnaturaliza la estructura secundaria del ARN e inhibe la actividad de las ribonucleasas que pudieran estar presentes en el gel, buffer, cuba, etc. De esta manera, es posible observar principalmente dos bandas correspondientes a los ARN ribosomales humanos 28S (5 kb) y 18S (1,9 kb). Una relación de intensidades 28S:18S de aproximadamente 2:1 indica una preparación de buena calidad y sin degradación (Fig. 12). Alternativamente se puede realizar la misma electroforesis pero en un gel de agarosa nativo evitándose así el uso de campana de extracción. Las desventajas de este método son principalmente dos: por un lado las bandas no estarán tan definidas a causa de la estructura 39