Efecto de la sobre-expresión de DNMT3B sobre genes relacionados a cáncer (SPRY2, IRF1 y CDH2) en células HaCaT
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- María del Rosario Cárdenas Maidana
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1 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, Septiembre er. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 Memorias Efecto de la sobre-expresión de DNMT3B sobre genes relacionados a cáncer (SPRY2, IRF1 y CDH2) en células HaCaT Mildreth Flores Cano (Becaria) mildreth33@hotmail.com Unidad Académica Preparatoria No. 33, Universidad Autónoma de Guerrero. Dr. Daniel Hernández Sotelo (Asesor) danhs1mx@yahoo.com Unidad Académica de Ciencias Químicas Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero. Profesor Investigador Introducción 1. Cáncer El cáncer puede definirse como un grupo de células que crecen y se dividen de una manera incontrolada, invadiendo los tejidos y los órganos sanos adyacentes y finalmente diseminándose por todo el cuerpo. El cáncer se puede producir por la proliferación anormal de cualquiera de los diferentes tipos de células del cuerpo, por lo que hay más de 100 tipos distintos de cáncer. Existen tumores benignos y malignos, por lo que solo a los tumores malignos se les denomina propiamente como cáncer, ya que estos tumores son capaces de invadir el tejido normal y de propagarse por el cuerpo mediante los sistemas circulatorios y linfáticos, mientras los tumores benignos están confinados en su localización original [1]. 2. Metiltransferasas Las DNA metiltransferasas (DNMTs) son un grupo de enzimas encargadas de la transferencia de un grupo metil (CH3) del cofactor s-adenosil metionina a diversos sustratos, particularmente a citosinas en el ADN, histonas y otras proteínas. En general, la metilación anormal de promotores de genes se asocia con la represión transcripcional. Alteraciones en los patrones normales de metilación han sido asociados con diversas patologías como desordenes psiquiátricos y cáncer. Existen dos tipos de DNMTs: metilasas de novo y de mantenimiento [2]. 717
2 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, DNMT3B DNMT3B, metilasa de novo, establece nuevos patrones de metilación durante el desarrollo embrionario. Particularmente en citosinas adyacentes a guaninas hacia el extremo 5', secuencia conocida como CpG. Las islas CpG son regiones del genoma con alta densidad de CpGs y dichas islas son comunes en promotores de genes. En diversos tipos de cáncer humano existen alteraciones en DNMT3B que ocasionan metilación anormal de genes relacionados a cáncer, ocasionando en estos su inactivación transcripcional [3]. 4. SPRY2 SPRY2 es una proteína, evolutivamente conservada, inhibidora de receptores tirosina cinasa que afecta la vía de señalización Ras/MAPK. En varios tipos de cáncer disminuye su expresión con lo que contribuye en la activación anormal de la vía de señalización Ras/MAPK en cáncer humano. En hepatocarcinoma la inactivación de SPRY2 vía hipermetilación de su promotor coopera con β-catenina para promover este tipo de tumor [4]. 5. IRF1 IRF1 es un factor de transcripción nuclear activado por IFN-γ, TNF-α, acido retinoico, IL-1, IL-6 en respuesta a infecciones virales. IRF1 regula la actividad transcripcional de genes involucrados en la inmuno-modulación de la respuesta antiviral y la supresión de tumores. Algunos estudios han mostrado a IRF1 como un inhibidor del crecimiento de células de cáncer de mama y la disminución de su expresión se asocia con resistencia a varios tratamientos antitumorales [5]. 6. CDH2 CDH2, es una proteína que pertenece a la familia de cadherinas. Las cuales son proteínas de adhesión celular, particularmente CDH2 se considera marcador mesenquimal. En la mayoría de los tumores humanos la expresión de CDH2 se incrementa durante la progresión y algunos antecedentes muestran que esta proteína podría tener un papel en la metástasis [6]. 7. Asociación de DNMT3B a genes relacionados con cáncer Varias evidencias indican que DNMT3B es la enzima que en mayor grado contribuye con la metilación anormal en cáncer. De hecho, en varios tipos de cáncer se ha encontrado sobreexpresión de DNMT3B. Son muchos los genes que se han reportado metilados de manera anormal en su promotor en virtualmente todos los tipos de cáncer humano. Y son varios los reportes tanto epidemiológicos como experimentales que indican que DNMT3B causa metilación 718
3 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 anormal en cáncer. Sin embargo, a la fecha, pocos genes han sido identificados como blancos de DNMT3B, por lo que en el presente trabajo analizamos el efecto que tiene la sobre-expresión de DNMT3B en la expresión de los genes SPRY2, IRF1 y CDH2 (genes relacionados a cáncer) en la línea celular HaCaT como un paso previo para identificar nuevos genes blanco de DNMT3B. Objetivo Evaluar el efecto de la sobre-expresión de DNMT3B sobre los genes SPRY2, IRF1 y CDH2 (genes relacionados a cáncer) en la línea celular HaCaT. Metodología Línea celular Las células HaCaT (Epidermal Keratinocyte cell line, human adult low calcium temperature) fueron cultivadas en medio DMEM/F-12 (CAISSON Laboratories) suplementado con 10% de suero fetal bovino y penicilina/estreptomicina U/mL (Gibco-BRL, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) a 37 C y 5% de CO2. Transfección Las células HaCaT se sembraron en placas de cultivo celular de 60 mm. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 80% fueron transfectadas con 3.5 µg del vector de expresión de DNMT3B (phmt3b) mediante el método de lipofectamina (Lipofectamine 2000 Invitrogen). Como control se utilizaron las células HaCaT trasnfectadas con el vector vacío pcdna3.1(+) y la cosecha se realizó a las 48 h postransfección para futuros análisis. Extracción de RNA El RNA se extrajo de las células HaCaT mendiante el kit de extracción Direct-Zol RNA miniprep (Zymo Research), siguiendo las instrucciones de la casa comercial. La integridad del RNA se confirmó por electroforesis en gel de agarosa al 1% y la cuantificación se realizó por espectrofotormetría en el equipo Nanodrop (Nanodrop 2000). RT-qPCR La RT-qPCR se realizó a partir de 100 ng de RNA utilizando el kit KAPA TM SYBR FAST One-Step qrt-pcr (Kapa Biosystems), de acuerdo a las instrucciones de la casa comercial. Cada qpcr se realizó por duplicado. GAPDH fue usado como control interno para la normalización. Las diferencias de expresión se calcularon usando el método 2 -ΔΔCT. 719
4 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Análisis de datos Los datos se expresaron como media ± error estándar. Las diferencias entre los grupos fue analizada usando la prueba t de student en el programma sigma plot. Las diferencias significativas se consideraron cuando p < 0.05 Resultados Sobre-expresión de DNMT3B en la línea celular HaCaT Para identificar posibles genes blanco de DNMT3B, sobre-expresamos esta enzima con el uso del vector de expresión phmt3b en células HaCaT. En la figura 1 mostramos la sobre-expresión de DNMT3B en células HaCaT. Podemos observar que aumentamos 30 veces el nivel de RNAm de DNMT3B en células HaCaT comparadas con las células transfectadas con el vector control pcdna3.1. Figura 1. Sobre-expresión de DNMT3B en células HaCaT. Las células fueron transfectadas con 3.5 µg de phmt3b o pcdna3.1 y 40 horas post-transfección se cosecharon para evaluar el nivel de RNAm de DNMT3B. La barra representa la media de la expresión ± el error estándar de 3 experimentos independientes. * p < 0.05 Efecto de la sobre-expresión de DNMT3B sobre los genes SPRY2, IRF1 y CDH2 en la línea celular HaCaT Posteriormente avaluamos el nivel de RNAm de los genes SPRY2, IRF1 y CDH2 posterior a la sobre-expresión de DNMT3B, lo anterior es mostrado en las figuras 2, 3 y 4. La sobre-expresión de DNMT3B disminuyo significativamente la expresión de SPRY2 y CDH2 y aumento significativamente la expresión de IRF1. 720
5 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 Figura 2. Efecto de la sobre-expresión de DNMT3B en el nivel de RNAm de SPRY2. En análisis de la expresión de SPRY2 se realizó por RT-qPCR. La barra representa la media de la expresión ± el error estándar de 3 experimentos independientes. * p < 0.05 Figura 3. Efecto de la sobre-expresión de DNMT3B en el nivel de RNAm de IRF1. En análisis de la expresión de IRF1 se realizó por RT-qPCR. La barra representa la media de la expresión ± el error estándar de 3 experimentos independientes. * p <
6 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Figura 4. Efecto de la sobre-expresión de DNMT3B en el nivel de RNAm de CDH2. En análisis de la expresión de CDH2 se realizó por RT-qPCR. La barra representa la media de la expresión ± el error estándar de 3 experimentos independientes. * p < 0.05 Conclusiones 1. Se logró sobre-expresar a DNMT3B en células HaCaT. 2. La sobre-expresión de DNMT3B disminuye la expresión de SPRY2 y CDH2 y aumenta la expresión de IRF1 en células HaCaT. 3. Los genes relacionados a cáncer SPRY2, CDH2 y IRF1 podrían ser blancos de DNMT3B Referencias bibliográficas 1. Esteller, M., Epigenetics in cancer. N Engl J Med, (11): p Jones, P.A. and D. Takai, The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science, (5532): p Roll, J.D., et al., DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Mol Cancer, : p Lee, S.A., et al., Synergistic role of Sprouty2 inactivation and c-met up-regulation in mouse and human hepatocarcinogenesis. Hepatology, (2): p Schwartz-Roberts, J.L., et al., Interferon regulatory factor-1 signaling regulates the switch between autophagy and apoptosis to determine breast cancer cell fate. Cancer Res, (6): p Sher, Y.P., et al., ADAM9 up-regulates N-cadherin via mir-218 suppression in lung adenocarcinoma cells. PLoS One, (4): p. e
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