Metilación del ADN asociado a efectos ambientales. Análisis por Real Time-PCR

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Luis Rojas Carrasco
hace 6 años
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1 Curso Posgrado: PEDECIBA/BIOLOGIA Coordinador: Susana González Metilación del ADN asociado a efectos ambientales. Análisis por Real Time-PCR Alicia Postiglioni Junio, 2009

2 OBJETIVOS: Diferenciar la herencia mendeliana de la no-mendeliana. Explicar la epigenética (ADN metilado) Explicar la discriminación di-alélica de los genes improntados. Explicar la conversión del ADN por la metodología del bisulfito. (BSP, MSP) Cuantificar por Real Time/PCR.

3 Expresión de génica: 1) expresión primaria del gen (dominancia y recesividad) (transcripción). Fenotipo= Genotipo + Ambiente

4 Expresión de génica: 2) expresión de algunos alelos del gen por influencia ambiental (pos-transcripción). (modificaciones químicas del ADN) Fenotipo= Genotipo + Ambiente......

5 Epigenética: mecanismos que influyen en la expresión génica sin modificar las secuencias de ADN, transmitiéndose por mitosis o meiosis. Genética (hardware). Lento Epigenética (software). Rápido Un organismo responde al medio ambiente sin cambiar su ADN.

6 EPIGENÉTICA

7 EPIGENETICA Dos alelos; uno silencioso, otro activo, indican cambios epigenéticos de la expresión génica. Alelo 1: condensación de los nucleosomas (deacetilación y metilación). Alelo 2: descondensación nucleosómica (acetilación y desmetilación)

8 Callipyge A G DLK1 y PEG11 vía paterna GTL2; antipeg11; MLG8 vía materna + M /CLPG P = Callipyge + M /+ P ; CLPG M /CLPG P ; CLPG M /+ P = Normal (M=materno; P=paterno)

9 Translocación Robertsoniana rob(1;29) IGF2 (gen improntado) Poll COL6A 1 COL6 A 2 COL8A 1 COL8A 2

10 METILACIÓN DEL ADN INSERCIÓN DE GRUPO METILO (CH3) EN CITOCINAS DE DINUCLEÓTIDOS CpG SUPRIME EXPRESIÓN GÉNICA

11 Sellado gamético Se imprime en la gametogénesis Se mantiene en la fecundación Se pierde de la línea germinativa en las primeras fases del desarrollo embrionario Se vuelve a imprimir durante la maduración de los gametos si la progenie es del mismo sexo. Materno: maduración de ovocitos Paterno: línea germinativa antes de la meiosis.

12 Hemicigosis funcional Uno de los dos alelos se heredan sellados ( no se expresa) La hemicigosis funcional es un sello (impronta) colocado en los óvulos o espermatozoides maduros durante la gametogénesis. Epigenética: siendo heredable no presenta cambios en la secuencia de ADN.

13 Genome imprinting (impronta genética) Gen IGF2 (receptor de crecimiento) en bovinos. La impronta o silenciamiento del gen proviene por vía materna. El gen se expresa por vía paterna. El gen está ubicado en el extremo próximo terminal del cromosoma BTA29. Metodología: RT-PCR, en muestras obtenidas de hígado, pulmón, cerebro, corión, alantoides, determinan que la expresión diferencial proviene del alelo paterno, en todas las muestras. Conceptos El gen se expresa por vía paterna; El gen está improntado por vía materna.

14 MethylCode TM Bisulfite Conversion Kit Conversión de citocinas no metiladas en uracilo, en muestras de ADNgenómico, plásmido, ADN digeridos con endonucleasas. Las citocinas metiladas no cambian. GggcaagtCG NaHSO3 GggtaagtCG - c se convierte en u pero se detecta como t por la PCR. - C metiladas no cambian

15 CITOCINAS NO METILADAS DEAMINACIÓN citocina uracilo

16 CITOCINAS METILADAS

17 Pasos Bisulfito/MSP: 1- Desnaturalizar el ADN 2- Tratarlo con NaHSO3 (kit Epitech bisulfito) 3- Amplificar por PCR el ADN convertido Condiciones de la PCR: Utilizar primers específicos para el alelo metilado y el no metilado. 4- Correr en geles de poliacrilamida no-desnaturalizados (secuenciación: con o sin clonación).

18 Pasos MSP: 1- Desnaturalizar el ADN 2- Tratarlo con NaHSO3 3- Amplificar por PCR el ADN template. Condiciones de la PCR: Utilizar primers específicos para el alelo metilado y el no metilado. 4- Correr en geles de poliacrilamida no-desnaturalizados. Variaciones: Digestión de productos de PCR con enzimas de restricción.

19 Características: El Bisulfito de Sodio convierte los residuos de citocina de una cadena simple de ADN, en residuos de uracilo, no activando a la 5-metilcitocina. El ADN convertido se amplifica con primers específicos (U) (U-T) (citocinas no metiladas) y primers específicos para citocinas metiladas (M) (C- G). Se detecta por secuenciación ( con o sin clonación), MSP, HTM/PCR, microarrays, Pirosecuenciación.

20 Polimorfismos generados por el bisulfito Azul: citocinas no metiladas que se convierten en uracilo por la reacción del bisulfito. Rojo: citocinas resistentes a la 5-metilcitocina

21 Methylation specific PCR (MSP) Primers que hibridizan con secuencias metiladas (contienen 5-metilcitocina y son resistentes a la conversión con bisulfito).

22 HRM Se realiza con ADN de doble cadena dentro de un amplicón. La T aumenta entre 55-95ºC. Llega un momento en que la doble hebra se separa Se utiliza SYBR Green porque se intercala en la doble cadena de ADN Si no hay doble cadena la fluorescencia es débil. Nivel de fluorescencia VS nivel de temperatura Doble cadena Cadena simple

23 Análisis de metilación del ADN HRM monitorea el proceso a altas temperaturas. ADN no metilado ADN metilado Tratamiento con bisulfito convierte las C no metiladas en U. Este ADN no metilado tendrá una baja T, a diferencia de los metilados. HRM determina la proporción de Metilación, al permitir comparar en una curva donde se tienen ambas M y U.

24 CUANTIFICACIÓN

25 CUANTIFICACIÓN

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