Qué es la Información Biológica? Genoma -> Transcriptoma ->Proteoma

Transcripción

1 Proteómica

2 Qué es la Información Biológica? Genoma -> Transcriptoma ->Proteoma

3 Qué es la Información Biológica? Tres niveles básicos de información biológica: Genoma: la información genética común a todas las células del organismo. Transcriptoma: la parte del genoma que se expresa en una celúla en una etapa específica de su desarrollo. Proteoma: las proteínas que interactuan para dar a la célula su carácter individual. Del GENOMA estático, único al PROTEOMA dinámico, múltiple.

4 Desarrollo de la proteómica Factores decisivos que condicionan la aparición de la proteómica: 1. La secuenciación de genomas a gran escala y el desarrollo de bases de datos de proteínas. 2. El desarrollo de técnicas de espectrometría de masas (MS) para analizar proteínas y péptidos. 3. Los avances realizados para la separación de proteínas mediante electroforesis bidimensional (2D-PAGE) con la introducción de los gradientes de ph inmovilizados (IPGs).

5 Desarrollo de la proteómica La proteómica requiere la implicación de diversas disciplinas como: Biología molecular Bioquímica Microbiología Bioinformática La Bioinformática es de gran importancia ya que se necesitan ordenadores de gran capacidad para organizar la gran cantidad de información generada en estas investigaciones.

6 Proteoma

7 El proteoma es el conjunto de proteínas codificadas por un genoma, una célula o un tejido. Sin embargo, se desconoce la función biológica de la mayoría de las proteínas codificadas por los genomas.

8 El siguiente paso en la era post-genómica debe ser el estudio funcional de estos genes. La proteómica puede ayudar a establecer una conexión entre las secuencias biológicas y su comportamiento biológico.

9 La proteómica es el estudio a gran escala de los productos génicos de un genoma, célula o tejido mediante métodos bioquímicos, con el fin de obtener una visión global e integrada de los procesos celulares.

10 El proteoma es dinámico El proteoma de una célula es reflejo del medio ambiente en que es estudiado. Como respuesta a estímulos externos e internos, las proteínas pueden ser modificadas, translocadas, sintetizadas o degradadas.

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12 Proteómica Áreas de estudio

13 Proteómica - Objetivo El principal objetivo de la proteómica no es sólo identificar todas las proteínas en una célula, sino también crear un mapa tridimensional completo de la célula indicando la localización de las proteínas. Obtener el proteoma de una célula es como tomar una fotografía de todas las proteínas en momento determinado. Considerando todas las posibilidades un genoma podría dar lugar a un número infinito de proteomas.

14 Proteómica - Objetivo Las proteínas, no los genes, son los responsables de los fenotipos de las células. Es imposible determinar los mecanismos de enfermedades, envejecimiento y los efectos del ambiente únicamente estudiando el genoma. Sólo mediante el estudio de las proteínas se pueden caracterizar las modificaciones proteicas e identificar dianas de fármacos.

15 Proteómica Tipos de estudios Proteómica de expresión: estudio cuantitativo de la expresión de proteínas entre muestras que difieren en alguna variable. Proteómica estructural o del mapa celular: estudio de la localización subcelular de las proteínas y caracterización de las interacciones proteína-proteína. Proteómica funcional: estudio y caracterización de un grupo de proteínas determinado mediante diversas aproximaciones proteómicas.

16 Proteómica de expresión El análisis del mrna no es un reflejo directo del contenido proteico de una célula. Comparación de la expresión del proteoma total o de subproteomas entre diferentes muestras. La información obtenida puede permitir la identificación de: Nuevas proteínas implicadas en transducción de señales Proteínas específicas de una enfermedad

17 Proteómica estructural Se basa en aislamiento de orgánulos subcelulares o complejos proteícos mediante purificación. Posteriormente se identifica sus componentes mediante espectrometría de masas. La información obtenida puede permitir reconstruir la architectura celular de las células (mapas de interacción) y explicar como la expresión de ciertas proteínas proporciona a una célula sus características únicas.

18 Proteómica funcional En algunos casos, se aislan subproteomas específicos mediante cromatografia de afinidad. Esto puede incluir el aislamiento de complejos proteicos o el uso de ligandos proteicos para aislar tipos específicos de proteínas para su posterior estudio y caracterización. Puede proporcionar información importante sobre: Señalización Mecanismos de la enfermedad Interacciones proteína-fármaco

19 Tecnología proteómica

20 Tecnología proteómica El desarrollo de la proteómica se debe en parte a los avances importantes realizados en la tecnología de proteínas. Sin embargo, la metodología disponible tiene sus limitaciones y actualmente todavía no es posible realizar muchos tipos de proteómica. Es necesario mejorar algunas de estas limitaciones y desarrollar nuevas tecnologías para conseguir el máximo partido.

21 Separación de proteínas

22 Separación de proteínas La tecnología más utilizada para la separación y aislamiento de proteínas es la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Introducida en 1970, es la técnica más eficaz para resolver mezclas complejas de proteínas. Dos tipos de electroforesis en geles de poliacrilamida: Monodimensional (SDS-PAGE) Bidimensional (2D-PAGE)

23 Separación de proteínas SDS-PAGE Para muchas aplicaciones proteómicas, la SDS-PAGE es el método de elección para resolver mezclas de proteínas. Las proteínas se separan de acuerdo a su masa y como las proteínas son solubilizadas en dodecil sulfato sódico (SDS), no suele haber problemas de solubilización. Es una técnica sencilla, reproducible y permite la separación de proteínas de kda.

24 Separación de proteínas SDS-PAGE Una de las aplicaciones más comunes de la SDS- PAGE es la caracterización de proteínas después de algún tipo de purificación previa.

25 Separación de proteínas 2D-PAGE Constituye actualmente el método más eficiente para la separación de mezclas muy complejas de proteínas: permite separar miles de proteínas en un único experimento. Está basada en una separación de las proteínas en función de la carga neta, seguida de una separación de las proteínas en función de su masa molecular. La alta resolución de la técnica se debe a que las dos separaciones se basan en parámetros diferentes.

26 Separación de proteínas 2D-PAGE La separación de la primera dimensión se realiza mediante isoelectroenfoque. En el isoelectroenfoque las proteínas son separadas en un gradiente de ph hasta alcanzar una posición en la que su carga es 0 (punto isoeléctrico). En la segunda dimensión, las proteínas son separadas mediante SDS-PAGE. Permite separar las proteínas de una célula.

27 Campo eléctrico ph 8

28 Campo eléctrico - MW +

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30 Separación de proteínas 2D-PAGE

31 Separación de proteínas 2D-PAGE La innovación clave ha sido el desarrollo de geles con un gradiente de ph inmovilizado (IPG, immobilized ph gradient). En los geles IPG, el gradiente de ph es generado por las inmovilinas, y está co-polimerizado con la matriz de acrilamida. Eliminación de los problemas de inestabilidad del gradiente de ph y la baja capacidad de carga asociada a los gradientes de ph preparados con anfolitos carrier.

32 Separación de proteínas 2D-PAGE Los geles IPG permiten: Mejorar la resolución Mejorar la capacidad Aumentar la cantidad de proteínas cargadas La reproducibilidad conseguida con los geles IPG permite la comparación de mapas proteicos entre distintos laboratorios. Facilita el intercambio de información.

33 Separación de proteínas Detección Técnicas tradicionales de detección de proteínas: Marcaje radioactivo Tinción con Azul de Coomassie Tinción con plata (mayor sensibilidad) Nuevas técnicas: Tinción de plata superficial Tinciones y marcajes fluorescentes (Sypro-Ruby, Cy3, Cy5...) Las nuevas técnicas permiten el análisis posterior de las muestras mediante espectrometría de masas.

34 Separación de proteínas Aplicaciones 2D-PAGE La aplicación principal es la proteómica de expresión. La expresión de proteínas de dos muestras se puede comparar de forma cualitativa y cuantitativa. La aparición o desaparición de manchas proporciona información sobre la expresión diferencial de proteínas. La intensidad de las manchas permite conocer los niveles de expresión.

35 Separación de proteínas Aplicaciones 2D-PAGE Para realizar estos estudios de proteómica de expresión se pueden utilizar: Organismos completos Líneas celulares Fluidos biológicos Comparación de tejidos normales con tejidos enfermos (cancer, enfermedades cardiacas). Comparación de células tratadas con fármacos o diferentes estímulos.

36 Separación de proteínas Aplicaciones 2D-PAGE Virus de la leucemia murina de Abelson (AMuLV)

37 Separación de proteínas Aplicaciones 2D-PAGE Secretoma de Pseudomonas syringae

38 Separación de proteínas Aplicaciones 2D-PAGE Otra aplicación importante es la realización de mapas de proteínas (proteómica del mapa celular) en: Microorganismos Orgánulos celulares Complejos de proteínas También se puede utilizar para caracterizar proteínas en subproteomas, obtenidos mediante alguna forma de purificación del proteoma.

39 Separación de proteínas Limitaciones 2D-PAGE Técnica muy laboriosa: requiere mucho tiempo (2 días) y es difícil de automatizar. Análisis de una única muestra por gel 2D-PAGE. Limitada por el número y tipo de proteínas a resolver: Proteínas muy grandes o hidrofóbicas no entran en el gel durante la primera dimensión. Proteínas muy ácidas (pis < ph3) o muy básicas (pis> ph 10) no se resuelven muy bien. Limitada detección de proteínas poco abundantes.

40 Espectrometría de masas

41 Espectrometría de masas La espectrometría de masas (MS, mass spectrometry) es una técnica clave para la identificación y caracterización de proteínas en proyectos proteómicos. Otros procedimientos para la identificación y caracterización de proteínas: Secuenciación del extremo N-terminal Detección con anticuerpos específicos Co-migración con proteínas conocidas Sobre-expresión y delección de genes

42 Espectrometría de masas Estos métodos son generalmente lentos, laboriosos o caros. Por tanto, no resultan apropiados para su utilización a gran escala. La MS se ha convertido en el método de elección para la identificación de proteínas a gran escala debido a su rapidez y elevada sensibilidad. La identificación de proteínas a gran escala es el primer paso en el estudio del proteoma de distintos organismos.

43 Espectrometría de masas Método analítico de alta procesividad para medir el peso molecular (MW) de muestras proteicas mediante medida de las masas de sus iones. Sólo requiere concentraciones picomolares. Precisión del 0.01% del MW total de la muestra: para una proteína de 40 kda, hay un error de 4 Da. Alta capacidad de procesamiento: 100 spots/día.

44 Espectrometría de masas La MS también permite la caracterización de sustituciones de aminoácidos y modificaciones posttraduccionales (glicosilación y fosforilación). El análisis de proteínas mediante MS ha sido posible gracias al desarrollo de métodos de ionización suave, que permiten la formación de moléculas proteicas con carga eléctrica (iones). Los métodos de ionización suave permiten convertir biomoléculas grandes, polares y no volátiles en iones en fase gaseosa.

45 Espectrometría de masas La MS permite la obtención de información estructural de las proteínas (masas y secuencias de aminoácidos). Esta información se puede utilizar para identificar las proteínas mediante busquedas en las bases de datos de DNA y proteínas. La obtención de información de las proteínas mediante MS se puede dividir en 3 etapas: 1. Preparación de la muestra. 2. Ionización de la muestra. 3. Análisis de masas de la muestra.

46 Espectrometría de masas La masa de una proteína no es suficiente para identificarla. En el análisis MS, las proteínas deben ser convertidas en péptidos, mediante proteolisis, con una proteasa específica de secuencia, generalmente tripsina. Los componentes de un espectrómetro de masa son: Fuente de ionización Analizador(es) de masas Detector que mide la relación masa /carga (m/z) de los iones en fase gaseosa

48 Espectrometría de masas Las muestras proteícas si están ionizadas se pueden manipular facilmente en el espectrómetro de masas. La fuente de ionización, el analizador de masas y el detector están en alto vacio para permitir el libre movimiento de los iones. Separación en el analizador de masas y detección de iones separados en base a la relación m/z. Formateo de las señales obtenidas y generación de un espectro de masas.

49 Espectrometría de masas Detección de los iones en fase gaseosa + Q1 q2 Conversión a iones en fase gaseosa Separación de los iones por m/z TOF Fuente de iones Analizador(es) de masas 3 componentes principales Detector

51 Espectrometría de masas Preparación muestra Introducción de la muestra en la fuente de ionización: Directa Mediante cromatografía: HPLC Electroforesis capilar Las muestras proteicas se cargan positivamente durante la ionización.

52 Espectrometría de masas Ionización muestra Conversión de los péptidos en iones en fase gaseosa mediante técnicas de ionización suave. Tipos de fuente de ionización suave: Ionización/desorción con láser asistida con matriz (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) para muestras en estado sólido. Ionización mediante electrospray (ESI, ElectroSpray Ionization) para muestras en solución. Estas técnicas permiten la formación de iones sin una perdida significativa de la integridad de la muestra.

53 Espectrometría de masas Ionización muestra En el MALDI, la muestra sólida se mezcla con una matriz de naturaleza orgánica sobre una placa metálica. La matriz está formada por moléculas que absorben una pequeña cantidad de energía. Tipos de matrices: Ácido 2,5-dihidroxido benzoico Ácido ciano-4-hidroxicinámico Cocristalización de la muestra y la matriz al evaporarse el solvente.

54 Espectrometría de masas Ionización muestra Esta preparación se somete a pulsos cortos de láser en alto vacío que provoca que la absorción de energía por parte de la matriz sea convertida en energía de excitación y en transferencia de protones (H + ) a la muestra (ionización). El área irradiada se calienta dando lugar a la desorción de los iones de fase sólida a gaseosa. Los iones en fase gaseosa son acelerados a través de vacio por un campo eléctrico hacia el detector.

55 Espectrometría de masas Ionización muestra

57 Espectrometría de masas Ionización muestra En el ESI o electronebulización, vaporización de la muestra en solución al pasarla a través de un capilar al que se aplica una alta diferencia de potencial. Formación de un aerosol de gotas cargadas que pasan a una zona de potencial más bajo, y son desolvatadas, adquiriendo protones las moléculas de la muestra y dando lugar a iones con carga múltiple. Nanoelectrospray: introducción de microcapilares de borosilicato recubiertos de oro para la inyección de la muestra en el espectrómetro.

60 Espectrometría de masas Análisis muestra Separación de los iones en fase gaseosa según su m/z en alto vacio en un analizador de masas. Tipos de analizadores de masas: Analizador de tiempo de vuelo (TOF,Time Of Flight) Analizador triple cuadrupolo Trampa iónica Fragmentación opcional de los iones peptídicos seleccionados mediante: Descomposición metaestable (PSD) Disociación inducida por colisión (CID)

61 Espectrometría de masas Análisis muestra Distintas combinaciones de fuentes de ionización y de analizadores de masas. Las más utilizadas: MALDI-TOF: Fuente de MALDI acoplada a un analizador TOF. Ionización ESI combinada con un analizador triple cuadrupolo, con una trampa iónica o con un híbrido cuadrupolo tiempo de vuelo (Q-TOF). Reciente desarrollado de otras combinaciones: Fuentes de MALDI acopladas a un analizador Q-TOF Dos analizadores TOF en tándem (MALDI-TOF-TOF)

62 Espectrometría de masas Análisis muestra El analizador TOF es el que más frecuentemente se asocia con fuentes de ionización MALDI. Aceleración de los iones en un campo eléctrico a la salida de la fuente de ionización. La determinación del valor m/z de cada ión en el analizador TOF se realiza mediante una medida muy precisa del tiempo de vuelo en una región de alto vacio desde la aceleración de los iones en la fuente hasta que impactan en el detector.

63 Espectrometría de masas Análisis muestra

67 Espectrometría de masas Análisis muestra Finalmente, medida de las masas en un detector de iones obteniendo un espectro de masas que refleja la abundancia de los iones frente a su valor m/z.

69 Espectrometría de masas Extremadamente sensible. VENTAJAS Precisión de medida de las masas de un átomo. En principio, la detección de un peptido relativamente corto, permite la identificación inequívoca de una proteína. PROBLEMAS La proteólisis con proteasas de algunas proteínas es difícil. Algunos peptidos son difíciles de ionizar. Debido a la alta sensibilidad del método, es difícil evitar las contaminaciones.

70 Espectrometría de masas MALDI-TOF Se considera un pilar de la proteómica: Tecnología robusta Cara Posibilidades de automatización Tiempo de análisis de cada muestra muy corto: permite realizar análisis a gran escala. La principal ventaja reside en la posibilidad de realizar análisis a gran escala de organismos con genomas completamente secuenciados.

71 Espectrometría de masas MALDI-TOF La MS MALDI-TOF tiene limitaciones: La ionización de los péptidos es selectiva y no es cuantitativa. Si la cantidad de proteína en el gel es pequeña, el número de péptidos observado puede ser bajo. Poca utilidad para analizar mezclas de proteínas. Requiere información adicional: Si no se dispone de la secuencia completa del genoma Si se tiene poca cantidad de proteína

72 Espectrometría de masas Aplicaciones Para la identificación de proteínas mediante MS se han desarrollado dos estrategias: 1. Identificación mediante huella peptídica (PMF, Peptide Mass Fingerprinting) o mapeo peptídico: utilizando un espectrómetro tipo MALDI-TOF. 2. Identificación mediante fragmentación de péptidos obteniendo la secuencia total o parcial de aminoácidos (secuencia peptídica o etiqueta de secuencia): utilizando un espectrómetro de masas en tándem (MS/MS).

73 Espectrometría de masas Huella peptídica Herramienta para la identificación a gran escala de proteínas presentes en las bases de datos. La PMF de una determinada proteína es un conjunto de péptidos generados mediante la digestión con una proteasa específica. Normalmente digestión de la proteína con tripsina: rotura específica por lisinas (K) y argininas (R), sino están unidas por prolina.

74 Espectrometría de masas Huella peptídica

75 Espectrometría de masas Huella peptídica Espectro de masas obtenido en un MALDI-TOF de la digestión de una proteína con tripsina

76 Espectrometría de masas Huella peptídica Las masas peptídicas experimentales de una proteína desconocida son comparadas con las masas peptídicas teóricas de proteínas presentes en bases de datos. Diversos algoritmos disponibles en Internet para realizar este análisis: PEPSEA, PROFOUND, MS-FIT... La identificación correcta de la proteína requiere que las masas de un gran número de péptidos coincidan con las masas teóricas de los péptidos y que cubran parte de la secuencia de la proteína en la base de datos.

77 Espectrometría de masas Huella peptídica

78 Espectrometría de masas Huella peptídica Rapidez en el análisis. VENTAJAS Análisis y busqueda en la base de datos pueden automatizarse completamente. PROBLEMAS La secuencia proteíca tiene que estar en la base de datos. Escasa eficacia en grandes bases de datos de DNA sin anotar o sin traducir (como el genoma humano). No funciona bien con mezclas de proteínas. Sensible a las modificaciones post-traduccionales.

79 Espectrometría de masas Secuencia peptídica Los espectrómetros de masas en tándem (MS/MS) permiten la determinación de la secuencia de aminoácidos. Fragmentación de un péptido específico en péptidos más pequeños que pueden utilizarse para deducir la secuencia proteica. Estrategia utilizada para la identificación de: Proteínas sin anotar en las bases de datos. Ambiguedades en MS MALDI-TOF.

80 Espectrometría de masas Secuencia peptídica La triple cuadrupolo es la MS/MS más utilizada para obtener secuencias proteícas. En el primer espectrofotómetro (MS1-modo MS), todos los iones en un rango m/z se transmiten por Q1 y Q2 para el análisis de masas en Q3: Selección de un ión de interés. En el segundo espectrofotómetro (MS2-modo MS/MS): Q1 separa el ión de interés. Q2 fragmenta el ión de interes en una cámara de colisión CID con un gas inerte (nitrógeno o argon). Q3 mide la m/z de los productos de disociación.

81 Espectrometría de masas Secuencia peptídica

83 Espectrometría de masas Secuencia peptídica El ión de interés interacciona con el gas de colisión y tiene lugar la fragmentación del esqueleto peptídico. Debido a que la ruptura del enlace peptídico puede ocurrir en múltiples sitios se ha creado una nomenclatura para indicar los tipos de iones generados: ión b, el ión mantiene el extremo N del péptido. ión y, el ión mantiene el extremo C del péptido.

86 Espectrometría de masas Secuencia peptídica Los espectros de fragmentación MS/MS proporcionan información de las diferencias de masas entre dos iones consecutivos del mismo tipo (iones de la serie y o b). Las diferencias entre dos iones consecutivos del mismo tipo (y o b) corresponderían a la perdida de un residuo de aminoácido en el péptido. Estos espectros proporcionan información sobre la identidad y posición del aminoácido en el péptido, permitiendo determinar la secuencia de aminoácidos.

88 Espectrometría de masas Secuencia peptídica Amino Acid 3 Letter Code Single Letter Code Residue Mass Monoisotopic Average Glycine Gly G Alanine Ala A Serine Ser S Proline Pro P Valine Val V Threonine Thr T Cysteine Cys C Isoleucine Ile I Leucine Leu L Asparagine Asn N Aspartic Acid Asp D Glutamine Gln Q Lysine Lys K Glutamic Acid Glu E Methionine Met M Histidine His H Phenylalanine Phe F Arginine Arg R Tyrosine Tyr Y Tryptophan Try W

89 Espectrometría de masas Secuencia peptídica Si la fragmentación es de buena calidad, se puede obtener la secuencia completa del péptido. Otras veces sólo se obtiene una secuenciación parcial del péptido. La información sobre la secuencia de aminoácidos parcial, masa del péptido, y la localización exacta de los aminoácidos puede permitir la identificación de la proteína en las bases de datos (etiqueta de secuencia). Diversas herramientas bioinformáticas para la interpretación de la fragmentación de un péptido (PEPSEA, SEQUEST, PERFRAG, MS-TAG y MASCOT).

92 Espectrometría de masas Secuencia peptídica La secuenciación peptídica de novo es la estrategia de elección para identificación de proteínas en organismos que no están secuenciados. El objetivo es obtener múltiples secuencias de los péptidos de una proteína mediante MS/MS, y realizar busquedas de homologías frente a proteínas presentes en bases de datos. Aunque la proteína de interés pueda no ser identificada o desconocida, la información de la secuencia proteíca puede ser utilizada para clonar el gen correspondiente.

93 Espectrometría de masas Secuencia peptídica VENTAJAS Mayor especificidad para la identificación de proteínas que la PMF. Compatible con mezclas de proteínas. PROBLEMAS Dificultad en la automatización del proceso. Falta de flexibilidad en los programas informáticos para la busqueda de etiquetas de secuencia.

94 Nuevas tecnologías

95 Nuevas tecnologías Nuevos desarrollos de tecnologías proteómicas sin llevar a cabo la separación en PAGE: Cromatografía multidimensional Etiquetado de péptidos con diferentes reactivos: técnica ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags) Electroforesis capilar acoplada a MS Microarrays de Proteínas Técnicas complementarias a las descritas previamente. También desarrollo de mejoras en la 2D-PAGE.

96 Nuevas tecnologías Cromatografía multidimensional Aproximación multidimensional utilizando cromatografía líquida bidimensional: columna de intercambio iónico (separación por carga). columna de fase reversa (separación por hidrofobicidad). Seguida de análisis de los péptidos mediante MS (MudPIT: Multidimensional protein identification technology). La conjunción de cromatografía multidimensional y MS es la manera más adecuada para automatizar la investigación del proteoma.

97 Nuevas tecnologías Cromatografía multidimensional Esto ha originado la técnica LC-MS/MS (Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry). Requiere la digestión previa de las proteínas con una proteasa. Este método permite la separación de cientos de proteínas en un solo experimento.

98 Nuevas tecnologías Técnica ICAT ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags): Técnica aplicada al estudio del perfil de expresión diferencial de proteínas entre dos muestras proteicas (proteómica de expresión). Las dos muestras son marcadas con el reactivo de ICAT ligero o pesado (hidrógeno o deuterio): difieren en la masa (8 Da) debido a la composición de isótopos. El reactivo ICAT se une a las cisteínas mediante un grupo tiol y contiene biotina para facilitar la purificación mediante cromatografía de afinidad.

99 Nuevas tecnologías Técnica ICAT

100 Nuevas tecnologías Técnica ICAT Posteriormente, las dos muestras marcadas se mezclan y se digieren con tripsina. Separación de los péptidos marcados con ICAT en una columna de afinidad y análisis mediante MS. La intensidad relativa de los péptidos de cada muestra indica la abundancia de la proteína en las muestras. La fragmentación del péptido mediante MS/MS permite determinar la secuencia de aminoácidos y conduce a la identificación de la proteína.

101 Nuevas tecnologías Técnica ICAT

102 Nuevas tecnologías Técnica ICAT VENTAJAS Permite realizar en el mismo análisis: Identificación de las proteínas. Comparación de los niveles de expresión. Eliminación de la 2D-PAGE para cuantificar las proteínas. PROBLEMAS Utiliza proteínas conteniendo cisteina (presente en la mayor parte de proteínas). Baja sensibilidad para proteínas poco abundantes.

103 Microarrays de proteínas

104 Microarrays de proteínas La determinación de la cantidad de mrna no proporciona información suficiente sobre las proteínas que se traducen a partir de esta molécula. Las proteínas sufren toda una serie de modificaciones post-traduccionales a lo largo de su proceso de síntesis: Procesamientos proteolíticos. Glicosilaciones. Formación de complejos proteicos. Por otra parte, las proteínas han de plegarse correctamente para ser totalmente funcionales.

105 Microarrays de proteínas Para completar el estudio de las funciones de las proteínas se ha de recurrir a la información contenida en el proteoma. Las proteínas de interés en un proteoma pueden ser expresadas masivamente, purificadas, depositadas e inmovilizadas de manera individual, ordenada e independiente sobre un soporte sólido. Permiten realizar el análisis a gran escala de: Perfiles de expresión diferencial de proteínas. Interacciones proteína-proteína (interactoma).

106 Microarrays de proteínas Una mezcla compleja (lisado celular o suero) se pasa sobre el microarray para permitir la unión a su correspondiente proteína diana. Principal limitación técnica: Dificultad para detectar e identificar proteínas de modo específico, en comparación con los microarrays de DNA, que no poseen esta limitación.

107 DE GENÓMICA A PROTEÓMICA PROTEOMA es el conjunto de proteínas codificado por el genoma. El estudio del proteoma es la PROTEÓMICA Proteínas de cualquier célula Isoformas Proteínas modificadas Interacciones entre proteínas Descripción estructural de las proteínas Descripción estructural de los complejos proteicos Por extensión: cualquier cosa post-genómica

108 High-throughput Biochemistry Proteómica (en la actualidad): Bioquímica de proteínas a gran escala con gran precisión y rendimiento. Objetivo: Descripción completa de la función celular Plataformas para la proteómica y genómica funcional

109 Escalabilidad de la proteómica Genómica: GRAN escalabilidad PCR, secuenciadores automáticos,etc. Proteómica: POCA escalabilidad. Motivos: Material limitado y variable Degradación de la muestra Rango dinámico de abundancia muy grande (10 6 ) Modificaciones post-traduccionales abundantes Especificidad temporal y de desarrollo Perturbaciones patológicas Perturbaciones farmacológicas

110 Comparación con los chips de DNA Chips de DNA: - No dan información directa de la función génica - Sencillos de hacer Chips de proteína: - información directa de función - Complejos de hacer, ya que la función proteica es dependiente de estado, como las modificaciones posttraduccionales, interacción con otras proteínas, localización subcelular, modificaciones covalentes reversibles, etc. Manufactura de chips Deben retener la función de la proteína Ser compatibles con las tecnologías de fabricación Deben permanecer en un ambiente húmedo

111 Análisis de proteínas a escala proteómica Si queremos definir la: - Identidad - Cantidad - Estructura - Función De todas o un grupo de proteínas (dentro de un contexto celular) Debemos de poder: Generar un conjunto de CLONES que expresen las proteínas individuales de todo o parte un PROTEOMA Seguido de: ANÁLISIS Proteínas en un formato ÚTIL

112 TÉCNICAS NECESARIAS Genéticas Bioquímicas Biología celular Construcción de chips Identificación de interacciones Localización de proteínas en compartimentos celulares 1. Expresión y purificación de proteínas 2. Pruebas de actividad a escala proteómica a) Aproximación genómica bioquímica b) Microarrays - Analíticos - Funcionales

113 1. Expresión y purificación de proteínas Localización de los ORFs (pautas abiertas de lectura) Problemas: - A veces difícil localización - Señales de splicing - Poliadenilación Problemas: Clonación de los ORFs - Se trata de una simplificación - Se elige un mrna y se descartan las isoformas - Las modificaciones posttraduccionales (fosforilación, glicosilación, metilación, acetilación) pueden no ser consideradas - No vale para proteínas de membrana

114 Clonación de los ORFs Requiere: - Cebadores ( primers ) para la PCR - Inserción en vectores Métodos de síntesis de HT: - Síntesis automática - Precio razonable - Rapidez y precisión Inserción en vectores A) Recombinación mediada por la reparación del hueco B) Clonaje independiente de ligación (T4 polimerasa + dctp o dgtp) C) Sistema Gateway de Invitrogen (integración/excisión del fago λ)

115 Inserción en vectores

116 Expresión Sistemas homólogos Es el mejor (modificaciones post traduccionales, interacciones con sus parejas proteicas, etc) Sistemas heterólogos Son necesarios para muchos organismos. Una alternativa son las células de insecto (modificaciones similares a mamíferos) Incorporación de marcadores Fusión de péptidos o proteínas a las proteínas de interés Alta AFINIDAD y SELECTIVIDAD Conservación de la ACTIVIDAD - Glutatión-S-transferasa / agarosa de glutatión - Marcador de Hisx6 / agarosa de Ni - Péptido de unión a calmodulina / agarosa de calmodulina - Proteína A / γ-inmunoglobulina - Combinación de anteriores con sitios de corte (trombina, TEV, etc) - Proteína de unión a maltosa - Epítopos: hemaglutinina, Myc y FLAG - Derivados de GFP. Detección mediante FRET

117 Detección GFP mediante FRET PROBLEMAS GENERALES: - Cada proteína de fusión requiere un esquema y un protocolo diferente - Hay proteínas que no se dejan purificar - Hay proteínas que se inactivan al fusionarse

118 2. Actividad proteica a escala proteómica a) Aproximación Bioquímica genómica b) Microarrays (Chips) a) Aproximación bioquímica genómica Uso de análisis bioquímico en paralelo de grupos de proteínas provenientes de un proteoma. El objetivo es identificar a una proteína como responsable de una función. Clonación GST-ORF Expresión y purificación en grupos de 96 Ensayo bioquímico Grupos Positivos Subgrupos Ensayo en los subgrupos Positivos (deconvolución) Ventajas: - Rapidez de asignación de función a ORFs. - Válido para cualquier tipo de ensayo de actividad - Alta sensibilidad - Permite la detección de complejos proteicos

119 b) Microarrays Objetivo: análisis de alto rendimiento, a gran escala de la función génica, de forma rápida y barata. Metodología: las proteínas purificadas individuales se depositan en una superficie, generalmente una lámina de vidrio para analizar su actividad

120 Microarrays de proteínas Diseño Factores de relevancia en el diseño de microarrays de proteínas: 1- Naturaleza del soporte sólido. 2- Proteínas a inmovilizar. 3- Método de inmovilización. 4- Formato del microarray. 5- Agente de captura (en microarrays de detección). 6- Método de detección.

121 Microarrays de proteínas Diseño

122 Microarrays de proteínas Diseño Desarrollo técnicamente complicado debido a la complejidad y diversidad estructural de las proteínas. Las proteínas no tienen una estructura homogénea ni un patrón de unión específico, sino que cada proteína posee unas características bioquímicas particulares. No existe una técnica equivalente a la PCR capaz de amplificar la cantidad de proteína en una muestra. Dificultades técnicas en la adquisición y unión estable de proteínas a las superficies.

123 Microarrays de proteínas Soporte Características de un soporte ideal: 1- Estabilidad química 2- Buena morfología de los puntos o spots. 3- Mínimas uniones no específicas. 4- Baja señal de fondo. 5- Alto ratio superficie/volumen. 6- Compatibilidad con los distintos sistemas de detección. 7- Baja autofluorescencia.

124 Microarrays de proteínas Soporte La elección del soporte condicionará el formato final del microarray así como el método de detección preferible. La carga de las proteínas es muy variable, lo que ha provocado que se realicen grandes esfuerzos en la estandarización de materiales de soporte adecuados para cada tipo de microarray. Los soportes porosos (membranas de nitrocelulosa, nylon o fluoruro de polivinilo) son más adecuados para la inmovilización de proteínas que los soportes lisos.

125 Microarrays de proteínas Soporte Los soportes porosos poseen una mayor superficie y en consecuencia una mayor capacidad de unión. Nueva generación de química de superficies de membrana y de vidrio ofrecen una variedad de superficies de soporte: No requieren el empleo de agentes bloqueantes (eliminación del ruido de fondo). Introducción de elementos funcionales (PEG, polietilenglicol) que previenen el contacto directo de la proteína con la superficie.

126 Microarrays de proteínas Soporte

127 Tipos de chips Superficie Ventajas Desventajas Sustratos blandos 2D Poliestireno Membranas de nitrocelulosa PVDF (fluoruro de polivinilideno) No requiere modificar la proteina. Alta capacidad de retención de proteína Unión no especifica de la proteína. Orientación al azar. Ruido de fondo. Chips de baja densidad (Adsorción y absorción) Estructuras superficiales 3D Poliacrilamida y agarosa (difusión) No requiere modificar la proteina. Alta capacidad de retención de proteína No disponibles comercialmente Nanopocillos Vidrio recubierto de PDMS (polidimetilsilosano) (entrecruzamiento) Unión fuerte y alta densidad de empaquetamiento Oreintación al azar de las proteínas Vidrio Vidrio solo Idem a 2D Idem a 2D Cubierta de poli-l-lys Activación con aldehido Idem a 2D Chips de alta densidad Idem a 2D Orientación al azar Activación con epoxy Cubierta de oro Alta densidad y resolución Acoplado a SPR y MS Orientación al azar Orientación al azar Unión por afinidad: Avidina o resina de Ni2+ Unión fuerte, especifca y de alta densidad Proteinas deben ser biotiniladas o Hisx6 (adsorción, absorción, entrecruzamiento o unión por afinidad)

128 Microarrays de proteínas Inmovilización Moléculas de naturaleza proteica inmovilizadas a gran escala sobre el soporte sólido: Enzimas Péptidos Anticuerpos Antígenos Alérgenos Pequeñas moléculas sintéticas Las proteínas se immovilizan a la superficie utilizando uniones covalentes, linkers o moléculas de afinidad.

129 Microarrays de proteínas Inmovilización

130 Microarrays de proteínas Inmovilización Moléculas adaptadoras de afinidad que favorecen la inmovilización de las proteínas: Proteínas: Biotina, unión a estreptavidina Proteína G, unión a anticuerpo Fc Proteína A, unión a anticuerpo Fc GST, unión a anti-gst MBP, unión a anti-mbp TRX, unión a anti-trx GFP, unión a anti-gfp Poliaminoácidos (poli-histidina, poli-lisina o poli-cisteina) Polipéptidos

131 Microarrays de proteínas Inmovilización Las moléculas de afinidad ancladas en la superficie del microarray mantienen unidas las proteínas por medio de una segunda molécula adaptadora.

132 Microarrays de proteínas Inmovilización La inmovilización de las proteínas sobre el soporte puede hacerse mediante diversas técnicas: Impresión por contacto Impresión sin contacto Litografía Formatos de microarrays muy variados: Arrays planos. CD de centrifugación. Microcanales. 3D sobre superficie de silicio.

133 Microarrays de proteínas Formatos El formato de array plano es el más extendido y comercializado por numerosas empresas. Formatos alternativos encaminados a disminuir la cantidad de muestra y reactivos necesarios basados en: Miniaturización Tecnologías de microfluídica Permiten el procesamiento de alta densidad de proteínas a escala nanométrica.

134 Microarrays de proteínas Formatos CD de centrifugación: el giro del CD hace que la fuerza centífuga dirija la muestra a través de microcanales. Microcanales: plataforma minituarizada para el procesamiento en paralelo de alta densidad de muestras. 3D sobre superficie de silicio: permite la orientación de los anticuerpos gracias a su estructura de pilares.

135 Sustratos blandos - Se hace una capa fina de poliacrilamida o agarosa sobre el vidrio - Se depositan las proteínas con fotolitografía - Se entrecruzan para inmovilizarlas Se usan superficies de poliestireno, nitrocelulosa o PVDF. No permiten alta densidad de empaquetamiento Los puntos de aplicación difunden en la superficie Relación señal ruido muy bajos Orientación al azar Estructuras de superficie 3D Ventajas Alta capacidad de inmovilización Ambiente acuoso Proteínas activas Desventajas Difícil cambiar tampones Difícil recuperar las moléculas Orientación al azar

136 Nanopocillos Vidrio recubierto de PDMS Se hacen nanopocillos en los cuales se depositan las proteínas Las proteínas se inmovilizan por entrecruzamiento Ventajas - Alta capacidad de inmovilización - Reducen la evaporación - Minimizan las contaminación cruzada - Minimizan ruido de fondo -Son abiertos, con lo que se pueden tratar secuencialmente con tampones, lavados, etc. - Recuperación de las muestras fácil Desventajas Requiere equipo especializado, sofisticado y caro Orientación al azar

137 Vidrio Unión de la proteína directamente en la superficie del vidrio o bien después de aplicar recubrimientos de diferentes tipos: - Poli-L-Lisina (adsorción) - Activación con aldehido (covalente) - Activación con epoxy (covalente) - Recubrimiento de oro (covalente) O bien - Biotina (afinidad) - Hisx6 (afinidad) Ventajas -Enlace covalente disminuye probabilidad de alteración de la conformación nativa - Afinidad: orientación correcta Desventajas Grupos NH2 de cadenas laterales pueden modificar actividad. Afinidad: hay que biotinilar o marcar con Hisx6 todas las proteínas

138 Microarrays de proteínas Detección Métodos libres de marcaje previo de las proteínas díana, evitando modificar su actividad: Espectrometría de masas (MS) Resonancia de plasmones superficiales (SPR, Surface Plasmon Resonance) Métodos de marcaje empleando sondas marcadas con diferentes técnicas: Métodos de detección directa, se utiliza una sonda marcada compatible con el sustrato. Métodos de detección indirecta, se marca directamente la proteína de interés.

139 Microarrays de proteínas Detección Resonancia de plasmones superficiales (SPR): técnica basada en fenómenos ópticos que tiene lugar sobre la superficie de un metal. Detecta cambios de concentración de la masa del chip debidos a la unión de un ligando a la proteína inmovilizada.

140 Microarrays de proteínas Detección En función del método de marcaje, la técnica de detección empleada será diferente: Detección cromogénica Detección por quimioluminiscencia Detección por fluorescencia Detección por desintegración radioactiva Los cromógenos son sustratos para reacciones enzimáticas que generan productos coloreados. Los más empleados: Peroxidasa Fosfatasa alcalina

141 Microarrays de proteínas Detección La emisión de luz por quimioluminiscencia se produce por los productos de una reacción química en la que participa la enzima luciferasa. Los fluoróforos (fluoresceína, rodamina, focobiliproteínas, acridinas y cianinas) absorben fotones de luz de una fuente externa (láser) provocando la excitación de los electrones de la molécula y la emisión de luz en una longitud de onda mayor a la de la luz incidente. La detección por desintegración radioactiva se basa en la incorporación de 32 P en proteínas, DNA y RNA.

142 Microarrays de proteínas Limitaciones Esenciales para la investigación básica y aplicada. La disponibilidad o producción masiva de proteínas individuales es la etapa más costosa de esta tecnología. Retos tecnológicos pendientes que hagan accesible la utilización de esta herramienta a un gran número de investigadores: Problemas de detección de la interacción. Problemas de estabilidad de las proteínas inmovilizadas.

143 Microarrays de proteínas Aplicaciones Alto potencial de aplicaciones en: Identificación de fármacos Identificación de dianas potenciales para fármacos Diagnóstico clínico Clasificación en función de la aplicación: 1- Microarrays de detección de proteínas 2- Microarrays de función o interacción de proteínas 3- Microarrays de screening inverso de proteínas

144 Microarrays de proteínas Tipos 1- Microarrays de detección de proteínas Permiten la identificación y cuantificación de proteínas. Herramientas muy útiles de diagnóstico. Se basan en la captura de proteínas por medio de moléculas de diversa naturaleza (agentes de captura) que permanecen ancladas a la superficie del microarray. Diferentes agentes de captura: Anticuerpos, Affibodies y Aptámeros

145 Microarrays de proteínas Tipos Anticuerpos: proteínas altamente específicas producidas por el sistema inmune. Affibodies: moléculas que mimetizan las funciones de los anticuerpos. Aptámeros: moléculas de DNA o RNA capaces de unirse a otra molécula específica (proteína o ligando).

146 Chips analíticos Se unen diferentes tipos de ligandos, como anticuerpos, antígenos, aptámeros de DNA o RNA, carbohidratos pequeñas moléculas Muestras de proteína de dos estados biológicos se marcan separadamente con agentes fluorescentes rojos y verdes, se mezclan, e incuban en el chip. Las manchas indican sobreexpresión Determinar niveles de expresión de proteínas. Perfiles de expresión Diagnóstico clínico

147 Chips analíticos: anticuerpos - Es el más usual - Se depositan los anticuerpos a alta densidad en el chip - Se pasa un extracto celular, suero o incluso células vivas sobre el chip - El antígeno se une - Detección con antígeno (extracto) marcado o con un segundo anticuerpo Desventajas: - Tener agentes que reconozcan la proteína de interés: anticuerpos - Anticuerpos policlonales poco específicos y caros - Anticuerpos monoclonales mucho mas caros, más difíciles de producir y tardan más tiempo Alternativa a producción de anticuerpos o sucedáneos - Presentación de Ab en fagos - Presentación de ribosomas - SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) - Presentación de mrna - Affibody display Construcción de un amplio repertorio de regiones con actividad de unión potencial

148 Chips analíticos: alergenos o antígenos - Inverso al anterior - Se depositan los antígenos a alta densidad en el chip - Se detectan los anticuerpos (normalmente suero) sobre el chip - Detección de los anticuerpos Ejemplo 1: Hiller et al. 94 alergenos purificados unidos a vidrio Perfiles de reactividad frente a las IgE de pacientes alérgicos Pequeñas cantidades de suero Test de alergia alternativo al de piel Ejemplo2: Robinson et al. >300 autoantígenos de 8 enfermedades autoinmunes, sobre vidrio Pequeñas cantidades de suero

149 Chips analíticos: péptidos Objetivo: Detección de epitopos en las proteínas que definan su actividad básica Ejemplo 1: Houseman et al - Inmovilización en vidrio recubierto de oro de >3000 péptidos de 9 aminoácidos de longitud - Localización de sustratos de la c-src tirosina quinasa - Detección con SPR, fluorescencia e imagen de fósforo Ventajas: - Péptidos más cortos - Péptidos más estables que las proteínas - Permiten fabricación de chips de alta densidad - Síntesis del péptido in situ mediante fotolitografía o síntesis dirigida por luz (ahorro económico ya que se necesita muy poco material) Chips analíticos: carbohidratos

150 Microarrays de proteínas Tipos 2- Microarrays de función o interacción de proteínas Permiten el estudio simultaneo de diferentes interacciones. Las aplicaciones comerciales centradas en estudios de interacción proteína proteína y enzima-sustrato.

151 Chips funcionales Las proteínas o los péptidos provenientes del proteoma de un organismo se purifican o se sintetizan individualmente usando métodos de alto rendimiento o capacidad de ejecución (HT) Muestras de proteína de dos estados biológicos se marcan separadamente con agentes fluorescentes rojos y verdes, se mezclan, e incuban en el chip. Las manchas indican sobreexpresión Permite analizar: - Actividad de proteínas - Propiedades de unión a ligando - Modificaciones post-traduccionales - Identificación dianas farmacológicas - Construcción de redes biológicas

152 Chips funcionales: ejemplos Ejemplo 1: Zhu et al Análisis de interacción de familias de proteínas -119 proteinas quinasas y 17 sustratos -Los sustratos son inmovilizados en nanopocillos -Las quinasas se incuban con los sustratos en presencia de ATP* -Se detectan los sustratos marcados con imagen de fósforo Ejemplo 2: Zhu et al Análisis de un proteoma completo de 6200 ORFs de levaduras. - Las proteínas se marcaron con GST y con Hisx6 (ambos). Se obtuvo - un rendimiento del 80% de proteínas funcionales - Se unen al chip recubierto de Ni-NTA con la His x6 - Chequeo de calmodulina y fosfoinosítidos (PIs) - Se obtuvieron 6 interacciones conocidas junto con 33 nuevas de calmodulina y mas de 150 proteínas que interaccionaban con los PIs

153 Aplicaciones generales de los chips

154 Microarrays de proteínas Tipos 3- Microarrays de screening inverso de proteínas Inmovilización de lisados celulares que representan todo el repertorio de proteínas celulares en un determinado estadio celular. Principal ventaja: las muestras inmovilizadas no requieren un paso previo de desnaturalización ni marcaje. Las proteínas capturadas pueden ser identificadas mediante MS o bien mediante anticuerpos específicos.

155 Microarrays de proteínas Tipos Permiten realizar un screening de todos los anticuerpos presentes en el suero de un paciente en busca de una determinada proteína diana. Enorme potencial en la identificación de biomarcadores en análisis proteómicos.

156 Genómica Bioquímica vs Chips Genómica bioquímica: - Requiere 64 ensayos para cubrir el genoma de levadura (grupos de 96 proteínas) - Es muy flexible para muchos tipos de ensayos bioquímicos - Particularmente útil para ensayos de actividad enzimática Desventajas: El uso de los grupos de proteínas (o pools) no asegura la calidad de las proteínas Las otras 95 proteínas pueden interferir con la medida No permite medidas fiables de unión con fluorescencia No puede maneja múltiples positivos al mismo tiempo Chips de proteína: Permite chequear la calidad individual de cada proteína Identificación inmediata de ORFs responsables de una actividad específica Identificación de positivos múltiples en una sola vuelta Análisis de alto rendimiento de actividades proteicas Automatización de la construcción, ensayo y lectura de resultados Desventajas: Se necesitan cultivar 6000 cepas (levadura) y 6000 purificaciones de proteínas Se necesita inmovilizar los sustratos para los ensayos de unión fluorescentes

157 Conclusiones Los chips pueden ser una herramienta poderosísima en la biología a gran escala La metodología de fabricación sobre vidrio está validada para análisis de proteína a partir de un proteoma completo La metodología de fabricación esta robotizada, así como la de ensayo y lectura de resultados La mejora de la producción de anticuerpos como reactivos influirá en la mejora de los chips como herramientas en el análisis del proteoma

158 Retos de la proteómica

159 Retos de la proteómica Todavía no es posible estudiar las proteínas a un nivel similar al de los ácidos nucleicos. En contraste con el estudio del DNA, presenta una serie de retos: No hay un equivalente a la PCR para proteínas, así que el análisis de proteínas poco abundantes es complejo. En estudios de interacción de proteínas, las conformaciones nativas de las proteínas deben mantenerse para obtener resultados significativos.

160 Retos de la proteómica Gran interés en la mejora y desarrollo de estrategias que faciliten el estudio de las proteínas y de los proteomas. Enorme potencial de la proteómica en combinación con otras aproximaciones genómicas para comprender mejor como funcionan los sistemas biológicos complejos. La posibilidad de estudiar sistemas biológicos complejos en su totalidad proporcionará respuestas que no pueden obtenerse del estudio de proteínas individuales o grupos de proteínas.