11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A23C 9/123

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A23C 9/123 C12R 1/22 C12R 1/46 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Fermento láctico, y su uso para la preparación de productos antidiarréicos. k Prioridad: FR FR k 73 Titular/es: COMPAGNIE GERVAIS-DANONE rue Jules Guesde F-922 Levallois Perret, FR k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Bouley, Christine; Oudot, Elisabeth y Denariaz, Gérard k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Esteban Pérez-Serrano, M ā Isabel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Fermento láctico, y su uso para la preparación de productos antidiarréicos. La presente invención se refiere a fermentos lácticos, y a sus utilizaciones, en particular para laobtención de productos dotados de propiedades antidiarréicas. Los productos lácteos fermentados de tipo yoghourt se obtienen por fermentación de la leche con una combinación de cepas de bacterias lácticas Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus. Estas bacterias se desarrollan rápidamente en la leche, produciendo cantidades importantes de ácido láctico y provocan la coagulación de la leche en algunas horas. Durante la ingestión regular de yoghourt, la flora especifica del yoghourt aparece en las heces, pero desaparece al detener el consumo, ya que no se implanta en el hombre. Por el contrario, otras bacterias lácticas forman parte de la flora banal del tracto digestivo del hombre, se trata en particular de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei y bacterias del género Bidifidobactérium. Un determinado número de especies de Lactobacillus están presentes en la flora intestinal del hombre en buen estado de salud, y su presencia asegura un papel de equilibrio en comparación con otros grupos microbianos. Desde hace mucho tiempo se busca obtener leches fermentadas, que ofreciendo en el consumo unas propiedades organolépticas agradables, contengan una cantidad elevada de bacterias lácticas presentes naturalmente en la flora intestinal del hombre, especialmente bacterias del género Lactobacillus, capaces de desarrollarse en el intestino y contribuir al equilibrio de la flora intestinal. Las especies Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus tienen, en este sentido, el objeto de un interés creciente. Se ha estudiado el efecto eventual de estas bacterias sobre determinadas patologías digestivas (trastornos gastrointestinales, gastro-enteritis, perturbación del tránsito). Varios estudios en los niños han mostrado el efecto benéfico de los fermentos lácticos administrados en forma de leches fermentadas o en forma de polvos, sobre la duración de la diarrea. TOUHAMI y col., [Ann. Pédiatr. (Paris) 39, n 2, p (1992)] han comparado el efecto de la leche y del yoghourt en el niño que sufre diarrea persistente. Se han alimentado con leche o con yoghourt 78 niños hospitalizados que presentan una diarrea persistente desde hace al menos 1 días. El fracaso del tratamiento se define como una no remisión de la diarrea en los primeros días, siendo el número de fracasos significativamente más bajo en el grupo del yoghourt (1 %) que en el grupo de la leche (4 %). Este resultado se traduce indirectamente en una disminución de la duración del episodio diarreico con el yoghourt. ISOLAURI y col., [Pediatrics, vol. 88 (1), (1991)], han realizado un estudio en niños que padecen diarrea aguda desde hace menos de 7días. 71 de los niños del total han recibido L. Casei GG (L. Casei subsp. rhamnosus) bajo la forma liofilizada, o una leche fermentada por L casei GG o un yoghourt termizado. La duración de la diarrea después del tratamiento fue entonces de 2,4 días en el grupo testigo frente a 1,4 días en el grupo L. casei GG bajo la forma liofilizada o bajo la forma de una leche fermentada, o sea una disminución significativa del 42 %. Según el mismo modelo, este equipo ha estudiado igualmente en las diarreas por rotavirus, el efecto de la administración de L. casei GG bajo la forma de polvo, en relación con 2 productos del comercio, siendo uno una preparación de L. casei rhamnosus (Lactophilus) y el otro una leche fermentada con los fermentos de yoghourt y que contenía L. casei rhamnosus(yalacta R )[MA- JAMAA y col., Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (USA), Apr. 199, (3) p ]. Este estudio muestra una significativa reducción de la duración de la diarrea por rotavirus en el grupo L. casei GG (1,8 días) en relación con los grupos Lactophilus (2,8 días) y YALACTA R (2,6 días). Esto se traduce en un reducción del 36 % en relación con Lactophilus y del 31 % en relación con YALACTA R. Los dos estudios precedentes muestran el interés de L. casei subsp. Rhamnosus en la reducción de la duración de la diarrea, al menos en el caso de la diarrea aguda o por rotavirus. Igualmente se ha mostrado, en los niños que sufren diarrea, que el consumo de yoghourt reduce significativamente el volumen de las heces en relación con el consumo de leche [BRAN y col., Les laits fermentés. Actualités de la Recherche, John LIBBEY Eurotext Lid, P (1989)]. El trabajo de [LING y col., Anne Nutri. Metab. 36, p , (1992)] en las personas ancianas (que no sufren diarrea) muestra que una leche fermentada por L. casei GG normaliza la consistencia de las heces en comparacióncon ungrupo control que no consume esta leche fermentada. Sin embargo, Lactobacillus casei tiene un desarrollo muy lento y a menudo irregular en la leche, y los productos obtenidos tienen un gusto poco agradable, amargo, y a menudo demasiado ácido. Se han realizado numerosas tentativas para producir productos fermentados con Lactobacillus casei asociados con todos o parte de los fermentos del yoghourt, pero hasta ahora ninguno permite obtener un resultado satisfactorio. Se sabe que existe una gran variabilidad en los productos obtenidos por fermentación, y que el resultado obtenido depende, en gran parte, de la naturaleza del fermento. Por ejemplo, las curvas de crecimiento, así comolaproducción de ácido láctico, la producción de aromas y el espesamiento del medio, varía de manera importante de una especie de bacterias lácticas a otra, incluso a menudo en el seno de una misma especie. Además, las bacterias lácticas se utilizan más a menudo bajo la forma de fermentos complejos, y las interacciones entre las diferentes cepas a lo largo de la fermentación modifican las propiedades de las cepas, en relación con las observadas en cultivos puros. En resumen, la conjugación entre la variabilidad en el seno de cada especie, y las interacciones entre las diferentes cepas en poblaciones en

3 3 ES T3 4 mezcla compleja, vuelven imprevisible el comportamiento de las cepas lácticas en los fermentos. O, a lo largo de sus investigaciones sobre la simbiosis de los fermentos lácticos, los inventores han descubierto un nuevo fermento del yoghourt particularmente ventajoso cuando se utiliza en asociación con bacterias del género Lactobacillus para la obtención de un producto lácteo fermentado. La presente invención tiene por objeto un fermento del yoghourt constituido por una mezcla de tres bacterias lácteas Streptococcus thermophilus DN , Streptococcus thermophilus DN , y Lactobacillus bulgaricus DN-0 182, así como un fermento láctico, caracterizado porque comprende el fermento del yoghourt tal como se define anteriormente, y comprende además una u otras especies de bacterias lácticas. Estas otras bacterias lácticas se pueden elegir en el grupo constituido por los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, y Lactococcus. Pertenecen preferentemente al grupo Lactobacillus casei, y preferentemente se trata de la bacteria Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DN Las cepas de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DN , Lactobacillus bulgaricus DN-0 182, Streptococcus thermophilus DN , Streptococcus thermophilus DN , utilizadas para la presente invención se han registrado según el Tratado de Budapest del de diciembre de 1994, ante la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) en posesión del Instituto Pasteur, calle Docteur Roux 2, en París, bajo los respectivos números: I- 118 para la cepa Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DN ; I-119 para la cepa Lactobacillus bulgaricus DN-0 182; I-1 para la cepa Streptococcus thermophilus DN ; el número I-121 para la cepa Streptococcus thermophilus DN Las características de estas especies son entre otras las siguientes: -CepaLactobacillus paracasei subsp. paracasei DN Morfología: microorganismo Gram-positivo, no móvil y no forma esporas, se presenta bajo la forma de pequeños bacilos finos. Metabolismo: heterofermentaria, catalasa (-) gluconato (+). Fermentación de azúcares: ribosa (+), adonitol (+), galactosa (+), glucosa (+), fructosa (+), manosa (+), L-sorbosa (+), manitol (+), sorbitoi (+), alfa-metil D-glucósido (+), N-acetilglucosamina (+), arbutina (+), esculina (+), salicina (+), celobiosa (+), maltosa (+), lactosa (+), sacarosa (+), trehalosa (+), beta-gentobiosa (+), turanosa (+), tagatosa (+). - Cepa Streptococcus thermophilus DN Morfología: microorganismo Gram-positivo no móvil y no forma esporas, se presenta bajo la forma de estreptococos grande en diplococos y cadenas cortas. Metabolismo: homofermentaria, catalasa (-). Fermentación de azúcares: D- glucosa (+), D-fructosa (+), sacarosa (+), lactosa (+). - Cepa Streptococcus thermophilus DN Morfología: microorganismo Gram-positivo no móvil y no forma esporas, se presenta bajo la forma de estreptococos grande en diplococos y cadenas cortas. Metabolismo: homofermentaria, catalasa (-). Fermentación de azúcares: D- glucosa (+), D-fructosa (+), sacarosa (+), lactosa (+). - Cepa Lactobacillus bulgaricus DN-0 182: Morfología: microorganismo Gram-positivo no móvil y no forma esporas, se presenta bajo la forma de bacilos muy cortos y rechonchos. Metabolismo: homofermentaria, catalasa (-). Fermentación de azúcares: ribosa (+), D-glucosa (+), D-manosa (+), lactosa (+). La asociación del fermento del yoghourt según la invención, con bacterias del género Lactobacillus, y en particular con Lactobacillus casei, permite obtener unos productos que poseen una población de Lactobacilos elevada, una estabilidad muy buena a lo largo del tiempo, una textura untuosa y propiedades organolépticas excelentes. Igualmente, la invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de un producto lácteo fermentado, dicho procedimiento se caracteriza porque comprende la utilización de un fermento del yoghourt o de un fermento láctico de acuerdo con la invención, tal como se define anteriormente. Igualmente, la presente invención tiene por objeto los productos lácteos fermentados susceptibles de ser obtenidos por un procedimiento de acuerdo con la invención, tal como se define anteriormente. Según una forma de realización preferida de un producto lácteo fermentado de acuerdo con la invención, éste contiene entre 1 x 8 y1,2x 9 células de L. casei por ml, entre 2 x 8 y1x 9 células de S. Thermophilus por ml, y entre 4 x 6 y2x 7 células de L. bulgaricus por ml. Losproductoslácteos fermentados de acuerdo con la invención pueden basarse en leche entera, desnatada o suplementada pudiendo contener especialmente materias grasas, materias secas hidrófilas de la leche, proteínas de soja, azúcares y frutas en trozos o en puré. Igualmente, los inventores han constatado que los fermentos lácticos y las preparaciones de leche fermentada de acuerdo con la invención, que asocian fermentos del yoghourt con Lactobacilllus, poseían propiedades anti-diarréicas superiores a los fermentos y preparaciones de la técnica anterior aconsejadas para este fin. Igualmente, la presente invención tiene por objeto la utilización de fermentos lácticos y de preparaciones de leche fermentada de acuerdo con la invención, para la obtención de productos antidiarréicos. La presente invención se comprenderá mejor con ayuda del complemento a la descripción que sigue, que se refiere a unos ejemplos de obtención de preparaciones de leche fermentada que utilizan fermentos lácticos de acuerdo con la invención, y unos ejemplos que muestran sus propiedades antidiarréicas. Sin embargo, se debe entender que estos ejemplos se dan únicamente a título de ilustración del objeto de la invención por lo que no constituyen de ninguna manera una limitación. Ejemplo 1 Obtención de preparaciones de leche fermentada: 3

4 ES T3 6 Comparación de fermentos lácticos de acuerdo con la invención con fermentos lácticos de la técnica anterior. Se añade leche en polvo a la leche entera, en una relación de 4 gramos de polvo por 0 gramos de leche. Después de la homogeneización se pasteuriza la mezcla lo minutos a 9 C, después se enfría a 38 C antes de sembrarla con cultivos activos de diferentes cepas. 4 - La preparación A contiene únicamente la cepa Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DN , sembrada en una concentración inicial de 2 x 7 células por ml. Después de 3 horas de incubación a 37 C, el ph alcanza el valor de 4,7 y la preparación se conserva a 4 C. La concentración de la cepa DN es entonces de 4 x 9 células por ml. - La preparación B se siembra con la mezcla de las cepas: Streptococcus thermophilus DN ( x 4 células por ml), Streptococcus thermophilus DN ( x 3 células por ml) y Lactobacillus bulgaricus DN (1 x células por ml). La incubación se realiza a 37 C; después de aproximadamente 1 hora, el ph alcanza 4,7, y la preparación se transfiere a 4 C. Las concentraciones en los productos fermentados son: Streptococcus thermophilus DN Streptococcus thermophilus DN ( x 8 células por ml y Lactobacillus bulgaricus DN (7 x 6 células por ml). - La preparación C es una preparación comercial de fermentos del yoghourt THY71 (TEXEL) utilizada como control en los ensayos de degustación. La preparación se siembra con Streptococcus thermmophilus y Lactobacillus bulgaricus en concentraciones idénticas (aproximadamente 3 x 6 células por ml). Después de 3 horas y media de incubación a 44 C se alcanza un ph de 4,7, y la preparación se conserva a 4 C. La concentración es entonces de x 8 células por ml para S. thermophilus y2x 8 células por ml para L. bulgaricus. - La preparación D se siembra con la mezcla de las siguientes cepas: Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DN (2 x 7 células por ml), Streptococcus thermophilus DN ( x 4 células por ml), Streptococcus thermophilus DN ( x 3 células por ml) y Lactobacillus bulgaricus DN (1 x células por ml). La incubación se realiza a 37 C; después de aproximadamente 12 horas de incubación, el ph alcanza 4,7 y se transfiere la preparación a 4 C. Las concentraciones en el producto fermentado son Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei DN (6 x 8 células por ml) Streptococcus thermophilus DN y Streptococcus thermophilus DN ( x 8 células por ml) y Lactobacillus bulgaricus (1 x 7 células por ml). - Las propiedades organolépticas de las cuatro preparaciones se evalúan después de 7 días de conservación a 8 C. Los resultados se ilustran en la Tabla I a continuación: TABLA I Prepa- Textura Aroma/gusto Apreciaración ción general -A- Gránulos quebra- Caseína, Amar- (-) dizos, Ligera- go, Gusto ligeramente espesa mente rancio -B- Espesa Untuosa Insípido (+) -C- Espesa Aroma de (+++) yoghourt tipo Gusto fresco -D- Muy espesa Untuosa Gusto cremoso (+++) La preparación D presenta una población elevada en L. paracasei subsp. paracasei, una estabilidad muy buena a lo largo del tiempo, una textura untuosa y excelentes propiedades organolépticas. Ejemplo 2 Influencia de las preparaciones de leche fermentada de acuerdo con la invención sobre la duración de la diarrea Las preparaciones utilizadas son las siguientes: - Preparación Yoghourt se trata de la preparación B obtenida, tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, a partir de un fermento de yoghourt de acuerdo con la invención. - Preparación B.C. : se trata de la preparación D obtenida, tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, a partir del fermento láctico de acuerdo con la invención. - Preparación Leche : se trata de leche gelificada, no fermentada, en la que la composición es la siguiente: - Sacarosa 6 g -Guar 0,6g - Carragenano 0,1 g - Leche entera CSP 0 ml Esta preparación se trata a 1 C durante algunos segundos. El estudio se realiza sobre una población de 26 niños en guardería. Los niños se reparten en 3 grupos por aleatorización y consumen regularmente 12 g (niños de 6 a 18 meses), o g (niños de más de 18 meses), bien de la preparación leche, bien de la preparación Yoghourt, bien de la preparación B.C., durante 3 periodos sucesivos de 1 mes, entrecortados por periodos sin suplemento de 1 mes. El ensayo se ha realizado en doble ciego.

5 7 ES T3 8 El análisis se ha realizado en la población de niños que han presentado al menos un episodio diarréico (n = 62) durante el curso del período de observación (6 meses). La duración de la diarrea se define como el tiempo transcurrido entre la aparición de la diarrea (3 heces liquidas por día) y la desaparición de las heces líquidas. Más particularmente, ésta representa el número de días después de la aparición del episodio diarréico, durante los que el niño presenta todavía al menos una hez liquida. Los resultados se representan en la Tabla II a continuación. TABLA II Producto Número de Número de días niños con diarrea Leche 3,8 ± 1,8 Yoghourt 24 3,1 ± 1,7 B.C. 18 2,9 ± 2,6 Total 62 3,3 ± 2,0 Estos resultados muestran que, en los niños que presentan diarrea, el suplemento de alimentación con la preparación Yoghourt o la preparación B.C. reduce el número de días con diarrea en relación con la preparación Leche. Esta reducción es del 18 % en el caso de la preparación Yoghourt, y del 24 % en el caso de la preparación B.C.. Ejemplo 3 Influencia de las diferentes preparaciones sobre la duración de la normalización de las heces El análisis se realiza sobre la misma población de niños (n= 62) que en el ejemplo 2. La duración de la normalización de las heces es el tiempo transcurrido entre las últimas heces liquidas y el retorno a las heces moldeadas. Mas particularmente, ésta representa la duración requerida para una vuelta a un tránsito normal. Los resultados se representan en la Tabla III a continuación. TABLA III Producto Número de Número de días niños antes de la normalización Leche 2,6 ± 2,4 Yoghourt 24 2,0 ± 1,6 B.C. 18 1,2 ± 1,0 Total 62 1,9 ± 1,8 Estos resultados muestran que en los niños que han presentado diarrea, el suplemento con la preparación B.C., reduce significativamente el tiempo de normalización de las heces en relación con la preparación Leche ; la reducción observada es del 4 %. El tiempo de normalización de las heces es más rápido con la preparación B.C. (1,2 ± 1,0) que con la preparación Yoghourt (2,0 ± 1,6). Ejemplo 4 Influencia de las diferentes preparaciones sobre la duración total del episodio diarréico El análisis se realiza sobre la misma población de niños (n= 62) que en el Ejemplo 2. La duración total del episodio diarréico es el tiempo transcurrido entre el inicio de la diarrea (> de tres heces líquidas por día) y el fin del período de normalización (vuelta a las heces moldeadas). Si un niño presenta más de un episodio diarréico, este análisis tiene en cuenta el episodio donde el plazo calculado sea más grande. Los resultados se muestran en la Tabla IV a continuación TABLA IV Producto Número de Duración total niños del episodio diarréico (días) Leche 6,9 ± 3,0 Yoghourt 24 4,8 ± 2,3 B.C. 18 3,9 ± 2,4 Total 62,2 ± 2,8 Estos resultados muestran que en los niños que han presentado diarrea, el suplemento de alimentación con la preparación B.C reduce significativamente la duración total del episodio diarréico; la duración observada es del 44 % en relación con la preparación Leche, y del 19 % en relación con la preparación Yoghourt. La duración total del episodio diarréico es más corta con la preparación B.C. (3,9 ± 2,4) que con la preparación Yoghourt (4,8 ± 2,3). Ejemplo Influencia de las diferentes preparaciones sobre el número total de días en los que los niños presentanuntránsito intestinal perturbado El análisis se realiza sobre la misma población de niños (n= 62) que en el Ejemplo 2. El número total de días en los que los niños presentan un tránsito intestinal perturbado se calcula sumando el número de días en los que los niños presentan una o varias heces anormales en consistencia o con frecuencia. Cuando el niño ha presentado varios episodios diarréicos, el análisis tiene en cuenta el conjunto de estos episodios. Los resultados se representan en la Tabla V a continuación. TABLA V Producto Número de Perturbación del niños tránsito intestinal (días) Leche 8,0 ±,3 Yoghourt 24,3 ± 2, B.C. 18 4,3 ± 2,7 Total 62,9 ± 3,9 Estos resultados muestran que en los niños que han presentado diarreas, el suplemento de alimentación con la preparación B.C. reduce significativamente el número total de días en los que el tránsito intestinal del niño está perturbado en relación con la preparación Leche ; la reducción observada es del 46 %. El número de días con heces anormales en consistencia o con frecuencia es

6 9 ES T3 más bajo con la preparación B.C. (4,3 ± 2,7), que con la preparación Yoghourt (,3 ± 2,). Conclusión: Las preparaciones de acuerdo con la invención permiten por tanto reducir la duración total del episodio diarréico, disminuyendo la duración durante la cual el niño presenta una o varias he- ces líquidas por día y disminuyendo la duración durante la cual el niño presenta heces blandas. La propiedad anti-diarréica se traduce igualmente por una disminución del número de días durante los que el niño presenta heces de consistencia o de frecuencia anormales

7 11 ES T3 12 REIVINDICACIONES 1. Fermento láctico, caracterizado porque se trata de un fermento del yoghourt constituido por una mezcla de tres bacterias lácticas Streptococcus thermophilus DN , Streptococcus thermophilus DN , y Lactobacillus bulgaricus DN Fermento láctico caracterizado porque comprende el fermento del yoghourt según la reivindicación 1, y comprende además una u otras especies de bacterias lácticas. 3. Fermento láctico según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una mezcla de bacterias lácticas Streptococcus thermophilus DN , Streptococcus thermophilus DN , Lactobacillus bulgaricus DN y Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DN Procedimiento de preparación de un pro- 1 ducto lácteo fermentado, dicho procedimiento se caracteriza porque comprende el uso de un fermento láctico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.. Preparación de leche fermentada, caracterizada porque es susceptible de obtenerse por el procedimiento según la reivindicación Fermento láctico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la utilización como anti-diarréico. 7. Preparación de leche fermentada según la reivindicación, para la utilización como antidiarréico. 8. Cepa de bacterias lácticas elegida entre el grupo constituido por la cepa de Streptococcus thermophilus DN , la cepa de Streptococcus thermophilus DN , la cepa de Lactobacillus bulgaricus DN-0 182, y la cepa de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DN NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 7