Replicación del DNA. Síntesis de DNA

Transcripción

1 Replicación del DNA Síntesis de DNA 1

2 Replicación del DNA Requerimientos DNA polimerasas Molde de DNA simple cadena Iniciador (primer) apareado al molde con extremo 3 OH libre. Síntesis de 5 a 3 Problemas para replicar DNA dc Separación de las cadenas Síntesis simultánea de ambas cadenas Primer 2

3 Inicio Síntesis Distintas estrategias de generar extremos 3 OH para iniciar la síntesis del DNA 3

4 Separación de cadenas Replicación por Desplazamiento de cadena y círculo rodante 4

5 Separación de cadenas Replicación bidireccional 5

6 Mecanismo de replicación Horquilla de replicación 6

7 Etapas de la Replicación Iniciación Reconocimiento del sitio de inicio de replicación Elongación Terminación 7

8 Elongación Replicación continua en cadena líder ( leader strand ) Replicación discontinua en cadena retrasada ( lagging strand ) Síntesis de primer Cadena líder único primer Cadena retrasada múltiples primers Fragmentos de Okazaki:» nt(bacterias)» 200nt (eucariotas) 8

9 DNA polimerasas E.coli DNA polimerasa I (pola) Único polipéptido Actividades: 5 3 polimerasa 3 5 exonucleasa 5 3 exonucleasa Fragmento Klenow 9

10 DNA polimerasa I Actividad Polimerasa 5 3 Actividad exonucleasa

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12 DNA polimerasa III Holoenzima: múltiples subunidades (900kDa) Altamente procesiva Actividades 5 3 polimerasa (subunidad α) 3 5 exonucleasa (subunidad ε) 12

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14 pb/ min (40min tiempo requerido para síntesis de todo el genoma) 14

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16 Replicación coordinada de ambas cadenas en procariotas 16

17 Replicación coordinada de ambas cadenas en procariotas 17

18 DNA polimerasas implicadas en replicación Exonuclease activities Enzyme Subunits Function Bacterial DNA polymerases DNA 1 Yes Yes DNA repair, replication polymerase I DNA At least Yes No Main replicating enzyme polymerase III 10 Eukaryotic DNA polymerases DNA 4 No No Priming during replication polymerase α DNA 2 Yes No Mitochondrial DNA replication polymerase γ DNA polymerase δ 2 or 3 Yes No Main replicative enzyme DNA polymerase ε At least 1 Yes No Required for detection of DNA damage during genome replication (Section ) DNA polymerase κ 1 or 2??? Required for attachment of cohesin proteins which hold sister chromatids together until the anaphase stage of nuclear division (Section ) Bacteria and eukaryotes possess other DNA polymerases involved primarily in repair of damaged DNA. These enzymes include DNA polymerases II, IV and V of Escherichia coli and the eukaryotic DNA polymerases β, ζ, η, θ and ι. 18

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20 Elongación Procariotas Primosoma helicasa + primasa SSB DNA pol III DNA pol I Ligasa Girasa Eucariotas Primosoma helicasa + primasa + DNApol α RPA DNA pol δ DNA pol ε RCF PCNA RNasaH / FEN 1 endon. Ligasa Girasa 20

21 Síntesis de primer Bacterias Primasa : 415nt Eucariotas Primasa: 812nt DNA pol α: 20nt 21

22 Remoción de primer y unión de fragmentos en Procariotas 22

23 Remoción de primer y unión de fragmentos en Eucariotas 23

24 Mantenimiento de los extremos de los cromosomas TELOMERASA: ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa reversa) 24

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26 Mantenimiento de los extremos de los cromosomas Drosophila Repeticiones en tandem de secuencias de 6 a 10kb Copias completas de retrotransposones (tipo LINES1) HetA TART (RT) 26

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28 ADN polimerasas en Técnicas de ADN recombinante Rellenado de extremos simple cadena de ADN (extremos 5 protruyentes) o digestión de extremo 3 protruyente) Síntesis de sondas de ADN PCR Secuenciación de ADN Síntesis de ADN copia de ARNm Mutagénesis dirigida 28

29 ADN polimerasas 3'>5' Proofreading Strand Displacement Primary Applications Mesophilic DNA Polymerases T4 DNA Polymerase ++++ Polishing Ends, 2nd Strand Synthesis DNA Polymerase I ++ Nick Translation DNA Polymerase I, Klenow Fragment Polishing Ends Klenow Fragment (3' > 5' exo) ++ Labeling T7 DNA Polymerase ++++ Site Directed Mutagenesis Thermophilic DNA Polymerases Phusion High Fidelity DNA Polymerase new PCR (high fidelity) DyNAzyme EXT DNA Polymerase new ++++ PCR (high fidelity, long) DyNAzyme II Hot Start DNA Polymerase new + PCR (hot start) Taq DNA Polymerase + PCR (routine), Primer Extension Vent R DNA Polymerase PCR (high fidelity), Primer Extension Vent R (exo) DNA Polymerase PCR, Sequencing Deep Vent R DNA Polymerase PCR (high fidelity), Primer Extension Deep Vent R (exo) DNA Polymerase PCR (long), Primer Extension Therminator DNA Polymerase + Chain Terminator Applications Other Polymerases MMuLV Reverse Transcriptase +++ cdna Synthesis 29

30 Propiedades de las DNA polimerasas Taq Vent R Vent R (exo) Deep Vent R Deep Vent R (exo) Klenow Frag exo Therminator T7 DNA E. coli Poly I Klenow Frag Poly. I MMulV Reverse Transcriptase T4 DNA 5' >3' Exonuclease + + 3' >5' Exonuclease Error Rate a (x10 6 ) 285 c 57 b 190 b 15 b 9 q 18 w 100 w <1 q Strand Displacement ++ g +++ g Nick Translation + + Thermal Stability Km dntps 13 µm g 60 µm g 40 µm g 50 µm g 18 µm s 12 µm h 2 µm k 18 µm p 2 µmu Km DNA d 2 nm g 0.1 nm g 0.1 nm g 0.01 nm g 18 nm s 5 nm h Extend RNA Primer y Extension From Nick

31 DNA polimerasas termoestables Vent Vent (exo) Deep Vent Deep Vent (exo) Taq 9 N m Phusion DyNAzyme EXT DyNAzymeII Hot Start Exonuclease Activities 3' >5' proofreading exonuclease yes no yes no no 15% yes yes no 5' >3' exonuclease activity no no no no yes no no yes yes Thermal Stability Half life at 95 C 6.7 hours 6.7 hours 23 hours 23 hours 0.9 hours 6.7 hours >6hours at 96 C 3.5 hours at 96 C 0.9 hours Half life at 100 C 1.8 hours 1.8 hours 8 hours 8 hours <0.1 hours 1.8 hours 2 hours at 98 C <0.1 hours Primer Extension Characteristics Units/100 µl Primer Extension Rxn 12 units 24 units 12 units 24 units 25 units 12 units 12 units 14 units 14 units Error Rate (x10 6 base insertions) ~20 ~ in prograss.44 Resulting DNA Ends blunt ends 3 A blunt ends 3 A 3 A 3 A blunt blunt 3 A blunt 3 A Strand Displacement yes; temp. dependent yes; temp. dependent yes; temp. dependent yes; temp. dependent no yes no yes; temp. dependent no Longest Primer Extension to Date 13.2 kb 15.0 kb 14.0 kb 15.0 kb 8.1 kb 14.0 kb 37 kb 40 kb 3 kb 31

32 Método enzimático de secuenciación (Sanger 1978) Base del método: Capacidad de las ADN polimerasas de utilizar 2 3 ddntp como sustrato además de los nucleótidos dntp normales. La incorporación de un ddntp en la cadena sintetizada produce un stop en la elongación 32

33 Molde de ADN simple cadena Primer específico ADN polimerasa apta para secuenciación Reacciones de elongación separadas para cada ddntp Proporción de dntp/ ddntp adecuada para permitir la síntesis de una colección de fragmentos que termine en cada nucleótido del ADN a secuenciar Marca radioactiva, quimio luminiscente o fluorescente en primers o dntp para visualizar los fragmentos sintetizados Separación de la colección de fragmentos en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (permite detectar diferencias de 1 nucleótido en fragmentos de ADN) 33

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36 Secuenciación Automática 36

37 Secuenciación automática de DNA 37

38 Secuenciación Automática 38

39 ADN Polimerasas usadas en secuenciación Klenow T7 DNA polimerasa modificada (Sequenase) Alta procesividad (componente tioredoxina) Eficiente uso de ddntp Eliminación de actividad exonucleasa 3 5 Polimerasas Termoestables Requieren menor cantidad de molde a secuenciar 39

40 Etapas de la Replicación Iniciación Reconocimiento del sitio de inicio de replicación Elongación Terminación 40

41 Bacteria Iniciación Único origen de replicación E.coli oric 245pb 2 motivos repetidos: 9nt 5 copias (unión de DnaA) 13nt 3 copias (ricos en AT) Eucariotas Múltiples orígenes de replicación Levaduras 300 ori Humanos ori 41

42 Iniciación de la replicación en E.coli ori C 42

43 S.cerevisiae Origen de replicación en eucariotas ARSs pb Subdominios ACS y B1 unión de ORC Subdominio B3 unión de ABF 1 Subdominio B2 apertura de cadenas S.pombe pb Muchos elementos que contribuyen parcialmente (secuencias AT asimétricas) Metazoos > 1000pb 43

44 Iniciación de la replicación en S.cerevisiae ARS 44

45 Características de los orígenes de replicación en eucariotas multicelulares (Metazoa) Orígenes de replicación variados en tamaño y complejidad Regulación del número y localización de orígenes de replicación durante el desarrollo (regulación epigenética del uso de ori) Localización de ori regulada por : Estructura de la cromatina Modificación del DNA Transcripción 45

46 Proteínas de unión al ori en eucariotas Formación del prerc ORC (complejo de reconocimiento del origen) Complejo de 6 proteínas orc1 6 Mediador entre ori y señales regulatorias que coordinan replicación con ciclo celular Cdc6p (unión a ORC) Cdt1p (unión a Cdc6p) Complejo MCM (unión a ambos lados de sitios ORC/cromatina) 46

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48 Regulación de la Replicación Bacterias Hemimetilación de sitios GATC en ori (11 sitios GATC en ori) 48

49 Eucariotas Coordinación de replicación con ciclo celular Kinasas fase S inhibición de formación de prerc Activación de prerc Geminin inhibición de formación de prerc (ensamblado de MCM) 49

50 Regulación de los orígenes de replicación 50

51 Etapas de la Replicación Iniciación Reconocimiento del sitio de inicio de replicación Elongación Terminación 51

52 Terminación en Bacterias E.coli 52

53 Replicación de ADN extracromosomal: Mitocondria The EMBO Journal (2001) 20, , doi: /emboj/

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55 Replicación del genoma de mitocondrias No hay mecanismos para asegurar la replicación de todos los genomas. El DNA mitocondrial replica incrementando el número de genomas en forma proporcional a la masa mitocondrial. 55

56 Plásmidos Regulación del número de copias Plásmidos relajados Alto número de copias Inhiben la replicación cuando se alcanza un cierto número de copias Plásmidos no relajados ( stringent ) Mecanismo preciso de regulación Col E1 RNA Plásmido R RNA + proteína Plásmido F Iterones 56

57 Regulación por RNA Col E1 57

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59 Regulación por RNA + proteína Plásmido R 59

60 Regulación por Iterones Plásmido F 60

61 Transferencia horizontal de información genética en bacterias 61

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63 Transferencia del cromosoma bacteriano 63