Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann

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1 Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann Facultad de Ciencias EFECTO HIPOGLUCEMIANTE Y ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO ACUOSO DE Psidium guayaba (GUAYABA) EN RATAS DIABÉTICAS Blga. Soledad Bornás Acosta Tacna Perú 2003

2 Resumen El propósito del estudio fue investigar el efecto del extracto acuoso de Psidium guayaba (Guayaba), sobre la glucosa sanguínea. En éste estudio se utilizaron 20 ratas albinas (Rattus norvegicus), cuyos pesos fluctuaron entre 200g y 300g, los cuales se dividieron en cuatro grupos. En los grupos hiperglucémicos las ratas que recibieron una dosis única de estreptozotocina por vía intraperitoneal a una concentración de 60mg/Kg de peso disuelto en solución salina; incrementaron sus niveles sanguíneos de glucosa. La forma farmacéutica elegida fueron el extracto acuoso Psidium guayaba a una concentración de 0.5ml/200g de peso respectivamente administrada por vía oral. En estos grupos los extractos acuoso y metanólico a partir de la planta entera secada y pulverizada produjeron una disminución de los niveles de glucosa sanguínea. Al término de esta labor se desglosa que los preparados a partir de polvo seco de la planta entera de Psidium guayaba (guayaba) tiene un buen efecto en el modelo experimental y que esta materia prima por lo tanto es muy conveniente cuando se desee viabilizar farmacéuticamente la planta. 1. Planteamiento del Problema 1.1. Determinación del Problema El presente trabajo de investigación se halla limitado al estudio de la aplicación experimental de una planta que crece en Tacna conocida comúnmente por los pobladores de la zona como Tasa alternativa de terapéutica en el tratamiento de la Diabetes Mellitus. Dicho trabajo de investigación se llevó a cabo en ratas albinas previamente inducidas experimentalmente con diabetes. Se realizó en el transcurso de veinte días, en el laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann de la ciudad de Tacna. Se tomó un grupo control, uno con medicación farmacológica regular y otros grupos experimentales. Este problema esta generado porque la Diabetes es una enfermedad de variadas manifestaciones clínicas que afecta a la población; por lo tanto la profilaxis se fundamenta en el control adecuado del nivel de glucosa en sangre. Con este estudio se determinara si realmente la planta tiene efectividad sobre

3 la glucemia, lo cual servirá para conocer la efectividad y poder recomendar como un medicamento alternativo en el marco de la medicina tradicional Objetivo General El presente estudio tiene como objetivo general determinar la actividad hipoglucemiante del extracto acuoso de Psidium guayaba (Guayaba) en ratas diabéticas Objetivos específicos Obtener el extracto acuoso de Psidium guayaba (guayaba) Determinar los niveles de glucosa en sangre de ratas de grupos controles y tratadas Justificación del Problema Es de suma importancia tratar al paciente con una medicación adecuada, ya que de no hacerlo debidamente llevaría a provocar la muerte del mismo. Otro grupo de población aunque minoritario refiere no tolerar los múltiples efectos colaterales de la medicación actual, lo que les lleva al abandono al tratamiento y/o buscar otro tipo de medicación. Es por esto que el presente trabajo esta destinado a buscar una alternativa de solución optima y segura, teniendo en cuenta por su puesto los inconvenientes y contraindicaciones que esta experimentación pueda acarrear. El presente trabajo permitirá comprobar, la veracidad o falsedad de dichas propiedades medicinales, mediante una experimentación que se hará con animales (ratas albinas). Los resultados del presente trabajo permitirá un mayor conocimiento de las propiedades medicinales por parte de la población, y de los laboratorios; favoreciendo un mejor estudio y análisis intimo en el tratamiento de otras enfermedades, incluso, por que no imitando al Metformina o insulina como hipoglucemiante. 2. Marco teórico 2.1. Definición El término diabetes Mellitus describe un desorden metabólico de etiología múltiple caracterizado por una elevación persistente de los niveles de glucosa en sangre (hiperglucemia) junto ha alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos, grasas y proteínas que ocurren como

4 consecuencia de alteraciones de la secreción y/o en la acción dela insulina (1) Clasificación I. Diabetes tipo 1. Destrucción de las células beta, que conduce a déficit de producción de insulina. a. Mediada inmunológicamente. b. Idiopática. II. Diabetes tipo 2. Puede ir desde resistencia a la insulina, principalmente con déficit relativo de la hormona hasta un defecto secretor predominante con resistencia a la misma. III. Otros tipos específicos: a. Por defectos genéticos del funcionamiento de la célula beta. b. Por defectos genéticos en la acción insulínica. c. Por enfermedad del páncreas exocrino. d. Debida a enfermedades endocrinas. e. Inducida por químicos o medicamentos. f. Debida a infecciones. g. Debida a otros desórdenes genéticos asociados algunas veces con diabetes. IV. Diabetes gestacional Diabetes Mellitus tipo 1 La diabetes 1 es una enfermedad incurable, devastadora por sus complicaciones locales y sistémicas que no tienen tratamiento electivo hasta el presente, sino el riguroso control, mediante múltiples dosis diarias de insulina o bombas de infusión, no sin riesgos, que detienen el progreso de las lesiones vasculares y neurológicas Se considera un proceso órgano específico en el cual las células se destruyen, por mecanismos mediados por autoanticuerpos y por productos de células T, auto reactivas que desencadenan inflamación y alteraciones anatómicas y funcionales en el órgano afectado. Así mismo, debe cumplir con los criterios para definir a una enfermedad auto inmune que son: 1. Ser transferible por anticuerpos o células T del paciente. 2. Su curso debe demorarse o prevenirse mediante irimunosupresores. 3. Estar asociada a signos de autoinmunidad humoral o

5 mediada por la célula, dirigidas contra el órgano blanco. 4. La enfermedad debe ser experimentalmente inducida por sensibilización contra un antígeno presente en el órgano blanco. Tiene como base una falla central y periférica en la tolerancia de la células a moléculas específicas como ocurre en diversos procesos autoinmunes, en que hay sobreproducción de citoquinas, en el caso de la diabetes el interferon (IFN), el factor de necrosis tumoral (TNF-), cuya fuente son los macrófagos y las células dendrítícas localizados en el infiltrado del islote, y la interleuquina IL- también elaborada por la célula presentadora del antígeno (APC) Además hay un desequilibrio en la respuesta inmune, entre los linfocitos Th1/Th-2 presentes en el momento de la insulitis (3) Diabetes Mellitus tipo 2 En la diabetes tipo 2, el trastorno central es la resistencia de todos los tejidos periféricos a la acción de la insulina, debido a que se produce una hormona defectuosa porque existen trastornos del receptor o lo que es más importante, a la presencia de alteraciones en los mecanismos intracelulares desencadenados por la unión de la hormona al receptor. Al respecto, se ha demostrado la deficiencia en la actividad, en modelos animales y humanos, de la enzima tirosina cinasa, encargada de la fosforilacíón de la proteína IRS-1 (lnsulin Receptor Substrate 1) y la hipoactividad de la enzima cinasa 3 - fosfatidil inositol. La diabetes tipo 2 comprende entre 85 y 90% de los diabéticos. Por lo general se trata de pacientes mayores de 40 años, obesos, en quienes la enfermedad se desarrolla paulatinamente y su expresión clínica puede pasar desapercibida por años. En algunos de estos sujetos, se presenta rápidamente un importante déficit en la producción de insulina, y el paciente debe recibir la hormona para obtener control metabólico. Sin embargo, esta forma de tratamiento no hace al individuo insulino dependiente (3) Tratamiento Objetivo general, un equilibrio entre la ingesta de comida y el gasto energético del paciente. Ejercicio físico: Mejora el perfil lipídico, disminuye la presión arterial, reduce el riesgo vascular y el peso. Tratamiento farmacológico: Sulfonilureas; con actividad sobre células B, con efecto hipoglucemiante crónico.

6 Biguanidas; acción extrapancreática, disminuye la absorción de glucosa, disminuye la liberación hepática de glucosa, reduce el perfil lipídico. Inhibidores de alfaglucosidasas intestinales; disminuye la absorción de glucosa, actúa de forma competitiva y reversible. Dieta: La fibra mejora el perfil lipídico, reduce las VLDL y LDL, la sal deberá limitarse a 3g/día en sujetos con hipertensión, la ingesta moderada de alcohol junto a las comidas no suele causar problemas. Insulina: La secreción basal regula la secreción hepática de glucosa y la secreción como consecuencia de las comidas incrementa la receptación de la misma. Disminuye los niveles de TG, VLDL y LDL-colesterol, se asocia con ganancia de peso, desventaja en pacientes obesos. El requerimiento de insulina puede variar dependiendo del tipo de diabetes, del tiempo de evolución y del grado de resistencia de la insulina, etc Hipótesis El extracto acuoso Psidium guayaba (Guayaba) produce disminución de los niveles de glucosa en sangre de ratas diabéticas. 3. Materiales y Métodos 3.1. Material Biológico Esta constituida por ratas albinas (Rattus norvegicus) de la variedad Ways. Considerándose para éste veinte animales de experimentación, la selección se hace por muestreo aleatorio, ya que se escogerá a los que cumplan con los criterios de interés para el experimento, se divide al azar en cuatros grupos de cinco individuos. Un grupo para el control normal y los demás grupos de experimentación Recolección y Manejo de las Muestras de Sangre Para la toma de muestra se utiliza la técnica de punción en la membrana anterior del ojo tras un ayuno del animal de 12 a 14 horas, la sangre es recibida en tubos eppendorf sin anticoagulante y tomando todas las precauciones del caso para evitar interferencia en los resultados de las pruebas de laboratorio. Para tal efecto se utilizan capilares de vidrio, obteniéndose 1cc. de sangre de cada animal, cantidad suficiente para la medición del perfil glucémico, concentración de oxido nítrico y peroxidación de lípidos. La sangre es mantenida en baño maría a 37 C por 40 minutos, y el suero fue obtenido por centrifugación a 4500 r.p.m. por 15.

7 3.3. Obtención del extracto acuoso Se procede a pesar 25g de la planta en estudio, previamente se ha pulverizado y pesado en balanza analítica, luego se procede a hervir agua destilada (100ml), esperando que la temperatura del agua después de hervida alcance los 80 C y luego se procede ha agregar la planta pulverizada, esperando 10 minutos, para luego llevar a secado aproximadamente a 40 C, por horas. Obtenido el extracto seco, almacenarlo en lugar seco. Para obtener el extracto acuoso en solución, disolver 0.2g de extracto acuoso seco y disolverlo en 50ml de solución salina fisiológica, se almacena en frascos de vidrio Obtención de la Solución de Fármaco Disolver una pastilla de Hipoglucin de 850mg en 10ml de agua destilada dejando por una noche; al día siguiente centrifugar y recuperar el sobrenadante y hacer una dilución 1:9. La administración oral es de 300ul/200g de peso del animal Medición Enzimática de Glucosa. (Wiener Lab. 2001) La patología más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es la Diabetes Mellitus. El diagnóstico precoz y el control de los pacientes diabéticos, tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los síntomas resultantes de la hiperglucemia, mediante el tratamiento adecuado. Dado que existen múltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse en cada caso la condición fisiológica y/o la patología presente en el paciente en cuestión. El esquema de reacción es el siguiente: Glucosa + O 2 + H 2 O GOD Ácido glucónico + H 2 O 2 2 H 2 O AF + fenol POD quinona coloreada + 4 H 2 O a). Material requerido Sangre Espectrofotómetro o fotocolorímetro. Material volumétrico adecuado. Tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas. Baño de agua a 37 C.

8 b). Procedimiento Una vez obtenido el suero, se colocan 0.02ml de muestra en un tubo eppendorf, a continuación se adiciona 1ml de reactivo de trabajo e incubar a 37 C durante 15 minutos. Pasado este tiempo se lee la absorbancia en un espectrofotometro a 505nm. Para cada experimento se preparan un tubo conteniendo 0.02ml de estándar más 1ml de reactivo de trabajo y otro solo conteniendo 1ml de reactivo de trabajo que servirá para calibrar el equipo. c). Estabilidad de la mezcla de reacción final El color de reacción final es estable 1 hora, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso. d). Cálculo de los resultados Glucosa g/l = D x f 1,00 g/l Donde f = S 3.6 Medición de la peroxidación de lípidos (Esterbauer H. y col. 1990) La peroxidación de lípidos es un mecanismo adecuado para medir el daño celular. Este proceso se inicia con la destrucción de lípidos de membrana y la producción de peróxidos de los mismos y culmina con la formación de subproductos tales como malonaldehido (MDA) y 4-hidroxi- 2-() nonenal (4-HNE) que se forma por la ruptura de los ácidos grasos poliinsaturados. Nosotros mediremos la formación de MDA como índice de peroxidación lipídica. Esta técnica basada en la reacción del reactivo cromogénico, N-metil-2- fenilindol (R1), con MDA y 4- hidroxialquenoles a 45 C. Una molécula MDA o cromóforo estable con una absorbancia máxima a 586 nm. a) Materiales: R1: N-metil-2-fenilindol en acetonitrilo 10,3 mm R2: ácido metanosulfónico 10,4 M S1: Solución de 4-hidroxinonenal 10 mm como el dietilacetal, en acetonitrilo. S2: Solución de 1, 1, 3,3- tetrametoxipropano 10 mm en buffer Tris-HCl 20 mm, ph 7,4 Suero de rata Tubos eppendorf. b) Procedimiento:

9 Una vez obtenido el suero, tomar 200 l de éste, adicionar 650 l de R1 diluido (6 ml de metanol al 100% con 18 ml de R1), mezclar ligeramente y agregar 150 l de R2; agitar. Incubar a 45 C durante una hora dejar enfriar a 4 C durante 5 minutos, centrifugar a rpm durante 5 minutos, recuperar el sobrenadante y leer la absorbancia a 586 nm. c) Curva de calibración de malonildialdehido (MDA) Las soluciones S1 y S2 para preparar la curva estándar de MDA. Diluir S1 y S2 en 100 (v/v) en algún buffer como el usado para diluir la muestra o con agua. Esto resulta una concentración de 100 M. La solución estándar es usada mejor en fresco. Diluir la cantidad requerida para cada experimento. Tabla 01: Curva de calibración de peroxidación de lípidos Componente Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 S2-MDA 0,0 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 (final) R1l S2l H 2 O R3l [Final M] Abs. 586nm. 0,00 0,176 0,351 0,705 1,152 1,350 d) Hallamos el coeficiente de regresión lineal ( r ): a = 7,73332x10-3 b = 0,07024 r = 0, e) Donde: Y = a + bx [X] = Concentración (M) Y =Absorbancia (muestra)

10 [ X ] = Abs 7,73332x10 0, Medición de óxido nítrico (Schmidt H. et al. 1995) Los niveles de óxido nítrico en suero de las ratas se medirán mediante una técnica cuyo fundamento es la transformación del óxido nítrico (NO) y nitratos a nitritos mediante un ensayo por colorimetría. a) Materiales Solución A: N-(1-naftil) etilamina dihidroclorida 1% Solución B: sulfanilamida 10 % en HCl 1 N. Sulfato de zinc 30% Cadmio en pastillas Nitrito de sodio Hidróxido de amonio Ácido clorhídrico b) Procedimiento Luego de recuperar el suero se procede a precipitar proteínas con sulfato de zinc, según el método estándar. Cada muestra (10-50 ul) es ajustada a 190 ul con agua y entonces a 10 ul se le adiciona el ZnSO 4 al 30% (p/v) en solución, se mezcla e incuba a temperatura ambiente por 15 minutos; luego se centrifuga a rpm durante cinco minutos, el sobrenadante es transferido a tubos de ensayos que contienen una pastilla de cadmio granulado (0,5g) y se incuban a temperatura ambiente durante toda la noche con agitación; centrifugar y usar el sobrenadante para el ensayo de nitritos. Los nitritos se miden por el método de Greiss. A 50 ul de suero adicionar 850 ul de agua destilada y 100 ul de la mezcla 1:1 de las soluciones A y B del reactivo de Greiss (solución A: N-(1-naftil) etilamina dihidroclorida 1 %; solución B: sulfonilamida 10 % en HCl 1 N). Agitar suavemente y leer la absorbancia a 540 nm. La curva de calibración se realizó utilizando una solución estándar de NaNO 2 (nitrito de sodio 500 um). Para recuperar las pastillas de cadmio, éstas son lavadas dos veces con 1 ml de agua destilada, HCl 0,1 M y NH 4 OH 0,1 M (ph 9,6). c) Curva de calibración estándar de nitritos A partir de una solución patrón de nitrito de sodio 500 um tomar 75 ul de NaNO 3 y diluir en 5 ml de agua destilada, lo

11 que da una solución 7,5 um, a partir de ella se preparó por duplicado la siguiente batería de tubos: Tabla 02: Curva de calibración de nitritos Componente Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 NaNO 2 0, ,5uM (ul) H 2 O (ul) Reactiv Grees (ul) Volumen final [final M] 0,0 0,015 0,075 0,150 0,300 0,600 Absorb. A 540nm. 0,00 0,013 0,213 0,416 0,821 1,631 d) Hallamos el coeficiente de regresión lineal ( r) a = 0, b = 0, r = 0, e) Donde: Y = a + bx [X] = Concentración (M) Y =Absorbancia (muestra) 0, [ X ] = Abs 0, Resultados En el modelo de ratas hiperglucémicas se incrementaron significativamente la concentración de glucosa sérica, en el modelo experimental paralelamente al grupo de los controles que recibieron una alimentación balanceada para de esta manera evitar una dispersión en los datos, una vez estabilizados los grupos con la alimentación y tener valores de

12 glucosa aceptables para dar inicio al tratamiento con dosis de extracto acuoso de 0.5ml/200g de peso corporal, con la finalidad de observar la influencia de estos extractos sobre la concentración de glucosa sanguínea. En la figura se presentan los resultados obtenidos. Glucosa mg/dl Dias cn cd cf ac Figura 01: Los datos que se muestran en el panel corresponden a la media de los valores obtenidos con el tratamiento (cn = control normal; cd = control diabético; ac = extra. acuoso). El panel muestra la tendencia de las medias, observándose que el extracto acuoso gráficamente muestra una disminución de los niveles de glucosa en mayor proporción hacia la cuarta muestra correspondiente al doceavo día del tratamiento. Sin embargo el extracto presentan un comportamiento similar al fármaco con tendencia reducir los niveles de glucosa hasta los seis días de tratamiento. MDA (um/ml) CCNN CCDD AC Tratamiento

13 Fig. 02: Efecto del extracto acuoso sobre los niveles de peroxidación de lípidos en sangre de ratas diabéticas. A los doce días se midieron los valores de MDA según el procedimiento descrito en materiales y métodos. El gráfico muestra el efecto del extracto acuoso de Psidium guayaba sobre los niveles de peroxidación lipídica. Se observa que en el grupo control diabético los niveles de MDA corresponden a um/ml, y los valores con el extracto alcanzan el um/ml lo que supone un beneficio importante contra el estrés oxidativo. Nitritos (um/ml) CCNN CCDD AC Tratamiento Fig. 03: Efecto del extracto acuoso sobre los niveles de oxido nítrico en sangre de ratas diabéticas los puntos muestran la media con su respectivo error estándar. Los datos fueron tomados a los doce días del tratamiento. Como se explico en el marco teórico el oxido nitrico es un factor importante en la prevención de la hipetensión arterial. El gráfico muestra que el extracto acuoso actúa incrementando la producción de nitritos en sangre de ratas diabéticas hasta alcanzar valores de 17.61uM/ml, comparado con un control diabético de um/ml, mostrando diferencia estadística importante a fin de un buen uso de la planta en estudio.

14 5. Discusión La patología más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es la Diabetes Mellitus. El diagnostico precoz y control de los individuos diabéticos, tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los síntomas resultantes de hiperglicemia como son las neuropatía diabética, hipertensión arterial, ceguera. Se observó un elevado incremento de la concentración de glucosa en plasma de individuos (ratas) diabéticas comparado con los controles. (Kanets H. Y col. 1995) Durante la investigación experimental la administración de 0.5ml/200g de peso y de extracto acuoso a ratas hiperglucémicas producen efectos similares al fármaco utilizado sobre la disminución de glucosa en sangre entre sí y con respecto al grupo diabético. En comparación con los valores obtenidos con el tratamiento con el fármaco, estos muestran una marcada disminución de los niveles de glucosa sanguínea, los tratamientos con los extractos acuosos muestran una similitud con el fármaco, hasta el sexto día de tratamiento; a partir del doceavo día de tratamiento alcanza valores de glucosa en sangre disminuidos hasta el final de la experimentación, este cambio en los niveles de glucosa suponemos que es una respuesta de inmunomodulación por parte del metabolismo del espécimen en estudio, ofreciendo una resistencia al metabolito presente en el extracto, aún no definido. Los niveles de MDA (Malonildialdehido) se incrementan cuando las ratas son diabéticas, estos reportes coinciden con estudios realizados que indican que la hiperglucemia incrementa la producción de radicales libres de oxigeno entre ellos el anión superoxido, y que este disminuye la disponibilidadn de oxido nitricoproducida por el endotelio (Kakkar R. 1995)

15 6. Conclusiones 1. En el modelo de estudio induciendo experimentalmente la hiperglucémia, el extracto acuoso de Psidium guayaba (Guayabaa) disminuye la hiperglucemia siendo favorable para un posible tratamiento en un futuro aplicandose a los humanos. 2. El extracto acuoso de la planta en estudio disminuye los valores de MDA e incrementa asimismo los niveles de oxido nitrico en sangre de ratas diabéticas. 3. El polvo seco de la planta entera de Psidium guayaba (Guayabaa) mantiene las propiedades de la planta en fresco lo que constituye en materia prima para la elaboración de formas farmacéuticas más viables. 7. Bibliografía 1. CADIME. (1999) Diabetes Mellitus tipo 2: Tratamiento. Boletín Terapéutico Andaluz. Monografías. N Sanchez Medina M. Inmunopatogenesis de la Diabetes tipo 1. Academia Nacional de Medicina de Colombia. www. encolombia.com/medicina/ 3. De la Hoz J. Diabetes tipo 2. Hosp.. de san Juan de Dios. Santa Fe de Bogota-Colombia. www. encolombia.com/cirugia14399_vasculares18.htm 4. Ayiar MJ. Sanches Rivera A.N. (2001) Hipoglicemic effect of Smallantus sonchifolius (yacon) Leaves in normal and diabetic rats. Departamento de Biología del desarrollo. INSIBIO/CONICET. J Ethnopharmacol 2001 Feb;74 (2): Kakkar, R.; Kalra, J.; Mantha, S.V.; Prasad, K. (1995): Lipid peroxidation and activity of antioxidant encimes in diabetic rats. Department of Pathology, College of Medicine, University of Saskatchewan. Mol Cell Biochem N 151 (2)