Aislamiento y Detección de la Actividad Antimicrobiana de Bacterias Ácido Lácticas (BAL) Aisladas de Quesos

Transcripción

1 Aislamiento y Detección de la Actividad Antimicrobiana de Bacterias Ácido Lácticas (BAL) Aisladas de Quesos Socorro Ramírez, Eva Ma. Santos, Armida Zúñiga, Alma Delia Román, Marineth Ortiz, Maribel Clavel, Aide Neria e Irais Sánchez Centro de Investigaciones Químicas,Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo Carr. Pachuca-Tulancingo, Km 4.5 Pachuca, Hgo. Tel ext Fax: ext iraiss@uaeh.edu.mx Resumen En el presente trabajo, se evaluó la presencia de bacterias ácido-lácticas (BAL) productoras de bacteriocinas en 33 muestras de quesos elaborados artesanalmente en el Estado de Hidalgo a través del método del botón, obteniendo así más de 300 cepas. El espectro de actividad de estas cepas fue evaluado tanto frente a bacterias Gram positivas como contra Gram negativas. Las BAL fueron capaces de inhibir el crecimiento de varios de los patógenos probados, siendo las cepas de Vibrio cholerae las más sensibles, mientras que Escherichia coli, Bacillus Citrobacter y Proteus fueron las más resistentes, y destacando así mismo la inhibición contra Listeria monocytogenes. La actividad antimicrobiana de los compuestos producidos por las bacterias ácido lácticas (BAL) aisladas podrían utilizarse como un conservador potencial para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas y deterioradoras de alimentos, aunque para esto es necesario la realización de más estudios para caracterizarlas debidamente. Abstract A total of 300 lactic acid bacteria strains isolated from traditional made cheeses from Hidalgo State were evaluated for the presence of bacteriocin-producing lactic acid bacteria by de spot on the lawn assay. Some of them were able to inhibit the growth of various pathogens. The inhibitory spectra of activity of these isolates were evaluated against Grampositive and Gram-negative bacteria. Vibrio cholerae strains was the most sensitive strains tested, whereas Escherichia coli, Bacillus, Citrobacter y Proteus were the most resistant. Listeria monocytogenes was also inhibited by some LAB strains. The antimicrobial activity of the compounds produced by these LAB strains could be considered as a potential preservator to inhibit the growth of foodborne pathogens and spoilage bacteria in foods, although more studies are neccessary. 279

2 Introducción Las bacterias lácticas (BAL), son un grupo de bacterias Gram-positivas que tienen en común características morfológicas, metabólicas y fisiológicas (Axelsson, 1993). La fermentación de los alimentos por bacterias ácido lácticas (BAL) es una de las formas más antiguas de conservación usadas por el hombre. Incluidos en estos alimentos están el yogurt, muchas variedades de quesos, salsas, vegetales fermentados y productos de panadería. Quizá lo más significativo en estas fermentaciones es la conservación de alimentos perecederos resultante de la producción de ácido láctico y otros metabolitos tales como ácidos orgánicos, H 2 O 2, diacetilo y bacteriocinas (Farías y col., 1994). Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos son producidos por muchas especies bacterianas que han generado un gran interés en su investigación, debido principalmente a las características de antagonismo que han presentado estos contra microorganismos patógenos presentes en alimentos, a la demanda de los consumidores por la producción de alimentos menos procesados, y a la bioconservación, es decir, el uso de bacterias lácticas, sus productos metabólicos o ambos, para mejorar la seguridad y calidad de los alimentos que generalmente no son fermentados (Montville y Winkowski, 1997). En el presente trabajo, se propuso la integración de un banco de cepas de BAL con actividad bacteriocinogénica nativas de la región, que puedan utilizarse como cultivos iniciadores en la elaboración de productos lácteos y que adicionalmente disminuyan los riesgos de la presencia de patógenos o el deterioro en dichos productos. Material y Métodos Aislamiento. A partir de 33 muestras de diferentes tipos de quesos elaborados artesanalmente en diversos puntos del Estado de Hidalgo, se realizó el aislamiento de BAL. Para ello, se tomaron 10 g de cada producto, se colocaron en diluyente de peptona agitando manualmente hasta homogenizar la muestra y de esta se realizaron diluciones decimales, las cuales se distribuyeron en placas de agar MRS y se incubaron durante 72 h a 25ºC. Tras proceder al recuento de aquellas placas que presentaron entre 25 y 100 colonias, se seleccionaron diez cepas en base a su morfología, su reacción frente a la oxidasa (negativa), catalasa (negativa) y su comportamiento a la tinción de Gram (positiva). Posteriormente, se confirmó la pureza del cultivo por estría en agar MRS. Espectro de actividad. El espectro antibacteriano de las bacteriocinas producidas por las cepas aisladas se realizó en un medio sólido utilizando el método de botón (Lewus y col. 1991). Se obtuvo un cultivo puro de cada cepa en caldo MRS (de Man, Rogosa y Sharp) a 30 C durante 18h. Un tubo con 10 ml del medio MRS (0.8% agar) sin glucosa, se colocó en una caja de Petri, se dejo secar y se colocaron porciones (2 µl) del cultivo de cada cepa 280

3 pura. Las placas se incubaron a 30 C durante 18h. Posteriormente se colocaron 8 ml del mismo medio con 20 µl del microorganismo indicador ( ufc/ml). Las cajas se incubaron a la temperatura óptima de crecimiento de los indicadores durante 18h. El efecto antibacteriano se detectó por la presencia de halos de inhibición alrededor de botones. Se tomaron como positivas aquellas cepas en las que la zona de inhibición alrededor de los halos de inhibición fueron mayores de 1 mm. Resultados y Discusión Se analizó un total de 33 muestras de diversos tipos de quesos y prosteriormente al aislamiento, de cada una de ellas se tomaron 10 colonias. Se seleccionaron todas aquellas colonias que presentaban las características de crecimiento en medio sólido típicas de las BAL, además de ser cocos o bacilos Gram positivos, catalasa y oxidasa negativas, obteniendo así un total de 330 cepas (Tabla 1). De cada una de ellas, una vez purificadas se procedió a evaluar el espectro de inhibición por el método antes descrito contra cepas de bacterias patógenas tanto Gram positivas como Gram negativas (Tabla 2). De las cepas de BAL, solo 96 (26.09%) mostraron actividad inhibitoria en agar MRS contra al menos uno de los microorganismos probados. Como era de esperar, se obtuvo una mayor cantidad de BAL de aquellos productos en los cuales se utiliza un cultivo iniciador para su elaboración tales como el queso Oaxaca y el manchego, en contraste con aquellos productos en los que no se detectaron o se detectaron pocas cepas como el cotija o el ranchero. Esto pudo deberse a que algunos de los quesos no son adicionados de cultivos iniciadores, o bien a la concentración de sal contenida en estos productos (Tabla 3). De acuerdo al los resultados, Vibrio cholerae fue el microorganismo más sensible, ya que el % de las cepas de BAL analizadas lo inhibieron. Por el contrario, se observó también la presencia de cepas resistentes como E. Coli, Citrobacter, Proteus y Bacillus, en las cuales menos del 1 % de las BAL tuvieron un efecto inhibitorio (Tabla 4). Las demás especies, mostraron también un bajo porcentaje de sensibilidad frente a las BAL analizadas. Sin embargo, cabe señalar que, dentro de estas se encuentra Listeria monocytogenes que, si bien fue inhibida solo por el 2.42 % de las cepas de BAL, el grado de inhibición mostrado frente a las cepas a las que resultó sensible es considerable (halos entre 4 y 7 mm) y puesto que este patógeno ha sido de particular interés en la salud pública, debido a los diversos reportes de brotes de listeriosis por alimentos y a la gravedad de los síntomas que esta enfermedad puede ocasionar, es también de gran interés el realizar pruebas que nos lleven a la identificación y caracterización de la sustancia responsable de dicha inhibición. 281

4 Tabla 1. Origen de las cepas No. Cepa Producto Origen Queso Panela Mercado detulancingo Queso Oaxaca Mercado detulancingo Queso Canasto Mercado de Pachuca Queso Doble Crema Mercado de Pachuca Leche Mercado de Atotonilco Queso Oaxaca Mercado de Actopan Queso Panela San Miguel Regla Queso Ranchero Pachuca Queso Botanero Pachuca Queso Manchego Pachuca Queso Oaxaca Tulancingo Queso Cotija Tehuacan Puebla Queso Canasto Acatlán Queso Oaxaca Mercado detulancingo Queso Oaxaca Mercado de Actopan Queso Oaxaca Los Tinos Mercado detulancingo Queso Oaxaca Ternera Acatlán Queso Oaxaca D Margonz Jaltepec Queso Canasto Ciudad de México Queso Molido Central de Abastos de Pachuca Queso Manchego D Margonz Jaltepec Requesón Mercado detulancingo Queso Oaxaca Mercado detulancingo Queso Panela Huejutla Queso Oaxaca Actopan Queso Oaxaca Mercado de Actopan Queso Panela Mercado de Actopan Queso Oaxaca en Singuilucan Queso Panela Mercado de Singuilucan Queso Canasto Central de Abastos de Pachuca Queso Oaxaca Mercado en Tezontepec de Aldama Queso Oaxaca Tezontepec de Aldama Queso Blanco Central de Abastos de Pachuca Tabla 2. Cepas de prueba para la inhibición por BAL Gram negativas Vibrio cholerae Shigella Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Proteus Salmonella Gram positivas Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Listeria monocytogenes 282

5 Tabla 3. Cepas con actividad inhibitoria obtenidas de cada producto Tipo de queso Numero de muestras Numero de cepas Panela 5 15 Oaxaca Canasta 4 3 Doble crema 1 4 Leche 1 6 Ranchero 1 1 Botanero 1 7 Manchego 2 10 Molido 1 1 Requesón 1 1 Blanco 1 6 Cotija 1 0 Tabla 4. Inhibición de microorganismos por BAL Microorganismo Cepas BAL que mostraron Porcentaje actividad inhibitoria Vibrio cholerae Shigella Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes Citrobacter freundi Proteus Salmonella Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Listeria monocytogenes Los resultados muestran que el 90 % de las muestras de queso analizadas contenían BAL capaces de inhibir microorganismos patógenos, como Vibrio cholerae y Listeria monocytogenes, lográndose así la recopilación de un grupo de cepas, las cuales posteriormente podrán ser debidamente caracterizadas, permitiendo a los productores de alimentos fermentados del Estado de Hidalgo, la obtención de cultivos iniciadores a bajo costo, además de que se podrían utilizar dichas cepas en alimentos contra microorganismos patógenos o deterioradores, disminuyendo el riesgo que implica la presencia de estos tanto en la salud de los consumidores como en los costos de producción. 283

6 Bibliografía Axelsson, L.T. (1993). Lactic acid bacteria: classification and physiology. En: Lactic Acid Bacteria. Salminen, S. y von Wright, A. (Eds). Marcel Dekker, Inc. Nueva York pp Farías, M.E., de Ruiz Holgado, A.A.P. y Sesma, F. (1994). Bacteriocin production by lactic acid bacteria isolated from regional cheeses: inhibition of foodborne pathogens. J. Food Prot. 57: Lewus, C.B., Kaiser A. Y Montville, T.J. (1991). Inhibition of food-borne bacterial pathogens by bacteriocins from lactic acid bacteria isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol. 57: Montville, T.J. y Winkowski, K. (1997). Biologically based preservation systems and probiotic bacteria. En: Food microbiology, fundamens and frontiers. Doyle, M.P., Beuchat, L.R. y Montville, T.J. (Eds). ASM Press, Washington, D.C. pp