Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2015
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- María Mercedes Roldán Romero
- hace 7 años
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1 Desde la Sospecha Clínica al Hallazgo Casual: Evolución de los Estudios de Hemoglobinopatías Teresa Villalba Hernández Responsable de Hematología Catlab. Centre analítiques Terrassa
2 Hemoglobinopatías 1925: TB Cooley. Primera descripción de talasemia Major en Detroit (anemia eritroblástica o anemia de Cooley) Anemia severa Hepato-esplenomegalia Discoloración de piel y esclera Leucocitosis con presencia de eritroblastos Aumento de huesos craneales y faciales Congénita (luego se vió que hereditaria) A partir de ahí fuimos sabiendo cada vez mas cosas Depósitos de hierro Por su origen geográfico se le llamó thalassic anaemia, derivó en Talasemia Pacientes de origen italiano incluidos progenitores de pacientes con talasemia major con alteraciones características de hemograma. Nuevas hemoglobinas con características definidas (HbS), Pauli et al, 1947 Se aisló la HbA2, aumentada en pacientes con talasemia. No en todos, al menos dos tipos de talasemia (Alfa y Beta) Hb Bart s, HbH: alfatalasemia, estudios moleculares
3 Tiene que ver con la hemoglobina, específicamente con las cadenas de la globina. HbF: HbA: HbA2: a2g2 a2b2 a2d2
4 Hemoglobinopatías Son las patologías monogénicas autosómicas recesivas (o codominantes) mas frecuentes. Alteración de síntesis de cadenas Déficit de síntesis: Talasemias, alfa y beta Exceso de síntesis: Persistencia hereditaria de Hb fetal Alteraciones estructurales de las cadenas de globina HbS, HbC, HbD. Drepanocitosis Anemias hemolíticas Policitemia Cianosis Puede haber cuadros compuestos o mixtos, diversos grados de severidad Importante distribución geográfica
5
6 Frecuencia alélica HbS
7 Beta talasemia major Inicio en la infancia (6m a 2años) Anemia severa. RBC, VCM Ausencia HbA. Predominio de HbF. Leve aumento de Hb A 2 Hepato-esplenomegalia Aumento de huesos craneales y faciales Congénita: autosómica recesiva Tratamiento: transfusiones Morbimortalidad: sobrecarga férrica, cardiopatía. Quelantes Limitada expectativa de vida (mejora con control correcto) Años 90: trasplante alogénico de MO Betatalasemia minor: Aumento de HbA 2 (3.5-6%) Clínica betatalasemia minor: leve anemia, asintomático.
8 The pathophysiology of beta thalassaemia [courtesy of Olivieri NF, The beta thalassaemias N Engl J Med. 1999]
9 Drepanocitosis Presencia de HbS en estado homocigoto. HbSS. Ausencia de HbA Hemoglobina S polimeriza, deforma el hematíe, predispone a oclusion vascular Crisis vasooclusivas dolorosas Anemia: cronica y/o cuadros agudos graves, hemólisis, secuestro esplénico, litiasis biliar Trombo-embolismos Síndrome torácico agudo AVC: hemiparesias, afasia, convulsiones, microinfartos Enfermedad ósea: osteopenia, osteonecrosis Úlceras en EEII Complicaciones cardiacas : fallo cardiaco Hipertensión Pulmonar Infecciones Enfermedad renal Desencadenantes: hipoxia, infecciones
10 Otras manifestaciones Hemoglobinas inestables: hemólisis Eritropoyesis ineficaz: hemólisis Poliglobulia Cianosis
11 Hemoglobinopatías severas Betatalasemia Mayor Hidrops fetalis por Hb Barts Hb SS Hb SC Hb S/beta talasemia Hb S/D Punjab Hb S/O Arab Hb S/E Hb S/HPFH Nota al margen: si no existe HbA normal NO PODREMOS determinar HbA1c!!!
12 Estudio clásico Dirigido a unidad o laboratorio de hematología para estudio específico Anemias severas de inicio precoz Cuadros hemolíticos Anemias no explicadas Cianosis, poliglobulia Estudios familiares Consejo genético
13 Métodos diagnósticos Hemograma y morfología eritrocitaria Electroforesis de Hb Alcalina Ácida Seguidas de elución, o densitometría de las bandas Electroforesis capilar Cromatografia de intercambio iónico HPLC, primeros analizadores en 1982 Isoelectroenfoque Pruebas específicas: test de solubilidad, de falciformación, de propanol para Hb inestables.
14 Hemograma y morfología eritrocitaria -Todos los índices de serie roja son importantes. En betatalasemia encontraremos -RBC: generalmente aumentado -Hb: normal o baja -Htº: normal o bajo -VCM: bajo, generalmente inferior a 75 fl -MCH: bajo, generalmente inferior a 27 pg -RDW: normal -Descartar ferropenia -Morfología eritrocitaria: - microcitosis, ovalocitos, punteado basófilo grueso, dacriocitos, algún dianocito - células falciformes, hematíes en forma de nave, células irregularmente contraídas
15 Métodos Electroforesis PROS Buena separación de bandas Cuantificación laboriosa poco exacta CONTRAS Precisa técnica complementaria No es útil para A2 Electroforesis capilar IEF (iso electroenfoque) HPLC Sensible Simple Buena separación Detecta y cuantifica fracciones de hemoglobinas Detecta picos anómalos en programas HbA1c Útil para cribado a gran escala Baja carga de trabajo Baja carga de trabajo Dificultad de interpretación Equipo costoso No es útil para HbA2 Precisa técnica complementaria
16 Electroforesis de hemoglobinas Para una identificación presuntiva de una hemoglobina anómala HBAD HBAS + del3.7kb aglob - Alcalina: a ph 8.6 sobre acetato de celulosa. Variantes comunes de hemoglobina: - Hb S, C, D-Punjab, E, O Arab y Hb Lepore. - HbH y Hb Bart si el tiempo de procesado es el adecuado. - Tambien detecta otras variantes : J, N, Q, Hasharon HBAS en lactante - Ácida: a ph 6.0 sobre gel de agarosa o gel de agar citratado. HBAS A F S/D C/A 2 Método útil para distinguir bandas que presentaban dudas - Hb C, E, y O-Arab entre ellas -HbS de Hb D-Punjab. HBA normal Los patrones de migración son distintos según la matriz que se emplee. HBAC
17 HPLC HA Modo talasemia: cuantifica HbA2 y F -En ambos modos (A1c y talasemia) detecta variantes -3 minutos/muestra modo HbA1c, 4.2 min/muestra modo talasemia. Beta talasemia minor
18 HPLC HA-8180v -Rápido: 1.5 min/muestra -Detecta, identifica y cuantifica picos de HbS, C y D -Gráficas anómalas, sin resultado en otras variantes -Nueva versión HA-8180talasemia, 3.5 min/muestra NORMAL
19 HEMOGLOBINA S S SC HBAS en lactante HBAS HBAD HBAS + del3.7kb aglob A F S/D C/A2 normal
20 HEMOGLOBINA C HBA normal HBAC Hemograma: leve microcitosis Morfología: dianocitos Heterozigoto: asintomático Homozigoto: cuadro hemolítico moderado Puede alterar resultado HbA1c (interferencia biológica) Consejo genético: doble heterozigoto SC cuadro moderado
21 Paciente 64 años Ingresada en UCI por problema cardiaco Análisis de HbA1c por HPLC: no se obtiene resultado, patrón anómalo Electroforesis: migra en banda de HbF (discordante con HPLC) Envío a centro de referencia: secuenciación, nueva mutación
22 Mi experiencia Hematóloga Formación: área de anemias, técnicas especiales Trabajo en laboratorio de rutina, área hematología Hemogramas HbA2 y F: cromatografía en columna Electroforesis de hemoglobinas Estudios solicitados desde hematología clínica 2008: gran laboratorio, área de Hematología, análisis de rutina del tubo EDTA: HbA1c Por HPLC se pueden detectar portadores de hemoglobinopatías significativas!!!
23 Laboratorio: Catlab Localización en Barcelona, Vallés Occidental Área de influencia: un millón de personas Solicitudes hospitalarias, atención primaria Hemogramas /año determinacioneshba1c/año Solicitud por médico de cabecera Hb A2 y F Electroforesis de hemoglobinas Estudio molecular de alfatalasemia
24 Resultados: Muchos resultados normales, sin alteraciones Confusión sobre prueba solicitada solicitud de electroforesis para diagnóstico de talasemia, solicitud de HbA2 en lugar de HbA1c Solicitud de estudio de alfatalasemia como estudio inicial
25 Cambio de estrategia Valoración de microcitosis Utilizacion de sistema informático para bloqueo de validación. Cut-off : VCM < 75 fl Añadir pruebas si se considera oportuno Parámetros del metabolismo del hierro Estudios por HPLC Electroforesis de hemoglobinas Estudio de alfatalasemia Iniciamos valoración de picos de Hb variante detectados al analizar HbA1c Anular pruebas solicitadas si no estaban justificadas
26 Decidimos comparar los resultados de nuestro trabajo en dos periodos: - Noviembre de 2008 a Febrero de Noviembre de 2009 a Febrero de 2010 Analizando - Nº de test realizados - Solicitante - Diagnósticos obtenidos - Rendimiento de las técnicas
27 Comparativa resultados PRIMER PERIODO Pacientes estudiados SOLIC FL SOLIC MC 19 0 HbA2 totales electroforesis Alfatalasemia totales HBSS; 5 HBSC; 1 HBAC; 1 HBAS; 10 Hb Lepore; 1 NORMAL; 34 SEGUNDO PERIODO SOLIC MC SOLIC FL HBSS diag; 1 HBAE; 1 HBAC; 4 HBSS control; 4 HBAS; 11 NORMAL; 9
28 PRIMER PERIODO SEGUNDO PERIODO
29 Rendimiento diagnóstico 68,97 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 13,47 32,83 34,62 40,00 HPLC ELECTROF ALFA-TAL 54,29 % POSITIVOS 1P % POSITIVOS 2P
30 Hemograma: microcitosis morfología Revisar datos históricos VCM y Parámetros férricos VCM bajo persistente sin ferropenia VCM bajo persistente con ferropenia Disminución reciente VCM HbA2 y F por HPLC Estudio mtb hierro Alterado HbA2 y F por HPLC Estudio mtb hierro Picos variantes Estudio mtb hierro VCM bajo persistente Sin ferropenia Diagnóstico Betatalasemia EFHB HbA2 y F normales, sin variantes Añadir o recomendar estudio de alfatalasemia
31 Validación estudios de hemoglobinopatía Individualizada Revisar datos del hemograma actual, datos históricos, metabolismo del hierro y cromatogramas de cada caso Si existen picos variantes analizamos por los distintos programas (HbA1c, talasemia) y hacemos electroforesis N Determinaciones HPLC 3699 Beta talasemia minor 964 Beta talasemia major 1 Beta-delta talasemia 81 Hemoglobinopatías estructurales 426 Alfatalasemias 215
32 Hemoglobinopatias estructurales Electroforesis alcalina. N=426 N HbAS 253 HbSS 12 HbAC 113 HbCC 3 HbSC 2 Enviadas a centro de referencia 71 Resultados 67 Normal 9 No aclarados 6 HbAD 27 HbAJ 8 HbAE 3 HB Hope het 4 Hb Lepore het 6 Hb Lansing 2 HbS/beta talasemia 2 Hb Hafnia het 1 Hb Roane/Siriraj 1 Hb G Philadelphia het 1 Doble heterozigoto Hb G Philadelphia/HbS Hb O Arab het 2 Hb Hope/Beta talasemia 1 Hb Arlington Park 1 Hb Variante alfa 1 Hb Vall d Hebron 2 Hb pendiente de registrar 1 N 2
33 Estudios alfatalasemia: PCR + hibridación reversa Mutación casos Deleción 3.7 Kb homocigoto 94 Deleción 3.7 Kb heterocigoto 91 Doble del(--sea) heterocigoto 5 Doble del(--sea) homocigoto + mutación puntual en el codón 125 del gen α2 (Hb Quong Sze) en hemicigosis. Doble del.3.7kb/4.2kb 5 Del. α2 IVS1 5nt heterocigoto 11 Del. 3.7Kb heterocigoto/del. α2polya-1 hemicigoto 1 Del. 3.7Kb heterocigoto/del. α2 IVS1 hemicigoto 2 Doble del. 20.5Kb heterocigoto 1 Triplicación anti-3.7kb 4 Wild type 154 Total 369 1
34 Rendimiento Nº ESTUDIOS POS Rendimiento (%) HPLC (Talasemias b y bd) ,3 Hemoglobinopatias estructurales ,5 a-talasemia ,2 TOTAL ,1
35 Cómo detectamos Talasemias Estudio pormenorizado de las microcitosis Añadido por facultativo de laboratorio Alfatalasemia: Añadido o sugerido desde laboratorio, estudio familiar Hemoglobinopatias estructurales Picos de Hb variantes por HPLC Si solicitan electroforesis hacer siempre HPLC, si cromatograma normal anulamos electroforesis.
36 Cuántas variantes detectamos de Periodo de 3 meses rutina?? hemogramas determinaciones HbA1c 50 variantes detectadas (la mayoria ya conocidas) 36 Hb AS 8 Hb AC 2 Hb AD 1 Hb AE 1 Hb Lepore heterozigota 1 Hb Hope 1 Hb AJ
37 Informes de resultados Al analizar HbA1c informar de hallazgo de variante Resultado del estudio de variante: fenotipo compatible Recomendar estudio familiar? En hemoglobinas que tengan trascendencia clínica: anemia, hemólisis, alteraciones de saturación de O2, interferencia HbA1c En hemoglobinas que combinadas puedan dar lugar a cuadros severos Recomendar consejo genético? En hemoglobinas que combinadas puedan dar lugar a cuadros severos
38 Conclusiones Tenemos a nuestra disposición en el laboratorio general unas muy buenas herramientas para el diagnóstico de hemoglobinopatías, solo hemos de usarlas La detección de portadores de hemoglobinopatía es importante para prevenir o para el diagnóstico precoz de enfermedades graves
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