INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN Analisis de la respuesta inmune en ratones BALB/c tratados con Factor de Transferencia Tesis que para obtener el grado de Doctorado en Ciencias en Inmunología PRESENTA MenC Estela Valderrábano Ortiz DIRECTOR: Dra. Sonia Mayra Pérez Tapia DIRECTOR: Dr. Sergio Estrada Parra México, D.F. 200

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3 INDICE Pagina ÍNDICE I ABREVIATURAS ÍNDICE DE FIGURAS RESUMEN ABSTRACT I INTRODUCCION 1 A) Extracto Dializable de Leucocitos 3 B) Especificidad del EDL 5 C) Estructura 8 D) Efecto Biológico 12 II JUSTIFICACION 17 III HIPOTESIS 17 IV OBJETIVO GENERAL 17 V OBJETIVOS PARTICULARES 18 VI MATERIAL Y METODOS 1 a) Obtención de EDL 1 b) Obtención de EDL específico 1 c) Prueba de DTH 20 d) Esquema de Inmunización con OVA, EDL y EDL OVA 22 e) Ensayo de ELISA para anticuerpos contra OVA 23 f) Western-blot 25 g) Formación de centros germinales 27 h) Cuenta celular y caracterización de diferentes poblaciones celulares del ganglio y sangre periférica 2 i)cuenta celular e identificación de plasmablástos y células plasmáticas en médula ósea 31 VII RESULTADOS a) Prueba de DTH 33 b) Ensayo de ELISA para IgM e IgG contra OVA 34

4 c) Western-blot 38 d) Peso de los ganglios 3 e) Número de células de los ganglios inguinales de los diferentes grupos 42 f) Formación de centros germinales 43 g) Caracterización de las poblaciones linfocitarias en el ganglio regional 47 h) Cuenta celular e identificación de plasmablástos y células plasmáticas en médula ósea 54 VIII DISCUSION 58 IX CONCLUSIONES 73 X BIBLIOGRAFÍA 74

5 ABREVIATURAS Ab Anticuerpo AFC Célula formadora de anticuerpo, del inglés Antibody forming cell Ag Antígeno BSA Albúmina sérica bovina, del inglés bovine seric albúmina camp Adenosín monofosfato cíclico CPA Célula presentadora de antígeno DC Célula dendrítica DO Densidad óptica DTH Hipersensibilidad cutánea tardía, del inglés delayed type hypersensibility DTT Dithiotreitol EDL Extracto dializable leucocitario ELISA Enzymed linked immunosorbet assay FT Factor de Transferencia HEV Vénulas de endotelio alto, del inglés high endothelium venules HPLC Cromatografía líquida de alta resolución, del inglés High performance liquid cromatography HSV Virus Herpes simplex i.d. intradremoreacción IFN Interferón IgG Inmunoglobulina G IgM Inmunoglobulina M KDa kilodaltones LIF Factor inhibidor de la migración de los leucocitos MIF Factor inhibidor de la migración de los macrófagos OVA Ovoalbúmina PBA PBS con albúmina sérica bovina PBS Regulador de salina-fosfatos PNA Aglutinina de cacahuate POX Peroxidasa i

6 PPD RIC TF-HSV Th THY-1 Th0 TLR TNF Derivado proteínico purificado de M. tuberculosis Respuesta inmune celular Factor de transferencia específico para Herpes virus Linfocitos T cooperadores Antígeno θ, epitopos encontrados en timocitos murinos Linfocitos T cooperadores vírgenes Receptores tipo Toll Factor de necrosis tumoral ii

7 RESUMEN Análisis de la respuesta inmune de ratones BALB/c tratados con Factor de Transferencia Los Extractos Dializables Leucocitarios (EDL), son moléculas que transfieren la respuesta inmune celular (RIC) de un organismo inmunocompetente a otro. Esta transferencia es antígeno específica, siendo lo más sobresaliente la transferencia de hipersensibilidad tardía (DTH) y la producción de citocinas, además de el restablecimiento del perfil celular en sangre periférica. Sin embargo a pesar de múltiples investigaciones aún no se conoce por completo su mecanismo de acción, por lo que es importante determinar si la inmunomudalación celular provocada por el EDL interviene en el cambio de isotipo (switch) de inmunoglobulinas. OBJETIVO. Caracterizar la respuesta inmune humoral contra ovoalúmina (OVA) en ratones BALB/c retados con OVA y/o EDL. MATERIALES Y MÉTODOS. Se inmunizaron diferentes grupos de ratones BALB/c con OVA, EDL y/o EDL OVA, el día cero y el día 14 para el grupo con OVA y los días cero, 14, 21 y 28 para los grupos con EDL y EDL OVA, se tomaron muestras de sangre desde el día cero hasta el día 36 para todos los grupos; se midió la concentración de IgG e IgM específica para OVA por prueba de ELISA. Se sacrificaron 3 ratones de cada grupo los días, 15 y 23 post-inmunización y se les extrajeron los ganglios. Se realizaron cortes de los ganglios y se identificó por inmunohistoquímica la presencia de linfocitos B en reacción de centro germinal (PNA+), y de linfocitos T (THY-1+); se identificó por citometría de flujo diferentes poblaciones celulares (linfocitos T, linfocitos B, macrófagos, células dendríticas y células plasmáticas). Se sacrificaron 4 ratones de cada grupo el día 20 post-inmunización, se les extrajo la médula ósea y se identificaron con anticuerpos monoclonales y citometría de flujo los linfocitos B, plasmablastos y células plasmáticas. RESULTADOS. En el ensayo de ELISA encontramos que el grupo que se inmunizo con OVA y se reto con EDL OVA fue capaz de producir IgG específica para OVA, así como el grupo que fue inmunizado solo con EDL OVA. Los ganglios de los ratones tratados con EDL OVA tuvieron un menor peso, tienen células PNA positivas dentro de los folículos del nódulo linfático, pero tienen un menor número de centros germinales por ganglio y tienen un menor número de células plasmáticas; en sangre periférica tienen aumentados los linfocitos B, plasmablastos y células plasmáticas. El grupo inmunizado con OVA-EDL OVA presentó un mayor número y tamaño de los centros germinales, además de tener aumentadas todas las poblaciones celulares que se midieron en el ganglio, y también aumentaron los plasmablástos y células plasmáticas de la médula ósea. CONCLUSIONES. El EDL OVA es capaz de inducir la respuesta inmune humoral contra OVA; generando células plasmáticas de larga vida cuando se utiliza como reto de inmunización.

8 ABSTRACT Immune response analysis in BALB/c mice treated with Transfer Factor Murine dialyzable spleen extracts (DSE) are similar to Transfer Factors in that they can transfer cell mediated immunity (CMI) from an immunocompetent organism into a naïve one in an antigen-specific manner. This is an antigen specific transference and the cytokine production and DTH are the most important test for that. DSE had been used successfully in the treatment of Hipogammaglobulinemy, having an augmentation in IgG serum levels. Objective. In this work we investigated if treating mice with DSE obtained from OVA immunized mice (DSE ova ) could modify the humoral immune response against OVA in naïve mice. Methods. DSE ova preparation: splenic cell suspensions from OVA immunized BALB/c mice were disrupted by freeze-thaw cycles, extracts were then dialyzed with a membrane pore of 10 kda. Ten BALB/c mice were treated on days 0, 14, 21 and 28 with 20g of DSE ova alone. Serum samples were obtained between days 0-36, and IgM and IgG anti-ova were assayed by ELISA. Mice were sacrified on days, 15 and 23 postimmunization, and germinal centers (GC) in lymph nodes were identified by immunohistochemistry using PNA and THY-1. Mice were sacrified on the 20 th day after immunization, and plasma cells in lymph node and bone marrow were identified by flow citometry. Results. Compared to control saline-treated animals, DSE ova treated mice produced IgM and IgG anti-ova. Compared to saline-treated mice, DSE ova -mice showed increased numbers of GC, but of smaller size than OVA-treated mice. the numbers of plasmablast and plasma cells in lymph node and bone marrow were higher in the group boosted with DSE ova with respect to the OVA group. Conclusion. In this in-vivo model, compared to control-mice, DSE ova would appear to stimulate the Ag-specific antibody responses and the appearance of GC. Numbers of plasmablast and plasma cells in mice boosted with DSE ova, augmented in bone marrow, these could mean that the response of these mice will be better in a next encounter with the antigen, So we could confirm that stimulation with DSE augment the immunity of the receptor transferring the cellular response and enhancing the humoral response

9 I INTRODUCCION La teoría celular de la inmunidad, que afirmaba que las células del huésped eran los mediadores principales de la inmunidad, fue defendida inicialmente por Elie Metchnikoff, su demostración de la existencia de fagocitos rodeando una espina clavada en una larva de estrella de mar traslúcida, publicada en 183, fue tal vez la primera prueba experimental de que las células responden a invasores extraños. La inmunidad mediada por células, o inmunidad celular, está mediada por los linfocitos T; la defensa frente a microorganismos intracelulares como virus, parásitos y bacterias intracelulares, es una función de la inmunidad celular, la cual favorece la destrucción de los microorganismos que residen en los fagocitos, o en las células infectadas, con el fin de eliminar los reservorios de la infección (Abbas AK, 2002). La inmunidad protectora frente a un microorganismo se produce por la respuesta del huésped ante éste (inmunidad activa), pero también puede adquirirse pasivamente mediante la transferencia de linfocitos ó anticuerpos procedentes de una persona con inmunidad específica contra un determinado antígeno. Este proceso se conoce como inmunidad pasiva, después de esta transferencia el sujeto receptor es capaz de responder contra el antígeno, sin haber estado nunca expuesto o haber experimentado una respuesta contra el mismo (Abbas AK, 2002). Este fenómeno de transferencia de la inmunidad celular de un donador inmune a un receptor no inmune fue realizado por Landsteiner y Chase (Landsteiner y Chase, 142), y empleado por Lawrence (Lawrence, 1

10 14) para el desarrollo de lo que hoy conocemos como factor de transferencia (FT) o extractos dializables de leucocitos (EDL). Otra función de la respuesta inmune celular (RIC) es la cooperación con los linfocitos B para la formación de anticuerpos, esta cooperación está mediada por citocinas y un componente de membrana, el ligando de CD40 (CD40-L) ó CD154; a continuación se describirá en detalle como se lleva a cabo esta cooperación. Los ganglios linfáticos son el sitio donde se conjuntan de manera dinámica los elementos necesarios para la formación de anticuerpos: células presentadoras de antígeno, los linfocitos T, los linfocitos B y un ambiente de quimiocinas y citocinas necesarios para que ésto se lleve a cabo. Las células dendríticas (DC) se encargan de llevar al antígeno (Ag) desde los tejidos hasta las nódulos linfoides por la vía aferente, mientras que los linfocitos T y B pasan de la sangre al nódulo linfoide por las vénulas con epitelio alto (del inglés high endotelial venules, HEV); si al llegar al nódulo no encuentran al antígeno para el que son específicas, regresan a la circulación sanguínea y llegan hasta otro nódulo a continuar la búsqueda. Solo se inicia una reacción inmunológica en el ganglio linfático cuando los linfocitos T y B se encuentran con el antígeno para el que son específicos, los linfocitos T cooperadores (Th0) son activados por las células presentadoras de antígeno (CPA), estos linfocitos al reconocer al antígeno proliferan y se diferencian en linfocitos Th, los cuales comienzan a producir citocinas y están listos para interactuar con los linfocitos B que reconocieron al mismo antígeno. Esta interacción entre los linfocitos Th y 2

11 B se lleva al cabo en el área paracortical del nódulo linfoide, donde forman lo que se llama el foco primario (Jacob et al, 11, Kuppers et al, 13). En el foco primario los linfocitos B se dividen durante unos días, algunos se diferencian a células plasmáticas o formadoras de anticuerpos (AFC) y migran a los cordones medulares para producir anticuerpos específicos para el antígeno, otros migran a los folículos primarios y proliferan hasta formar un centro germinal, en el centro germinal los linfocitos B sufren un proceso de hiper-mutación somática y selección, que da como resultado un incremento en la afinidad de los receptores y los anticuerpos por el antígeno. Algunos de los linfocitos B del centro germinal se diferencian en linfocitos B de memoria, los cuales son necesarios para aumentar la respuesta secundaria en caso de un futuro encuentro con el mismo antígeno (Berek et al, 11, Cyster et al, 2003, Kelsoe et al, 1). Extracto Dializable de Leucocitos (EDL) y Factor de Transferencia (FT) En 142, Landstainer y Chase describieron por primera vez la transferencia de la respuesta inmune celular (RIC), utilizando células de exudado peritoneal de cobayos sensibilizados a tuberculina o cloruro de picrilo. Las células de los animales sensibilizados eran transferidas a los receptores no sensibilizados y éstos adquirían la capacidad de expresar la RIC de los donadores. Estos autores encontraron que la transferencia era mejor cuando se realizaba entre donadores y receptores que tuvieran alguna relación genética y sólo cuando usaban células íntegras y viables (Landstainer y Chase, 142). 3

12 En 14, Lawrence demostró que la transferencia celular también era posible en humanos. Utilizó linfocitos viables intactos de un individuo normal con una intradermorreacción (i.d.) positiva al PPD, que es una manifestación de la hipersensibilidad tardía cutánea ó DTH (de las siglas en inglés delayed type hypersensitivity ), inyectándolos a un individuo con una i.d. negativa al PPD, provocando que el segundo individuo (el receptor de las células), al ser posteriormente retado con PPD, presentara una i.d. positiva (Lawrence, 14). En 155 el mismo Lawrence, demostró que la i.d., podía ser transferida, utilizando extractos solubles de leucocitos provenientes de 20 ml de sangre total. En estos experimentos Lawrence utilizó lisados de leucocitos de donadores que presentaban i.d. positivas a antígenos tales como la coccidioidina, el toxoide diftérico, la proteína M del estreptococo y el PPD; en todos los casos los receptores eran individuos con i.d. negativas a estos antígenos, 24 h después de haber recibido el extracto soluble, los receptores eran capaces de presentar reacciones de DTH positivas a los antígenos que eran reconocidos por los donadores y el efecto parecía ser antígeno específico (Lawrence, 155). Al componente activo de estos extractos celulares se le llamó factor de transferencia (FT); Lawrence dio a conocer que el FT podía pasar a través de una membrana de diálisis con un corte molecular menor a 20 kilodaltones (KDa) sin perder su capacidad biológica; además, Lawrence supuso que estos dializados contenían solo una especie molecular (el FT), hoy en día, se sabe que la preparación que originalmente se llamó FT, es en realidad un conjunto de moléculas a las que ahora se les nombra extractos dializables de leucocitos o EDL (Lawrence, 155) y dentro del conjunto de moléculas que forman este extracto se encuentran las moléculas responsables de la transferencia de la RIC. 4

13 El descubrimiento de la actividad biológica de los EDL o FT proporcionó las primeras evidencias de que las células inmunocompetentes son capaces de comunicarse efectivamente entre ellas con un lenguaje que consta de factores solubles diferentes a las inmunoglobulinas; en ese momento, (los años 50 s), no existían datos de la comunicación a través de citocinas. El EDL es aquel que proviene del rompimiento de leucocitos de sangre periférica, ó de células linfoides obtenidas de bazo, seguido de un proceso de ruptura y diálisis donde se obtiene la fracción de bajo peso molecular que dializa; el término factor de transferencia (FT) quedó reservado únicamente para los componentes del EDL que transfieren la respuesta de linfocitos T de una manera antígeno específica y que tienen un peso molecular comprendido entre 3.5 y 5 KDa. De acuerdo con Kirkpatrick su naturaleza química es de polipéptidos (Kirkpatrick et al, 12), y de acuerdo con Fudenberg, Pizza y Borvak son polipéptidos unidos a oligonucleótidos (Borvak et al., 18; Fudenberg y Pizza, 13). En adelante se mencionarán EDL y FT indistintamente, aclarando que todos los autores han trabajado únicamente con EDL pero lo han llamado factor de transferencia. B) Especificidad del DLE En 160 Rapaport y Lawrence, obtuvieron EDL de un grupo de californianos con DTH positiva a la coccidioidina, un antígeno de Coccidioides imitis, un hongo endémico de la zona, lo aplicaron a un grupo de neoyorquinos con DTH negativa a dicho antígeno, adquiriendo estos últimos una respuesta de DTH positiva a coccidioidina, antígeno al cual eran positivos los donadores; el efecto anterior demostró especificidad en 5

14 la transferencia de la DTH. Como control de estos experimentos realizaron repetidas veces la prueba de DTH a neoyorquinos que no fueron transferidos con EDL y eran negativos a esta prueba, nunca se hicieron positivos a la coccidioidina (Rapaport et al., 160), con ésto demostraban que la pequeña cantidad de Ag a la que exponían a los sujetos no era suficiente para despertar una RIC. En 181, Petersen y col., desarrollaron un modelo murino para el estudio de la transferencia de DTH, en el cual utilizaron preparaciones de EDL, obtenidos de forma idéntica a partir de esplenocitos de animales no sensibilizados y sensibilizados con PPD, ferritina, citocromo C, peroxidasa de rábano y un antígeno particulado de cándida. Todas ellas se aplicaron a ratones vírgenes, 24 h después los animales fueron retados con los diferentes antígenos empleados, reaccionando solamente a los antígenos con los que el donador había sido previamente inmunizado. Los controles utilizados en estos experimentos fueron ratones que recibieron EDL proveniente de animales no inmunes, estos animales no presentaron DTH positiva ante ninguno de los antígenos anteriormente mencionados (Petersen et al., 181). Lawrence y Borkowsky prepararon extractos dializables de donadores que eran inmunes a toxoide diftérico o a candida, y sometieron estos extractos a inmunoabsorción en placas de poliestireno cubiertas con los diferentes antígenos y después de un tiempo de incubación, los extractos se recuperaron y se probó su actividad de inhibición de la migración de leucocitos (LIF), observándose que los extractos dializables de las placas que estaban cubiertas con cándida ya no eran capaces de inhibir la migración de los leucocitos, después de la inmunoabsorción; lo mismo pasaba con el toxoide diftérico (Lawrence y Borkowsky, 183). 6

15 Kirkpatrick reforzó el concepto de la transferencia de DTH, demostrando que el EDL inducía en el receptor un evento inmunológicamente específico, al utilizar antígenos sintéticos para inmunizar ratones, obtener EDL y con éste realizar un estudio de transferencia de DTH. En estos experimentos, los ratones que recibieron el EDL específico, únicamente reaccionaron con el antígeno para el cual el ratón donador fue sensibilizado. Como control adicional se retó al receptor con los demás antígenos sintéticos, sin que se observara ningún tipo de reacción de DTH positiva (Kirkpatrick et al., 180). En 185, Kirkpatrick, también demostró que el FT era capaz de unirse específicamente al antígeno que lo indujo. Para ello empleó EDL obtenido de ratones sensibilizados con ferritina, posteriormente incubó los dializados en superficies plásticas cubiertas con ferritina, observando que al recuperar el extracto, éste perdía su capacidad de transferencia de DTH para ferritina (Kirkpatrick 180 y 185). La actividad específica puede ser recuperada eluyendo el FT de la superficie plástica con urea 8 Molar o acetonitrilo. Esta técnica es ampliamente utilizada hasta el día de hoy, para la purificación de FT específico (Kirkpatrick & Rozzo, 12). A un grupo de pacientes que cursaban con herpes genital y/o herpes labial, se les dio tratamiento con EDL específico para el virus Herpes simplex (HSV), obtenido de pacientes convalecientes de herpes y a otro grupo de pacientes con herpes se les dio EDL inespecífico; la inmunidad celular de estos pacientes fue evaluada por la prueba de LIF en presencia del antígeno, que en este caso era el HSV. Estas pruebas se realizaron antes, durante y después del tratamiento con el EDL específico para HSV. El 25.4% de los pacientes fueron positivos para la prueba de LIF, antes del tratamiento o con el EDL inespecífico, mientras 42.5% de los pacientes que se trataron con EDL específico fueron positivos a la prueba; demostrando 7

16 así la transferencia de la inmunidad celular específica al antígeno que indujo al EDL (Pizza et al., 16). En otros estudios se analizaron las propiedades inmunobiológicas del EDL de origen humano específico contra Staphylococcus aureus, demostrando que este era capaz de estimular leucocitos humanos in vitro e in vivo. Las pruebas realizadas fueron inhibición de la migración de macrófagos (MIF), LIF, y cuantificación de la formación de rosetas E (linfocitos T). Utilizando como antígeno al S. aureus, encontraron que todas las pruebas eran positivas después del tratamiento con EDL específico. Para las pruebas in vivo se utilizaron las reacciones de DTH a S. aureus, induciendo en los receptores DTH positivas al Ag después de haber recibido el EDL específico (Liubchenko et al., 17). C) Estructura Lawrence fue el primero en demostrar que el material en los extractos dializables de leucocitos responsables de la transferencia de la DTH era orcinol positivo, biuret positivo, resistente a DNasa, a RNasa pancreática y a tripsina; y que el eluído obtenido, después de pasarlo a través de una columna de Sephadex G-25, daba un pico de absorción entre 260/280 y el peso molecular era menor a 10 KDa (Lawrence et al., 163). Más tarde Spitler et al. demostraron que la digestión enzimática con pronasa (enzima proteolítica, rompe proteínas o péptidos hasta fragmentos pequeños) eliminó la actividad biológica del EDL, pero que se mantuvo estable después de un calentamiento a 56 C por 2 horas (Spitler et al., 173). Por lo anterior, se sugirio que la naturaleza del EDL podría ser peptídica. En 17 Wilson y Fudenberg, utilizando Sephadex G-25 lograron separar dos fracciones del EDL, una de ellas inhibía la migración de 8

17 leucocitos dependiente de antígeno, es decir inducía LIF y dicha fracción tenía un peso molecular mayor a 5 KDa. La capacidad de inhibición se mantuvo estable al calentarla a 56 C por 30 min, pero fue parcialmente destruida al calentarla a 80 C por 30 min. También hicieron una purificación con Biogel P-10, obteniéndo moléculas con un peso molecular comprendido entre los 14 KDa y 17 KDa, de naturaleza peptídica y ribonucleotídica (Wilson y Fubenberg, 17). En la figura 1 se puede observar la separación de EDL por Sephadex G-25 realizada por Kirkpatrick y Gallin, demostrando que el EDL tiene un peso molecular alrededor de 5 KDa (Kirkpatrick and Gallin, 174). En 183 Wilson y Fudenberg demostraron que los EDL inducían dos efectos: uno antígeno dependiente, el cual era mediado por el FT contenido en ese EDL y otro efecto antígeno independiente, que inducía un efecto inespecífico sobre la inmunidad celular, donde participa la respuesta inflamatoria. Entre los componentes que tienen efecto inespecífico se encuentran prostaglandinas, nicotinamida, ácido ascórbico, histamina, serotonina, bradicinina, factores de diferenciación de linfocitos (timosina 1), quimioatrayentes para monocitos, y factores inmovilizadores de neutrófilos (Wilson y Fudenberg, 183). A partir de un EDL bovino específico contra PPD (bedl PPD ) Wilson, Paddock y Fudenberg purificaron el factor de transferencia, y encontraron que era soluble en agua, pero insoluble en fenol ó eter y que podía ser precipitado en etanol. Lo analizaron por cromatografía de alta presión en fase líquida (HPLC, high-performance reverse phase liquid chromatography ) donde encontraron un solo pico, la especie molecular que se encontraba aquí contenía por lo menos un grupo co-planar cis-diol libre, el cual fue demostrado también por cromatografía de afinidad con ac. borbórico.

18 También lo sometieron a la acción de endonucleasas, exonucleasas, proteasas y fosfatasas, llegando a la conclusión de que éste tenía una estructura de oligorribonucleopéptido (Wilson, Paddock y Fudenberg, 182). En 18 Borvak y col., midieron la absorbancia en UV del EDL ultrafiltrado en Sephadex G-15, antes y después de pasar el extracto por una columna de afinidad con m-aminofenil y ácido borbórico inmovilizado. Este fraccionamiento bioespecífico provocó un enriquecimiento de material protéico, que aparentemente contiene purinas y pirimidinas y que tenía actividad biológica; esto indica que es posible que los componentes activos del EDL sean moléculas protéicas unidas a moléculas parecidas al RNA (Borvak et al., 18), lo que confirmó los resultados de Wilson y Fudenberg y se puede observar en la figura 2 que también lo comprobaron Kirkpatrick y Gallin. FIGURA 1. Separación de EDL por Sephadex G-25. Se eluyeron seis picos con una densidad óptica de 225 nm, este espectro demostro que el EDL tiene un peso molecular alrededor de 5 KDa (Kirkpatrick and Gallin, 174). 10

19 FIGURA 2. Espectro de absorbancia de luz UV del EDL, el pico máximo de absorción estuvo entre 250 y 255 nm, lo que sugiere la presencia de ácidos nucléicos (Kirkpatrick and Gallin, 174). En 10 Borvak empleo HPLC en fase reversa y diversas técnicas químicas, con las cuales se realizó el análisis de aminoácidos contenidos en las dos fracciones principales del EDL, demostrando la presencia de lisina, serina, glicina y ácido glutámico (Borvak et al., 10). A fines del siglo XX, Kirkpatrick logró purificar y secuenciar factores de transferencia murino y bovino, Las secuencias se obtuvieron por HPLC y los productos fueron digeridos con bromuro de cianógeno, obteniendo una secuencia de aminoácidos conservada, LLYAQDL/VEDN, en los 7 diferentes factores de transferencia analizados; estos péptidos no fueron capaces de transferir DTH por sí solos, sin embargo la administración conjunta de estos péptidos con el FT bloqueó la actividad de transferencia de DTH, característica clave del FT, por lo que se propuso que los péptidos generados con bromuro de cianógeno se unen al mismo sitio efector al que se unen los FT (Kirkpatrick, 2000). 11

20 Esta fracción antígeno específica del EDL contiene una gran cantidad de diferentes FTs, considerando el peso molecular y la composición de los diferentes FTs, es factible que cada FT contenga como estructura base por lo menos 45 aminoácidos (tomando en cuenta el peso molecular de 5000 Da). Por lo tanto, si se consideran las posibles combinaciones con los 20 aminoácidos conocidos, entonces deben existir varios millones de variaciones en la estructura primaria (45 20 ), y por lo tanto varios millones de FT específicos para todos los diversos antígenos existentes (Kirkpatrick, 188) que corresponden a la suma de las experiencias inmunes del individuo del cual se obtienen el EDL. D) Efecto biológico El mecanismo por el cual los EDLs ejercen su efecto biológico no está completamente establecido y los trabajos más representativos de su efecto tanto in-vitro como in-vivo que sirven de antecedentes para este trabajo se mencionan a continuación. En 170 diferentes grupos de investigación demostraron que el EDL era capaz de inhibir la migración de macrófagos de una manera antígeno específica, además de inducir DTH en respuesta a antígenos específicos; esto lo demostraron en pacientes con el Síndrome de Wiskott-Aldrich, una inmunodeficiencia en los cuales la RIC transferida permaneció por más de seis meses y se favoreció la producción de MIF y LIF de manera antígeno específica (Fudenberg et al., 18; Wilson y Fudenberg, 181; Spitler et al., 172; Levin et al., 170 ). En los años 80 s Lawrence y Borkowsky propusieron que los EDL contenía una función inductora, la cual consiste en activar células que se 12

21 encuentran en reposo de manera antígeno específica; demostrando esto con EDL de donadores inmunizados con toxoide diftérico, el cual se sometió a inmunoabsorción en placas de poliestireno que contenían adsorbido toxoide diftérico, después de ésto se realizó la prueba de producción de MIF en presencia de dicho antígeno, y encontraron que el EDL fue anulado en su actividad inductora de MIF después de la inmunoabsorción (Lawrence y Borkowsky, 183). Rozzo y Kirkpatrick prepararon extractos dializables murinos a partir de cepas de ratones genéticamente respondedoras a ciertos antígenos (BALB/c (H-2 d ), C57BL/10 (H-2 d ), B10.M (H-2 f )) y de cepas genéticamente no respondedoras a los mismos antígenos (B10.Q (H-2 q ), CBA (H-2 K ) y SWR/J (H-2 q )). Los EDL de las altamente respondedoras fueron capaces de transferir la DTH a las cepas no respondedoras; sin embargo, los EDL preparados a partir de las cepas no respondedoras no fueron capaces de transferir la DTH a las cepas no respondedoras ni a las altamente respondedoras. Con estos resultados los autores propusieron que el EDL es capaz de transferir el fenotipo altamente respondedor a los receptores genéticamente no respondedores y que la producción del factor de transferencia está regulado o restringido por el MHC en los genes Ir, pero la actividad no está restringida en los receptores (Rozzo y Kirkpatrick, 188). En pacientes con carcinoma renal se realizó un estudio cuando estos fueron tratados con FT y se observó que aumentaban 10 veces el número total de linfocitos CD4+, así como el número total de linfocitos CD3+ y CD8+, además de que el 80% de los pacientes mostró una mejoría clínica (Mrazova y Mraz, 13). En 16 Alvarez-Thull y Kirkpatrick propusieron que el mecanismo inmunológico del FT es la activación de linfocitos T cooperadores tipo 1 13

22 (Th1) al hacer un estudio en el cual estimulan ratones BALB/c con FT específico contra el virus Herpes simplex (TF-HSV), una semana después colectaron los bazos de estos ratones e in vitro estimularon los esplenocitos con HSV, y en los sobrenadantes se encontró IFNγ y una baja ó nula producción de IL-4 e IL-10 (Alvarez-Thull & Kirkpatrick, 16). En 16 se realizó un estudio en el que se estimularon monocitos y células endoteliales con productos de las paredes celulares de diferentes microorganismos (i.e. LPS, ac. lipoteicoico y peptidoglicana) seguidos por un tratamiento con EDL, encontrando que el EDL suprimió la producción de TNF, indujo la liberación de IL-8 en los monocitos y aumentó los niveles de camp, así mismo aumentó la producción de IL-6 e IL-8 en las células endoteliales; los autores proponen que el efecto del EDL sobre los mediadores proinflamatorios es similar a la acción del camp, aumentando la producción de estos compuestos, sugiriendo de esta manera que el aumento del camp es uno de los efectos biológicos que los EDL tienen sobre las células endoteliales y los monocitos (Ojeda et al., 16). Posteriormente siguiendo este estudio del efecto de los componentes bacterianos y el tratamiento con EDL, los mismos autores, confirmaron por citometría de flujo que el EDL era capaz de aumentar la expresión de TLR2 y TLR4 (Ojeda et al., 2005) En 176 Silverman y cols. utilizaron FT en el tratamiento de la Hipogammaglobulinemia congénita, el cual tuvo un efecto benéfico sobre los linfocitos B en la síntesis de inmunoglobulinas. Estudiaron pacientes con Hipogammaglobulinemia tratados durante los 6 años anteriores con γ- globulina exógena, estos pacientes reportaban un nivel sérico de IgM de 35 mg/dl.; después de las 4 dosis iniciales de FT (producto de la diálisis de 1x 10 8 linfocitos por dosis) sus niveles de IgM cambiaron y se volvieron indetectables, además de que hubo un aumento en los niveles de IgG de 14

23 56 mg/dl. a 130 mg/dl.; estos niveles aumentaron de una manera similar a los niveles alcanzados con la gammaglobulina exógena. El nivel sérico de IgG de los pacientes se mantuvo durante los siguientes 12 meses, con un refuerzo trimestral de 1 dosis de factor de transferencia, por lo tanto estos pacientes no requirieron terapia adicional de gamma globulina exógena, por primera vez durante el curso de su enfermedad se mostraron clínicamente asintomáticos. Este aparente efecto en la interacción de los linfocitos T y B puede ser explicado de la siguiente manera el FT estimula a los linfocitos T los cuales aparentemente son responsables del switch de IgM a IgG en los linfocitos B reflejando así el cambio en la respuesta humoral. En 176 el mismo grupo utilizó factor de transferencia en pacientes con macroglobulinemia de Waldenstrom (cáncer de células plasmáticas con sobreproducción de IgM); los pacientes fueron tratados con 12 unidades de FT (1 unidad = producto de la diálisis de 1x 10 8 linfocitos por dosis). En los pacientes con macroglobulinemia los niveles séricos de IgM disminuyeron mas del 40%, de 730mg/dl. a 480mg/dl. Cuando se dejo de administrar el FT, los niveles de IgM en suero regresaron a los valores antes del tratamiento o aun mayores. Es posible que estos cambios sean resultado del aumento en la inmunidad celular contra las poblaciones celulares malignas por efecto del FT o que se modula la producción de IgM debido a la interacción entre linfocitos T y B. No hubo cambio significativo en los niveles de IgG durante el tratamiento con el FT, sin embargo se observó una caída de 600mg/dl. a 300mg/dl. después de descontinuar el uso del FT. 15

24 En 16 Estrada-Parra y cols. realizaron un estudio en pacientes con diagnostico de dermatitis atópica moderada a severa, a todos los pacientes se les tomó al inicio del tratamiento una muestra sanguínea para la determinación de niveles séricos de inmunoglobulinas A, G, M y E total, subpoblaciones de linfocitos CD3, CD4 y CD8. Además se realizarón coproparasitoscópicos en serie de 3, exudado y cultivo faríngeo y nasal para búsqueda de eosinófilos. Los resultados demostraron una disminución de las células CD4, eosinófilos e IgE, al compararlos con los niveles séricos al inicio del estudio, aunque sin ser estadísticamente significativos. Desde el punto de vista clínico se observó una mejoría en los cuatro parámetros valorados: eritema, eczema, pápulas y prurito, al término de la administración del FT. En el 2000 Espinosa y cols. realizaron un estudio en pacientes con diagnóstico de Asma moderada intermitente y moderada persistente a los cuales además del tratamiento convencional, se les administro FT. Los resultados demostraron una disminución en los niveles séricos de IgE, aunque estos no fueron estadísticamente significativos, sin embargo se observó una mejoría clínica en los pacientes como consecuencia del efecto del FT, desapareciendo las crisis asmáticas y no hubo necesidad de continuar el tratamiento con esteroides, solo con FT. Los niveles de IL-4 no fueron detectables; sin embargo, los pacientes pasaron de un asma moderada a asma leve. En otro estudio se observó la morfología de los cojinetes plantares y de los órganos linfoides de ratas que fueron sensibilizadas con FT, se encontró que el número de linfoblastos y de células plasmáticas aumentaba después del tratamiento, evidenciando así que el FT estimula la linfopoiesis (Chivinda et al., 2000). 16

25 II JUSTIFICACIÓN Los EDL se han utilizado los últimos 30 años como agentes terapéuticos obteniendo buenos resultados en diferentes patologías, sin embargo a pesar de múltiples investigaciones aún no se conocen bien sus mecanismos de acción por lo que es importante investigar en detalle cuáles son las poblaciones celulares que se activan, qué citocinas se regulan y si la respuesta inmune humoral se altera ó no después de su administración. III HIPOTESIS El EDL estimula de forma diferencial a las poblaciones celulares de los ganglios, especialmente los regionales al sitio de inoculación, induciendo en ellas la activación y producción de diferentes citocinas y la cooperación para la producción de anticuerpos. IV OBJETIVO GENERAL Caracterizar la respuesta inmune humoral contra OVA en ratones BALB/c retados con OVA y/o EDL específico para OVA. 17

26 V OBJETIVOS PARTICULARES Obtener EDL a partir de ratones BALB/c sanos (EDL) y de ratones inmunizados con ovoalbúmina (EDL OVA ), EDL específico Evaluar la transferencia de respuesta celular (DTH) anti-ova a las 24 y 48h en ratones BALB/c estimulados con EDL y EDL OVA Identificar si la administración de EDL y EDL OVA modifica la cinética de producción de anticuerpos en respuesta primaria y/o secundaria Analizar las poblaciones celulares del ganglio regional (linfocitos T, linfocitos B, macrófagos, células dendríticas y células plasmáticas) de ratones BALB/c estimulados con EDL y EDL OVA, en los días donde se observa un pico de producción de anticuerpos Analizar las poblaciones celulares en sangre periférica (linfocitos T, linfocitos B, macrófagos, células dendríticas y células plasmáticas) de ratones BALB/c estimulados con EDL y EDL OVA, en los días donde se observa un pico de producción de anticuerpos Identificar las poblaciones de linfocitos B, plasmablastos y células plasmáticas de la médula ósea de ratones BALB/c estimulados con EDL y EDL OVA, en los días donde se observa un pico de producción de anticuerpos 18

27 VI MATERIAL Y MÉTODOS a) Obtención de EDL Un grupo de 15 ratones BALB/c de 6 semanas de edad, se sacrificaron para extraerles los bazos; se disgregó el tejido en Hanks 1x (Gibco, Grand Island, NY), con ayuda de una malla de Nylon de 70µm, esteril (BD Falcon) un émbolo de jeringa y después se procedió a lisar las células con diez ciclos de congelamiento (-70 C) y descongelamiento (37 C); el lisado se dializó posteriormente, empleando una membrana de corte molecular de Da. Finalmente se liofilizó el dializado, obteniendo así EDL no específico (figura 4); cuantificando la concentración de péptidos de este por el método del ácido bicinconinico, la cual fue de 500 µg/ml. BALB/c bazo Ciclos de congelamiento y descongelamiento Dialisis <12 KDa DLE FIGURA 4. Obtención de EDL no específico b) Obtención de EDL específico (EDL OVA ) Para la obtención del EDL específico para ovoalbúmina (EDL ova ) un grupo de 10 ratones se inmunizó vía subcutánea con 20 µg de OVA (Sigma, St. Louis, MO) y adyuvante incompleto de Freund, el día cero y 14, se les realizó una prueba de DTH al final del esquema de inmunización, se sacrificaron y extrajeron los bazos de los animales que 1

28 dieron DTH positiva a OVA para obtener el EDL; la obtención de realizó de la misma forma que en el paso anterior. Se cuantificó la concentración de péptidos de este por el método del ácido bicinconinico, la cual fue de a 100 µg/ml. c) Prueba de DTH (Hipersensibilidad cutánea retardada) Se formaron 4 grupos de 10 ratones cada uno, se trataron como se describe a continuación y en el cuadro 1: 1) Testigo negativo (Solución Salina) 2) Testigo positivo (OVA) 3) EDL OVA (Extracto Dializable Leucocitario específico para OVA) 4) EDL (Extracto Dializable Leucocitario) Grupo Tratamiento Reto 1)Testigo negativo SS día cero y 14 con adyuvante incompleto OVA en cojinete plantar, día 15 de Freund 2)Testigo positivo OVA día cero y 14 con adyuvante incompleto OVA en cojinete plantar, día 15 de Freund 3) EDL OVA EDL OVA día 12 OVA en cojinete plantar, día 15 4) EDL EDL día 12 OVA en cojinete plantar, día 15 Tabla 1. Esquema de inmunización para prueba de DTH 20

29 Para el grupo de OVA primero se realizó un esquema de inmunización 14 días antes de realizar la prueba de DTH; este esquema consistió en inmunizar el día cero con 20 μg de OVA y adyuvante incompleto de Freund vía subcutánea en la base de la cola, al día 7 se dio un refuerzo sólo con 20 μg de OVA y otro más el día 14; una vez completado este esquema de inmunización al siguiente día se realizó la prueba de DTH. Para los grupos de EDL y EDL OVA se aplicó a cada grupo 20μg de EDL y EDL OVA respectivamente, vía subcutánea en la base de la cola; ésto se realizó 72 h antes de realizar la prueba de DTH. El grupo de solución salina siguió el mismo esquema de inmunización que el grupo de OVA, al día cero recibió SS y adyuvante incompleto de Freund, en los días 7 y 14 solo SS (figura 5). OVA OVA OVA Lectura del grosor del cojinete plantar días post-inmunización EDL OVA EDL Reto en el cojinete plantar para todos los grupos FIGURA 5. Esquema de inmunización y prueba de DTH NOTA: todos los ensayos de DTH se realizaron en las patas traseras Para la lectura de la prueba de DTH, se obtuvo una lectura basal, se midieron el grosor de los cojinetes plantares, tanto de la pata derecha como la pata izquierda de cada uno de los ratones de todos los grupos, posteriormente se inocularon 20 μl de SS en la pata izquierda de cada 21

30 ratón de todos los grupos, como un control de inflamación; en la pata derecha de cada uno de los ratones de todos los grupos se inocularon 20μl OVA a una concentración de 1μg/μl. A las 24 h se tomó la primera lectura del grosor del cojinete plantar tanto de la pata derecha como de la pata izquierda, la segunda lectura se tomó a las 48 h. Para realizar la comparación en el cambio del grosor del cojinete plantar de cada grupo, se restó el valor de la pata izquierda (SS) al valor de la pata derecha (OVA) de cada ratón en cada una de las lecturas, para comparar este valor con el basal y obtener así la variación del grosor del cojinete plantar; los datos se graficaron como deltas (diferencias). d) Esquema de Inmunización con OVA, EDL OVA y EDL Se inmunizaron 6 diferentes grupos de 10 ratones BALB/c, de 6 semanas de edad, utilizamos como antígeno OVA, EDL OVA y EDL; el esquema de inmunización para OVA fue los días cero y catorce por vía subcutánea con adyuvante incompleto de Freund, para EDL y EDL OVA los días 14, 21 y 28, se tomaron muestras de suero los días 0, 3, 5, 7, 11, 13, 16, 1, 23, 26, 30, 33 y 36. Los sueros se almacenaron a -20 C para su posterior determinación de IgG e IgM específicas para OVA. figura 6: Los grupos se trataron como se describe a continuación y en la 1) OVA con adyuvante incompleto de Freund día cero y día 14 con OVA 22

31 2) OVA con adyuvante incompleto de Freund día cero, día 14, 21 y 28 con EDL OVA 3) OVA con adyuvante incompleto de Freund día cero, día 14, 21 y 28 con EDL 4) OVA con adyuvante incompleto de Freund día cero y día 14 SS 5) EDL OVA día cero y día 14 SS 6) EDL día cero y día 14 SS 7) SS con adyuvante incompleto de Freund y día 14 con SS Muestras de suero cuantificar IgM e IgG específicas para OVA días post-inmunización 1.-OVA OVA 2.-OVA EDL OVA EDL OVA EDL OVA 3.-OVA EDL EDL EDL 4.-OVA SS 5.-EDL OVA SS 6.-EDL SS FIGURA 6. Esquema de Inmunización de ratones BALB/c e) Determinación de anticuerpos contra OVA A los sueros obtenidos se les realizó la determinación de inmunoglobulinas por ELISA para IgM, e IgG total y se realizó de la siguiente manera: 1.- Se adicionó OVA a una concentración de 0.5µg/100µl diluida en regulador de carbonatos a cada pozo de una placa de poliestireno de fondo plano de 6 pozos (maxisorb), se incubó a 4 C por 24 h, para la adsorción del antígeno a la fase sólida, protegida con su tapa. 23

32 2.- Pasada la incubación se eliminó el volumen de la placa por inversión y se desechó el líquido remanente sacudiendo la placa sobre un papel absorbente. 3.- Se lavaron los pozos con 150µl de PBS-Tween 20 (PBST), se dejaron los pozos con el regulador de lavado en reposo durante 3 min, al termino de este tiempo, se eliminó la solución por inversión como en el paso anterior y se repitió el proceso de lavado 2 veces más. 4.- Se agregaron 100µl de regulador de bloqueo (PBST-leche) a todos los pozos y se incubó a 37 C durante 45 min. 5.- Terminada la incubación se lavaron los pozos de la misma manera que en el paso Se adicionaron los sueros de los ratones, así como los controles, diluidos en PBST-leche, se incubaron a 37 C durante 45 min. 7.- Se realizaron los lavados de la misma forma que en el paso Se adicionó el conjugado (IgG de cabra ant-igg de ratón, marcada con peroxidasa ó IgG de cabra ant-igm de ratón) diluido en PBST-leche, se incubo a 37 C durante 45 min..- Se lavaron los pozos como se realizó en el paso Se adicionaron 100µl del sustrato de la enzima TMB (BIO-RAD) incubar a temperatura ambiente en la obscuridad durante 15 min 11.- Detener la reacción enzimática adicionando 100µl de ácido sulfurico 8N a cada pozo. Posteriormente se leyó la absorbancia a 450 nm en un espectofotómetro. f) Técnica de Western Blot Se realizó la técnica de Western Blot revelando con los sueros de los ratones inmunizados con EDL ova de la siguiente manera: 24

33 Electroforesis SDS-PAGE: 1.- Se preparó un gel de poliacrilamida al 10% y otro al 15%, primero se montó la cámara y se le agregó agua para comprobar que estaba perfectamente sellada. Se preparó un gel de corrimiento al 10% con 8.3 ml de una mezcla al 30% de Acrilamida/Bisacrilamida,. ml de agua destilada. 6.3 ml de Tris 1.5M (ph 8.8), 0.25 ml de SDS y 0.25 ml de APS y 10 μl de TEMED; una vez mezclados todos los reactivos se llenó la cámara dejando un espacio para el gel concentrador y el peine, se colocó butanol en la parte superior y se dejo polimerizar. Se preparó un gel concentrador con 0.83 ml de una mezcla al 30% de Acrilamida/Bisacrilamida, 3.4 ml de agua destilada ml de Tris 1M (ph 6.8), 50 μl de SDS y 50 μl de persulfato de amonio al 10% (APS) y 5 μl de TEMED; una vez gelificado el gel de corrimiento, se eliminó el butanol, y se lavó con agua destilada, hasta que se eliminó todo el butanol y se llenó la cámara con el gel concentrador y se puso el peine. Para el gel al 15% lo único que cambió fueron los volúmenes de la mezcla de Acrilamida/Bisacrilamida, que fue de 10 ml y el volumen del agua, que fue de 8.3, todo lo demás es igual que lo anterior. 2.- La muestra se diluyó volumen a volumen en regulador de muestra con SDS al 10% y ditiotreitol 1M (DTT), se hirvieron en baño maría durante 5 min, y se colocaron en el gel; en el primer pozo se colocó el marcador de peso molecular y posteriormente las muestras. 3.- El gel se corrió a 30 ma con regulador de corrimiento 1X y SDS al 10%, hasta que el frente de corrimiento llegara hasta el final del gel. 4.- Se sacó el gel y se colocó en una charola que contenía regulador de transferencia y se colocó a manera de sándwich entre papel filtro cortado a la medida del gel y una membrana de nitrocelulosa (3 papeles 25

34 filtro-gel-membrana de notrocelulosa-3 papeles filtro), se colocó dentro del cassete de transferencia y se cerró. 5.- El cassete se colocó dentro de la tina de transferencia de forma que la nitrocelulosa quedará en el polo positivo y el gel en el polo negativo; se realizó la transferencia a 60V durante 2h. 6.- Transcurrido el tiempo se sacó la membrana y se tiñó con una solución de rojo de Punceao por 10 min, para verificar que las proteínas fueron transferidas, se destiñó con agua destilada y se dejó secar. Western Blot 1.-Se marcó la membrana con un lápiz para identificar la parte superior y se separó el marcador de peso molecular. 2.- Se colocó la membrana en una charola y se adicionó solución de bloqueo (PBST) hasta cubrir bien la membrana y se dejó en agitación durante 1 h. 3.- Se diluyó el suero de los ratones inmunizados con EDL ova 1:100 en solución dilutora (PBST) y se colocó en la membrana una vez pasada la incubación del bloqueo, se dejó toda la noche a -4 C. 4.- Se lavó 10 veces con PBST y después se lavó 5 veces con PBS1x. 5.- Se colocó como anticuerpo secundario IgG de cabra peroxidado subclases 1, 2a, 2b y 3, en una dilución 1:1000 en solución dilutora y se incubó a 37 C durante 1h. 6.- Se lavó 10 veces con PBST y después se lavó 7 veces con PBS1x. 7.- Se adicionó solución reveladora (3 amino, etil carbazolona y N,N dimetilformamida), se dejó actuar por 10 min en oscuridad, transcurrido el tiempo se destiñe con agua destilada. 26

35 g) Formación de Centros Germinales Se inmunizaron diferentes grupos de ratones, en la zona inguinal, vía subcutánea con 20µg de OVA, EDL OVA y EDL como control de la inmunización se utilizó SS; al día 14 se les realizó un reto con el mismo tratamiento para unos grupos y para otros combinados, como se muestra a continuación: 1.- SS-SS 2.- OVA-OVA 3.- EDL ova -EDL ova 4.- EDL-EDL 5.- OVA-EDL ova 6.- OVA-EDL Se sacrificaron 3 ratones de cada grupo los días, 15 y 23 postinmunización y se les extrajeron los ganglios inguinales, se tomaron fotos de los ganglios en cada uno de los tiempos, se peso cada uno de los ganglios, se colocaron en un medio de congelación (Tissue-TEK) a -20 C. Se realizaron cortes de 7µm de los ganglios en un criostato a -23 C, las laminillas se guardaron a -20 C hasta su uso, se les realizó una tinción de inmunohistoquímica para observar la presencia de linfocitos B en los centros germinales (células positivas a la aglutinina de cacahuate, PNA), y de linfocitos T (células THY-1) la inmunohistoquímica se realizó de la siguiente manera: 1.- Incubar las laminillas a T ambiente (T amb) durante 20 min inmediatamente después de descongelar. 2.- Delimitar e incubar a T amb durante 1 hora con H 2 O 2 al % en PBS 1x con 0.1% de azida de sodio. 27

36 3.- Lavar al menos 3 veces con BSA (albúmina bovina) al 0.2% en PBS 1x, cada lavado 10 min. 4.- Incubar a 34 C durante 20 min con bloqueador universal diluído 1: Decantar y eliminar el exceso de la incubación anterior sobre papel absorbente, e incubar a T amb durante 1 hora con suero humano al 2% en BSA al 1% en PBS 1x ph Decantar y eliminar el exceso de la incubación anterior e incubar el anticuerpo primario biotinado en la dilución correspondiente en BSA al 1% con suero humano al 2% (CD40-L, PNA, control de isotipo), a T amb durante 1 hora o toda la noche a 4 C. 7.- Lavar al menos 3 veces con BSA al 0.2% en PBS 1x, cada lavado 10 min. 8.- Incubar a T amb durante 20 min con Streptoavidina-peroxidada..- Lavar 3 veces con BSA al 0.2% en PBS 1x, cada lavado 10 min Revelar al microscopio, con Azul-gris y detener la reacción con BSA al 2% Dejar las laminillas durante 10 min en BSA Incubar a 34 C durante 20 min con H 2 O 2 al % en PBS 1x con 0.1% de azida de sodio, solo los cortes que llevan doble marcaje, para los cortes que ya no llevan un 2do anticuerpo se incuban con BSA al 2% Decantar y eliminar el exceso de la incubación anterior e incubar con el segundo anticuerpo en la dilución correspondiente en BSA al 1% con suero humano al 2% (THY-1, control de isotipo), a T amb durante 1 hora o toda la noche a 4 C Lavar al menos 3 veces con BSA al 0.2% en PBS 1x, cada lavado 10 min Incubar a T amb durante 1 hora con un anticuerpo peroxidado ( Rata-POX) ó con Streptoavidina-peroxidada, según sea el caso Lavar al menos 3 veces con BSA al 0.2% en PBS 1x, cada lavado 10 min. 28