T E S I S INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN POSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS Mecanismos de Resistencia a carbapenemes en cepas de Acinetobacter baumannii causantes de infecciones intrahospitalarias T E S I S QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRIA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS Presenta: Q.F.B. María Inés González Chávez Directoras: Dra. María Dolores Alcántar Curiel Dra. Silvia Giono Cerezo México, D.F. Noviembre, 2010

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4 Este trabajo se realizó en el: Laboratorio de Infectología, Microbiología e Inmunología Clínica del Departamento de Medicina Experimental de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México y en el Laboratorio de Bacteriología Médica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Bajo la dirección de: Dra. María Dolores Alcántar Curiel Dra. Silvia Giono Cerezo El presente trabajo formó parte de los proyectos: SIP-IPN : Helicobacter pylori icea, hopz, triple virulentas, zona de plasticidad, adherencia, sstiv, tsfiv, tfs3e inflamación Hap y autofagia en Hi. Biofilm en bacterias Gram positivas y negativas resistentes, causantes de infecciones intrahospitalarias. UNAM. Proyecto PAPIIT No. IN Frecuencia, epidemiología y bases moleculares de la resistencia a carbapenemes en Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp. Causantes de infecciones nosocomiales en instituciones hospitalarias en México. Agradezco el apoyo recibido del sistema de becas Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) /

5 DEDICATORIAS: A Dios: Por su amor de todos, todos, todos los días. A Amore: Por tu apoyo constante en todo momento. Te amo. A mis padres: Reyna y Juan Con amor y gratitud inmensa, por su ejemplo de lucha, responsabilidad, constancia y esfuerzo por lograr todo lo que se proponen, por enseñarme a ser autónoma, por su apoyo incondicional; por darme la vida. Los amo. A mis hermanos: Abi, Rica, Cecy y Santos Por acompañarnos, siempre unidos

6 AGRADECIMIENTOS La gratitud es la memoria del corazón. ANONIMO Es la ocasión especial para expresar mi gratitud a todas las personas que contribuyeron a mi formación, incluso sin desearlo. De manera muy especial a la Dra. María Dolores Alcántar Curiel por su tolerancia, paciencia, confianza y apoyo constantes en la elaboración de este trabajo. A la Dra. Silvia Giono Cerezo que creyó y confió en mí desde el día número uno de conocerla. Al Dr. Gerardo Zúñiga por su tolerancia, comprensión, paciencia y apoyo, siempre amable y empático. A la Dra: Graciela Castro Escarpulli; por sus comentarios constructivos, su apoyo, y su compromiso. En todo momento siempre me sentí apoyada por usted y sus alumnos: Gracias; Cecy, Carlos, Juan, Erika, Ana. A la Dra Noris Pavia, Dra Wong, Dr, Ignacio Santos, QFB. Catalina Gayosso, QFB. Lolita Jarillo, M en C. Araceli Pérez (Muchas gracias Chely, eres un gran modelo a seguir), M en C. Miguel, M en C. José Luis Fernández, Marco Gudiño, por compartir en el laboratorio estos dos años y medio de mi proyecto, por sus consejos, sugerencias y apoyo. Muchas gracias. A Adriana, Rocío, Nancy y Gina por compartir y apoyarme. Al Dr. Augusto por su amabilidad y su disposición para apoyarme. A mis compañeros y amigos de trayecto: Sandy, Flor, Carlos, Violeta, Norma, Argelia, Lupita, Chayo, Juan, Álvaro, Gabriel, Rodrigo, José Luis... A Araceli González por su amabilidad, apoyo y paciencia. A mi maestra: Silvia Moreno Bravo por su aprecio y cariño constante de todos estos años. A mi madrina Candelaria Vidal Carrillo por su amor y apoyo. A todas mis compañeras de CEDHAT, AC. Estar con ustedes todo este tiempo es un gran apoyo para mi vida. De manera muy especial a la M. Lucy Gutiérrez, Diana Sánchez y Martha Ramírez. A mi amigas Lety y Michelle. Las quiero mucho. A todos mis amigos por compartir y dejarme compartir la vida

7 Agradezco a mis directoras de tesis y a los sinodales por sus sugerencias y el tiempo que dedicaron a la revisión y corrección de la misma. Dra. Graciela Castro Escarpulli Dr. Gerardo Zúñiga Bermúdez Dr. Cesar Hugo Hernández Rodríguez Dra. Ethel Awilda García Latorre Dra. Silvia Giono Cerezo Dra. María Dolores Alcántar Curiel

8 ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL Contenido Página ÍNDICE GENERAL... i ÍNDICE DE FIGURAS.. ÍNDICE DE CUADROS. ÍNDICE DE ABREVIATURAS. RESUMEN.. ABSTRACT. I. INTRODUCCIÓN 1.1 Infecciones intrahospitalarias (IIH) 1.2. Generalidades de A. baumannii 1.3. Mecanismos de acción a los antimicrobianos 1.4. Resistencia a los antibióticos Transmisión de la resistencia Mecanismos de resistencia a carbapenemes β-lactamasas Proteínas de membrana externa: Porinas Sistema de bombas de eflujo Modificación de Proteínas de unión a penicilinas (PBPs) JUSTIFICACIÓN HIPÓTESIS. OBJETIVO GENERAL Y PARTICULARES. II. MATERIAL Y MÉTODOS Diagrama general de trabajo Selección de la muestra Pruebas para la identificación de A. baumannii Crecimiento a diversas temperaturas 37, 41 y 44 C 2.4. Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana a carbapenemes Detección fenotípica de producción de Métalo-β-lactamasas.. a) Prueba de E-test-IPM en cepas Imipenem resistentes b) Prueba de doble disco (MEM-EDTA) en cepas MEM resistentes 2.6. Extracción de DNA total Detección del gen bla IMP asociado a la resistencia a los carbapenemes ii iii iv v vi Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias i

9 ÍNDICE GENERAL Detección del gen bla VIM asociado a la resistencia a carbapenemes Detección del gen bla OXA-24 asociado a la resistencia a los carbapenemes Prueba de isoelectroenfoque para la determinación del punto isoeléctrico de la β-lactamasa... OXA-24 y ensayo de su actividad biológica con Imipenem Extracción de proteínas de membrana externa: porinas Identificación de la sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC asociada a la resistencia a Meropenem Construcción del dendrograma.. III. RESULTADOS Identificación de cepas de A. baumannii 3.2. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos Pruebas de detección fenotípica de la producción de Métalo-β-lactamasas Detección de genes que codifican β-lactamasas tipo B y D relacionadas con la resistencia a carbapenemes Detección del gen bla IMP Detección del gen bla VIM Detección del gen bla OXA Detección de OXA-24 por isoelectroenfoque y prueba biológica con Imipenem Extracción de proteínas de membrana externa (OMPs): porinas 3.7. Sobreexpresión de bombas de eflujo AdeABC asociada a la resistencia a Meropenem 3.8. Relación entre clonas de A. baumannii resistentes a carbapenemes: su fenotipo, genotipo y epidemiología IV. DISCUSIÓN V. CONCLUSIONES VI. PROSPECTIVAS VII. REFERENCIAS.. 60 VIII. ANEXOS. 69 Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias i

10 ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE FIGURAS No. de fígura Título Página 1 Estructura química de los carbapenemes 6 2 Modelo de transferencia de mecanismos de resistencia 8 3 Distribución geográfica y caracterización genética de A. baumannii carbapenemresistente 13 4 Representación esquemática de las distintas bombas de expulsión involucradas en la 16 multirresistencia 5 Diagrama general de trabajo 21 6 Producción de Métalo- β-lactamasas (MBLs) por la prueba de E-test-IPM 23 7 Susceptibilidad a los carbapenemes 31 8 Corrimiento electroforético en gel de agarosa al 1% del amplicón del gen bla IMP 36 9 Corrimiento electroforético en gel de agarosa al 1% del amplicón gen bla VIM Corrimiento electroforético en gel de agarosa al 1% del amplicón del gen bla OXA Producción de carbapenemasas en cepas de A. baumannii resistentes a uno o ambos 38 carbapenemes 12 Detección de OXA-24 por Isoelectroenfoque y prueba de la actividad biológica de 39 OXA-24 con Imipenem. 13 Perfil electroforético de proteínas de membrana externa (porinas) en cepas de 40 A. baumannii 14 Sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC asociada a la resistencia a Meropenem Dendrograma de 47 cepas de A. baumannii resistentes a uno o ambos 44 carbapenemes Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias ii

11 ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE CUADROS No. de cuadro Título Página 1 Mecanismos de resistencia a carbapenemes en A. baumannii 9 2 Esquema de clasificación de β-lactamasas propuesto por Bush, Jacoby & Medeiros Subgrupos de carbapenemasas de la familia OXA β-lactamasas 14 4 Crecimiento a diversas temperaturas y uso de malonato en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias del Hospital Civil de Guadalajara, México 30 5 Susceptibilidad a antimicrobianos en 47 cepas de A. baumannii resistentes a carbapenemes 32 6 Producción de MBLs en 12 cepas de A. baumannii resistentes a Imipenem y Meropenem 7 Producción de MBLs en 27/35 cepas de A. baumannii resistentes a Meropenem Total de cepas de A. baumannii con caracteristicas epidemiológicas, fenotípicas y genotípicas 42 Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias iii

12 ÍNDICE DE ABREVIATURAS ÍNDICE DE ABREVIATURAS ATCC ATP BLAST CLSI EDTA IEF IIH IPM, IP LB MBLs MDR MEM MIC NMP OMPs PaβN PBP PFGE pi RHOVE UCI UPGMA del inglés: American Type Culture Collection Adenosin Trifosfato del inglés: Basic Local Alignement Search Tool del inglés: Clinical and Laboratory Standards Institute Acido Etilendiaminotetracético Isoelectroenfoque Infecciones intrahospitalarias Imipenem Luria Bertani Métalo-β-lactamasas Multidrogorresistencia Meropenem Concentración Mínima Inhibitoria 1-1-Naphthymethyl- piperazina Proteínas de membrana externa del inglés: Phenyl -Arginine β- Naphthylamida Proteínas de unión a penicilina del inglés: Pulsed Field Gel Electroforesis Punto Isoeléctrico Red Hospitalaria de Vigilancia epidemiológica Unidad de Cuidados Intensivos del inglés: Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Average Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias iv

13 RESUMEN Resumen Acinetobacter baumannii es un patógeno oportunista causante de infecciones intrahospitalarias. Esta bacteria desarrolla resistencia a casi todos los grupos de antibióticos, incluyendo carbapenemes. Se estudiaron diferentes mecanismos de resistencia a carbapenemes en 47 cepas de A.baumannii causantes de infecciones intrahospitalarias aisladas del Hospital Civil Guadalajara, México en el período Esto permitirá contribuir a un mejor manejo del problema de la multidrogorresistencia en México. De 98 cepas de A. baumannii, 47 (47.9%) fueron resistentes a uno o ambos carbapenemes, 12/47 (25.5%) resistentes a Imipenem (IPM) y Meropenem (MEM) y 35/47 (74.4%) resistentes a MEM. Empleando E-Test- IPM y doble disco con MEM se demostró que 39/47 (82.9%) de la cepas produjeron Metalo-β-lactamasas (MBLs) y 8/47 (17.02%) no las produjeron. Se detectaron genes que codifican para β- lactamasas: 7/47 (14.8%) cepas presentaron bla IMP y bla OXA-24, 7/47(14.8%) bla VIM-4. y 5/47 (10.63%) bla OXA-24. El punto isoeléctrico (pi) de la OXA-24 fue de 9.0 y la prueba biológica con Imipenem demostró la presencia de dicha enzima. Utilizando inhibidores de bombas de eflujo se identificó a la bomba AdeABC empleando discos de Meropenem, 10/47 (21.2%) cepas probadas con ambos inhibidores presentaron la bomba. Se determinó el número de clonas de las cepas de Acinetobacter baumannii por Electroforesis en Gel de Campos Pulsados (PFGE), detectándose dos brotes ocasionados por las clonas 11 y 13. La extracción de Proteínas de membrana externa (porinas) de cepas, resistentes a IPM y MEM, no mostró la expresión de porinas de 22, 29 y 43 kda. El mecanismo de resistencia principal encontrado en estas cepas fue la producción de MBLs. Algunas de estas cepas presentaron otros mecanismos de resistencia como la sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC, pérdida en la expresión de porinas y producción de OXA-24. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias v

14 ABSTRACT Abstract Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen causing nosocomial infections. This bacteria developed resistance to almost all groups of antibiotics, including carbapenems. We studied different carbapenem resistance mechanisms in 47 strains of A. baumannii causing nosocomial infections isolated from Civil Hospital Guadalajara, Mexico in This will help better manage the problem of multidrug resistance in Mexico. Of 98 strains of A. baumannii, 47 (47.9%) were resistant to one or both carbapenems, 12/47 (25.5%) were resistant to Imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and 35/47 (74.4%) to MEM. Using E-Test-IPM and MEM double disc showed that 39/47 (82.9%) of the strains produced Metallo-β-lactamases (MBLs) and 8 / 47 (17.02%) are not produced. Genes were detected encoding β-lactamases: 7 / 47 (14.8%) isolates had bla IMP and bla OXA-24, 7 / 47 (14.8%) bla VIM-4. and 5 / 47 (10.63%) bla OXA-24. The isoelectric point (pi) of the OXA-24 was 9.0 and the biological test with imipenem showed the presence of the enzyme. Using inhibitors of efflux pumps were identified using the pump AdeABC meropenem discs, 10/47 (21.2%) strains tested with both inhibitors had the pump. We determined the number of clones of Acinetobacter baumannii by electrophoresis pulsed field gel electrophoresis (PFGE), we detected two outbreaks caused by clones 11 and 13. Extraction of outer membrane proteins (porins) of strains resistant to IPM and MEM, showed no expression of porins, 22, 29 and 43 kda. The main resistance mechanism found in these strains was the production of MBLs. Some of these isolates had other resistance mechanisms such as overexpression of efflux pump AdeABC, loss of porin expression and production of OXA-24. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias vi

15 INTRODUCCIÓN I. INTRODUCCIÓN La falla terapéutica en las infecciones nosocomiales se debe en gran medida al uso indiscriminado de los antibióticos para tratar pacientes con infecciones bacterianas, esto ha ocasionado el surgimiento de bacterias resistentes a esos antibióticos. Los antibióticos estan dirigidos a inhibir el crecimiento bacteriano ya sea a nivel de la replicación del DNA, la transcripción del RNA, síntesis de proteínas o pared celular. Esto se logra mediante la inhibición específica en ciertas enzimas o estructuras bacterianas involucradas en estos procesos. Los antibióticos β-lactámicos que incluyen a los Carbapenemes inhiben la síntesis de la pared celular, las transpeptidasas o proteínas de unión a la penicilina (PBP) (Silva, 2006). Debido al uso de los diferentes antibióticos se han seleccionado bacterias resistentes y se debe a cuatro principales causas: 1) modificación del sitio blanco (PBPs), 2) producción de enzimas que hidrolizan el antibiótico, 3) no expresión de porinas y 4) sobreexpresión de bombas de eflujo. En general los genes que confieren resistencia pueden estar localizados en el genóforo bacteriano (cromosómico) y en elementos genéticos móviles como plásmidos, transposones o integrones. La diseminación de estos genes puede ser mediante la transformación, transducción o conjugación bacteriana. La exposición al antibiótico selecciona a las bacterias que adquirieron la resistencia permitiéndoles desarrollarse de forma preferente de aquellas que no lo adquirieron. De aquí la importancia de dar tratamiento específico después de realizar la identificación de la bacteria, de conocer su patrón de susceptibilidad antimicrobiana y por parte del paciente, adherirse en forma estricta a las recomendaciones del tratamiento en cantidad, horario y duración (Silva, 2006). 1.1 Infecciones Intrahospitalarias Las infecciones intrahospitalarias (IIH) o también llamadas nosocomiales son un problema de Salud Pública grave debido a que generan más días-cama y un gasto económico elevado tanto para el paciente como para el hospital. Estas infecciones se presentan cuando el agente infeccioso o su toxina no estaban presentes o en período de incubación en el momento del ingreso hospitalario y por lo tanto; se adquiere durante la hospitalización o 72 h después de su ingreso como consecuencia de un procedimiento médico, manifestándose en el tiempo de interacción o después del egreso del paciente (NOM-026-SSA2-1998). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 1

16 INTRODUCCIÓN Epidemiología de las IIH Se estima que en el mundo cada año 1.4 millones de personas desarrolla este tipo de infecciones y que 1:4 pacientes que se encuentran en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) las presentan, esto debido a que en esa área hospitalaria se utilizan técnicas invasivas y procedimientos médicos que crean posibles vías de infección (Ducel y cols, 2003). En México, el problema de las IIH ha pasado desapercibido o se subestima. Los Programas de Vigilancia informan que por cada 100 egresos de los centros hospitalarios de tercer nivel, pacientes cursan con IIH (De León y Soto, 1996). La Red Hospitalaria de Vigilancia Epidemiológica en México (RHOVE) en el 2009, informó que estas infecciones son la tercera causa de morbilidad y mortalidad y que su registro va desde un 14 al 45%. Las IIH son producidas por agentes que tienen una elevada resistencia a los antibióticos y el uso irracional de estos ha provocado que su uso sea ineficiente (RHOVE, 2009). Microorganismos implicados en las IIH Los microorganismos más frecuentes involucrados en las IIH son generalmente bacterias Gram negativas, entre las que se encuentran: Escherichia coli, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae y Acinetobacter baumannii. Dentro de los microorganismos Gram positivos el más importante es Staphylococcus aureus y entre los hongos Candida albicans. Las IIH causadas por A. baummannii, se encuentran en el décimo lugar en Latinoamérica (Sader y Jones, 2004). Estudios recientes realizados en Guadalajara, México, describen a S. aureus como el primer agente causal de IIH, seguido de E. coli y P. aeruginosa y en cuarto lugar a A. baumannii con un 40% de resistencia a meropenem (Guzmán y cols 2009). 1.2 Generalidades de A. baumannii Características morfológicas El género Acinetobacter son bacilos cortos Gram negativos, aerobios estrictos, oxidasa negativo, no móviles, usualmente nitrato negativo, no fermentador de la glucosa, catalasa positiva. Miden de μm por μm y se agrupan a veces en pares. En algunos frotes de cultivo de sangre, aparecen como cocos Gram positivos; sin embargo, la forma de bacilo corto es la predominante en la fase del crecimiento estacionario. En medios sólidos, las colonias son lisas, translúcidas y más pequeñas que los miembros de la familia Enterobacteriaceae, miden de 2-3 mm de diámetro después de 18 a 24 h de incubación. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 2

17 INTRODUCCIÓN Acinetobacter spp. crecen bien en agar MacConkey, el color de las colonias es rosáceo. También crecen bien en gelosa sangre, Acinetobacter spp. oxida la glucosa y produce un pigmento marrón en agar infusión cerebro y corazón (BHI) con tirosina, en gelosa sangre adicionando glucosa en agar Mueller Hinton y en gelosa MacConkey (Schreckenberger y cols., 2003; Da Costa y cols, 2005). Estudios de hibridación DNA-DNA realizados por Bouvet y Grimont en 1986 han permitido clasificar al género Acinetobacter en 10 genoespecies (Schreckenberger y cols., 2003). Actualmente se incluyen 31 genoespecies, siendo A. baumannii (genoespecie 2) la más frecuentemente aislada y con mayor importancia clínica (Lederman, 2007). Hábitat natural A. baumannii está distribuido ampliamente en la naturaleza y se puede encontrar en algunos ambientes hospitalarios, es el segundo microorganismo aislado de muestras clínicas en humanos. Sobrevive en superficies secas hasta por 25 días, forma parte de la microbiota normal en la piel de humanos, se considera un microorganismo patógeno oportunista que puede infectar a pacientes inmunocomprometidos (Diomedi, 2005). Significado clínico El género Acinetobacter tiene cuatro genoespecies de importancia clínica: A. calcoaceticus, A. genoespecies 3, A. genoespecies 13 y A. baumannii que es la genoespecie que posee mayor importancia clínica y epidemiológica (Vila, 2008). Los pacientes hospitalizados que se encuentran en mayor riesgo de adquirir infecciones por A. baumannii son aquellos que tienen su sistema inmunológico deprimido e incluye a los pacientes que han sido trasplantados, que han sufrido quemaduras, geriátricos, neonatos, pacientes que cursan con enfermedades crónicas, los que fueron sometidos a procedimientos invasivos e individuos que reciben terapia antimicrobiana de amplio espectro; estos pacientes generalmente se encuentran en las salas de terapias intensivas (ICU). Los cuadros clínicos asociados son: neumonía, bacteriemia, infecciones del tracto urinario, infecciones con líneas vasculares, úlceras por presión, etc. Estas áreas se colonizan y dan lugar a brotes epidémicos intrahospitalarios (Pérez y cols 2007). Generalmente A. baumannii es multirresistente a diversos grupos de antibióticos dentro de los cuales se encuentran los carbapenemes que son antibióticos potentes para el tratamiento de infecciones por bacterias Gram negativos (Yano y cols 2001). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 3

18 INTRODUCCIÓN 1.3 Mecanismos de acción de los antimicrobianos Para que los antimicrobianos alcancen su sitio de acción deben atravesar la cubierta bacteriana, excepto cuando el sitio de acción es la propia envoltura externa de los Gram negativos. Cuando el antimicrobiano está en el interior del microorganismo; se debe evitar su hidrólisis o su transformación en un producto inactivo y reconocer de forma efectiva un sitio de acción antes de que algún sistema de expulsión lo envie fuera de la bacteria (Calvo y Martínez-Martínez, 2009). Desde el punto de vista molecular, los antimicrobianos de uso clínico ejercen su acción en algunas de las siguientes estructuras o funciones bacterianas: 1) Inhibición de la síntesis de la pared bacteriana: Los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared necesitan que la bacteria se encuentre en crecimiento activo para ejercer su acción bactericida, requieren que el medio en que se encuentre la bacteria sea isotónico o hipotónico, lo que favorece el estallido celular cuando la pared celular pierde su estructura. La síntesis de la pared celular se desarrolla en tres etapas, sobre cada una de las cuales pueden actuar diferentes compuestos: a) la etapa citoplasmática, donde se sintetizan los precursores del peptidoglucano; b) el transporte a través de la membrana citoplasmática y c) la organización final de la estructura del peptidoglucano, que se desarrolla en la parte mas externa de la pared (Calvo y Martínez- Martínez, 2009). 2) Alteración de la membrana citoplasmática: La membrana citoplasmática es vital para todas las células, ya que interviene activamente en los procesos de difusión y transporte activo y de esta forma controla la composición del medio interno celular. Las sustancias que alteran esta estructura modifican la permeabilidad y provocan la salida de iones potasio, elementos esenciales para la vida bacteriana, o la entrada de otros que a altas concentraciones alteran el metabolismo bacteriano normal. Los antimicrobianos que actúan en esta estructura se comportan como bactericidas, incluso en bacterias en reposo y pueden tener alta toxicidad sobre las células humanas, al compartir algunos componentes de la membrana citoplasmática. A este grupo pertenecen las polimixinas, los lipopéptidos y los antibióticos poliénicos. (Calvo y Martínez- Martínez, 2009). 3) Inhibición de la síntesis de proteínas: La síntesis proteica es uno de los procesos afectados frecuentemente por la acción de los antimicrobianos y su inhibición selectiva es posible gracias a las diferencias estructurales entre los ribosomas bacterianos y eucariotas. Los aminoglucosidos y Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 4

19 INTRODUCCIÓN las tetraciclinas inhiben la síntesis de proteínas al unirse con la subunidad 30S ribosomal, el cloranfenicol y lincosamidas se unen a la subunidad 50S ribosomal. La mayoría de estos antibióticos tienen actividad bacteriostática y va a depender de las concentraciones del antimicrobiano y de los microorganismos afectados (Calvo y Martínez-Martínez, 2009). 4) Alteración del metabolismo o la estructura de los ácidos nucleícos: El genoma bacteriano contiene información para la síntesis de proteínas que se transmite a través del RNA mensajero producido a partir del molde de DNA (transcripción) y para la síntesis de RNA ribosómico que formará parte de los ribosomas bacterianos. La información del DNA debe duplicarse (replicación) cuando la bacteria se divide, para trasmitir esta información a la descendencia. La replicación y la transcripción del DNA se realizan en varias fases con la participación de diferentes enzimas y sustratos, además del DNA molde, que constituyen dianas para la acción de diversos antibióticos. Dentro de este grupo se incluyen rifamicinas y las quinolonas que actúan en enzimas y que participan en los procesos de transcripción y replicación y los nitroimidazoles que actúan directamente sobre el DNA, dañándolo (Calvo y Martínez-Martínez, 2009). Mecanismo de Acción de los Carbapenemes En 1976, se obtuvieron los carbapenemes de la tienamicina que es una sustancia antibiótica extraída de los cultivos de Streptomyces catleya, a partir de este núcleo se obtuvó por síntesis la formidoil-tienamicina con actividad antibacteriana mayor que los demás antibióticos β- lactámicos. El primer derivado que se uso fue el Imipenem en Los antibióticos carbapenémicos son los antibióticos β-lactámicos que presentan mayor espectro y actividad. Actúan como otros β-lactámicos uniéndose covalentemente a las proteínas de unión a penicilina (PBPs) PBP-2 1a y PBP-2 1b con lo que inhiben la síntesis de la pared celular y activan las autolisinas endógenas, esto genera la muerte celular. Debido a su bajo peso molecular y su estructura hidrofílica estos compuestos penetran en las bacterias Gram negativas a través de porinas. El Meropenem es más estable ante la acción enzimática. Las bacterias han creado mecanismos de resistencia contra casi todos los antibióticos incluyendo este último grupo de β- lactámicos (Betancourt y cols, 2006). En la figura 1, se muestran las estructuras químicas de los dos antimicrobianos de tipo carbapenems más empleados en la clínica. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 5

20 INTRODUCCIÓN a) Imipenem b) Meropenem Figura 1. Estructura química de los carbapenemes: a) Imipenem b) Meropenem Tomado de Betancourt, Resistencia a los antibióticos La resistencia bacteriana es la capacidad que tienen las bacterias de soportar los efectos de los antibióticos destinados a eliminarlas o inhibirlas y se han clasificado en dos tipos: resistencia intrínseca y resistencia adquirida (Silva, 2006). Resistencia Intrínseca La resistencia intrínseca es un carácter constante de todas las cepas de una misma especie bacteriana. Son las características inherentes de la bacteria que le confieren resistencia natural. A. baumannii es una bacteria muy adecuada para el intercambio genético y se encuentra entre la única clase de bacteria Gram negativa que se describe como naturalmente transformable (Pérez y cols, 2007). Se ha encontrado que la membrana externa de A. baumannii es menos permeable a los antimicrobianos que la membrana externa de E. coli. También se detectó que su coeficiente de permeabilidad a las cefalosporinas es de 2 a 7 veces menor que el que presenta P. aeruginosa para los mismos antibióticos. A. baumannii tiene un número de porinas escaso y además el poro es mucho más pequeño (Diomedi, 2005). Resistencia adquirida La resistencia adquirida es una característica propia de ciertas cepas dentro de una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio genético ha sido modificado por mutación o adquisición de genes por la transmisión horizontal de material genético extracromosómico a través de plásmidos, integrones o transposones procedente de otras bacterias (Sánchez-Garibay, Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 6

21 INTRODUCCIÓN 2007), o bien de manera vertical. De esta forma una bacteria puede adquirir la resistencia a uno o varios antibióticos sin necesidad de haber estado en contacto con estos. La resistencia adquirida es evolutiva y su frecuencia depende a menudo del uso inadecuado en tiempo y dosis de los antibióticos. En el caso de especies bacterianas numerosas y teniendo en cuenta la evolución de la resistencia adquirida, el espectro natural de actividad no es ya suficiente para guiar la elección de un tratamiento antibiótico. En ese caso, se hace indispensable el antibiograma. Uno de los mecanismos principales de resistencia a los agentes β-lactámicos es la producción de enzimas bacterianas que inactivan el antibiótico, estas enzimas se llaman β- lactamasas (Sánchez-Garibay, 2007). 1.5 Transmisión de la Resistencia Transferencia horizontal de material genético En la transferencia horizontal del material genético se comparte información genética entre los organismos que están en un mismo ambiente. Esta transferencia involucra la adquisición de elementos genéticos por interacción directa o indirecta del material entre una cepa que lo posea y otra que no (Pérez-Valdespino, 2007). Los mecanismos de transferencia horizontal en organismos procariotas que implican la adquisición de DNA son transducción, transformación y conjugación (figura 2). Estos involucran la adquisición de plásmidos, transposones y actualmente integrones (Pérez-Valdespino, 2007). Transducción: es la transferencia de genes de una bacteria a otra por medio de un bacteriófago, virus bacteriano (Towner, 2006). Transformación: es la alteración genética de una célula que resulta de la introducción y expresión de material genético externo (DNA) (Towner, 2006). Conjugación: es el proceso de transferencia de información genética desde una célula donadora a otra receptora promovido por determinados tipos de plásmidos que portan un conjunto de genes cuyos productos participan en el proceso, se requiere contacto directo entre ambas celulas con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específicas (pilus sexuales en los Gram negativos y contacto íntimo en los Gram positivos (Towner, 2006). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 7

22 INTRODUCCIÓN Elementos genéticos Figura 2. Modelo de transferencia de mecanismos de resistencia 1) Transducción 2) Conjugación 3) Transformación (Tomado de Towner, 2006). Plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben de manera independiente al DNA cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias y en algunas ocasiones en organismos eucariontes como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 Kb. El número de plásmidos, depende de su tipo, puede ser de sola una sola copia hasta algunos cientos por célula. Los plásmidos a menudo contienen genes o cassetes de genes de resistencia a los antibióticos que confiere una ventaja selectiva para la bacteria (Towner, 2006). Transposón es una secuencia de DNA capaz de replicarse e insertar una copia de si mismo en un nuevo lugar del genoma. Los transposones, son secuencias repetitivas que probablemente proceden de retrovirus ancestrales. Se han descubierto en bacterias y en células eucarióticas. Los elementos genéticos transponibles, son secuencias de DNA que tienen la propiedad de cambiar de posición dentro del genoma (Towner, 2006). Integrones son una familia de elementos genéticos potencialmente móviles capaces de integrar y expresar genes de resistencia a los antibióticos. Los integrones han sido detectados principalmente en bacilos Gram negativos fermentadores de las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae y en algunos no fermentadores como Ps. aeruginosa y A. baumannii (González y cols, 2004). 1.6 Mecanismos de Resistencia a carbapenemes Los mecanismos de resistencia a carbapenemes son: 1) modificación del antibiótico ya sea en su forma química o hidrolizándolo por medio de β-lactamasas, 2) modificación del sitio blanco mediante mutaciones espontáneas en los genes que codifican para las proteínas de unión a penicilina (PBPs), 3) cambio en la permeabilidad de la bacteria debido a la modificación de las proteínas de membrana externa (porinas) y 4) expulsión del antibiótico mediante la Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 8

23 INTRODUCCIÓN sobreproducción de bombas de eflujo, la cual impide la acción del antibiótico o su llegada al sitio blanco de la bacteria (Cuadro 1). Cuadro 1. Mecanismos de resistencia a Carbapenemes en A. baumannii Mecanismo de Resistencia β-lactamasas Tipo B Tipo D OMP (Proteínas de membrana externa) Bombas de eflujo Alteración de Proteínas de unión a penicilina (PBPs) Enzima IMP-1,2,4,5, VIM-1,2 SIM, SPM OXA-23, 24, 58, 25, 25, 27, 40, 49, 51 47,44,37,22,33, 36, 43 kda, CarO (29kDa) HMP-AB, OmpW. AdeABC Enzima ligadora de penicilina no identificada Modificado de Diomedi, 2005 y Peleg y cols., β-lactamasas. La clasificación de las β-lactamasas puede ser definida con base a dos propiedades: la funcional y la molecular. Antes de que los genes fueran clonados y secuenciados las β-lactamasas fueron analizadas bioquímicamente por el aislamiento de la proteína determinando su punto isoeléctrico; seguido por su estudio enzimático para determinar la hidrólisis del sustrato y características de inhibición (Brown y Amyes, 2005). Esta clasificación funcional dividió a las β-lactamasas en cuatro grandes grupos funcionales con múltiples subgrupos. El grupo 2 esta diferenciado con base al grupo de sustrato sobre el que actúa la enzima. En este esquema de clasificación funcional las carbapenemasas se encuentran principalmente en los grupos 2d, 2f y 3 (cuadro 2) (Bush y cols, 1995). La clasificación basada en la homología de aminoácidos ha dado como resultado 4 grandes grupos (Ambler, 1980). Las clases moleculares A, C, y D incluyen a las β-lactamasas con serina en su sitio activo, la clase molecular B, son todas las metaloenzimas con un centro activo de zinc. Las carbapenemasas son β-lactamasas con eficiencia catalítica para hidrólisis de carbapenem, tienen elevados MICs para los carbapenemes, e incluyen enzimas de clase A, B y D (Queenan y Bush, 2007). Las β-lactamasas hidrolizan el enlace amida del anillo β-lactámico inactivándolo. Al unirse al antibiótico forman un complejo reversible no covalente y el grupo ester del anillo β-lactámico es acilado por el grupo hidroxilo libre del residuo de serina, que es el sitio activo de la enzima; Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 9

24 INTRODUCCIÓN finalmente hay un proceso de hidrólisis por el cual se reactiva la enzima y libera el antibiótico inactivo (Sánchez-Garibay, 2007). Carbapenemasas tipo A: Las carbapenemasas clase A pertenecen al grupo 2f aparecen de forma esporádica en aislamientos clínicos desde que fueron descubiertas hace 20 años. Estas β-lactamasas han sido detectadas en Enterobacter cloacae, Serratia marcescens y Klebsiella ssp. y en brotes pequeños. Tres grandes familias de esta clase incluyen las enzimas NMC/IMI, SME y KPC (Cuadro 2). Cuadro 2. Esquema de clasificación de β-lactamasas propuesto por Bush, Jacoby & Medeiros 1995 Inh Inh Grupo Sustratos CM AC EDTA Enzimas representativas 1 Cefalosporinas C - - E 2, AmpC de bacilos Gram negativos 2 a Penicilinas A + - I, III de bacterias Gram positivas 2b Cefalosporinas penicilinas A + - TEM-1 TEM-2, SHV-1 2be Cefalosporinas penicilinas, cefotaxima A + - TEM-3 a TEM-26, SHV-2 a SHV-26, Klebsiella oxytoca K1 2br Penicilinas A +/- - TEM-30 a TEM-36. TCR-1 2c Pencilinas, carbencilina A + - PSE-1, PSE-3, PSE-4 2d Penicilinas cloxacilina D +/- - OXA-1 a OXA-11, PSE-2 (OXA-10) 2e Cefalosporinas A + - Cefalosporinasas inducibles a Proteus vulgaris 2f Penicilinas, cefalosporinas carbapenemes A + - NMC-A de Enterobacter cloacae, Sme- 1 de Serratia marcescens 3 4 Varios β-lactámicos y carbapenemes Penicilinas B ND L1 de Xanthomonas maltophilia, CcrA de Bacteroides fragilis Penicilinasa de Pseudomonas cepacia Modificado de Bush, Jacoby & Medeiros CM. Clase Molecular de Ambler, AC. Acido clavulánico, ND. No determinado, Inh. Inhibida por EDTA. Acido etilendiaminotetracético.tomado de Bush y cols, Todas ellas tienen la habilidad de hidrolizar a una variedad de β-lactámicos de amplio espectro, incluyendo carbapenemes, cefalosporinas, penicilinas y aztreonam y todos son inhibidos por clavulanato y tazobactam (Queenan y Bush, 2007). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 10

25 INTRODUCCIÓN Carbapenemasas tipo B ó metalo-β-lactamasas: Las metalo-β-lactamasas son metalo enzimas que requieren uno o dos iones de zinc para su actividad. Estas enzimas pueden degradar toda clase de β-lactámicos; excepto monobactámicos y son especiales para la constante y eficiente actividad de carbapenemasa. La primer metalo-βlactamasa se detectó en 1966 en Bacillus cereus cuando Sabbath y Abraham demostraron que la actividad de cefalosporinasa producida por B. cereus era inhibida por EDTA. Durante 20 años esto fue considerado como una curiosidad bioquímica, pero en 1980 éstas enzimas fueron descubiertas en gran número de cepas de P. aeruginosa, Aeromonas hydrophila y S.marcescens productoras de brotes nosocomiales (Bebrone, 2007). Clasificación de las Metalo-β-lactamasas Las β-lactamasas clase B estan clasificadas dentro de tres subclases B1, B2 y B3 con base en la alineación de su secuencia. Las Metalo -β-lactamasas pertenecientes a la subclase B1, B2 y B3 son enzimas de amplio espectro e hidrolizan varios antibióticos β-lactámicos incluyendo carbapenemes (Bebrone, 2007). Las MBLs tipo IMP se describieron en aislamientos clínicos de P. aeruginosa, S. marcescens, Klebsiella pneumoniae y Acinetobacter baumannii. Las métaloβ-lactamasas tipo VIM-1, VIM-2, SPM-1, GIM-1 son enzimas que también pertenecen a la subclase B1. Los miembros de la subclase B2 solo muestran el 11% de identidad con los miembros de la subclase B1. Esta subclase incluye enzimas producidas por diferentes especies de Aeromonas. Las métalo-β-lactamasas subclase B3 solo tienen 9 residuos conservados cuando son comparados con otras métalo- β-lactamasas. Esta subclase incluye L1 y GOB-1, son producidas por cepas clínicas de S. maltophilia (Bebrone, 2007). Mecanismo catalítico de las Metalo-β-lactamasas El ión zinc interactúa con His 116, His 118, His 196 y una molécula de agua. El zinc se comporta como un ácido de Lewis y decrementa el pk de una molécula de agua, de manera que existe como un ión hidróxido a ph neutro. Este ión realiza un ataque nucleofílico en el carbono del grupo carboxilo del anillo β-lactámico, induciendo a la formación de un intermediario tetraédrico estable. Asp 120 actúa como una base general desprotonando el grupo OH para generar un segundo intermediario tetrahédrico, el cual es también estabilizado por el zinc. En el siguiente paso Asp120 da el protón al nitrógeno del anillo β-lactámico y toma parte en la apertura del anillo (Bebrone, 2007). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 11

26 INTRODUCCIÓN Carbapenemasas Tipo OXA, Clase D. Las enzimas tipo OXA representan a una de las familias de β-lactamasas codificadas por plásmidos y actualmente se han descrito también en el cromosoma (Queenan y Bush, 2007). Estas enzimas se identifican principalmente en enterobacterias, P. aeruginosa y A. baumannii. Son funcionalmente descritas como penicilinasas capaces de hidrolizar a oxacilina y cloxacilina. En general son inhibidas pobremente por el ácido clavulánico y el EDTA. La primer β- lactamasa tipo OXA con actividad carbapenemasa fue descrita por Paton y cols en Esta enzima fue purificada de una cepa multidrogorresistente de A. baumannii que fue aislada en 1985 de un paciente en Escocia. La enzima fue llamada ARI-1 (Acinetobacter resistente a Imipenem) después fue renombrada como OXA-23. Desde 1998 las enzimas OXA han sido identificadas en especies de Acinetobacter en todo el mundo, por ejemplo: OXA-23 ha sido identificada en brotes de Acinetobacter resistentes a carbapenemes en Brasil, Korea y Tahiti (Dalla-Costa y cols., 2003; Jeon y cols., 2005; Naas y cols., 2005; Turton y cols., 2005). OXA- 24 y OXA-40 se encontraron en brotes clonales de hospitales de España y Portugal (Bou y cols., 2000; Da-Silva y cols., 2004; Lopez-Otsoa y cols., 2002). OXA-40 también fue la primer OXA reportada en los Estados Unidos (Lolans y cols., 2005). Las cepas de Acinetobacter con OXA-23 y OXA-58 causaron múltiples infecciones en militares y civiles que sirvieron en Irak y Afganistan en (Huger y cols., 2006). Actualmente hay 102 secuencias de OXA identificadas, 9 de las cuales son de espectro extendido y como mínimo 37 estan consideradas como carbapenemasas (Queenan y Bush, 2007). En el cuadro 3, se resumen los 9 principales subgrupos de carbapenemesas tipo OXA basadas en la homología de aminoácidos. Los subgrupos 1, 2 y 3 estan basados en las secuencias de OXA-23, OXA-24 y OXA-51 respectivamente. OXA-51 ha sido encontrado en todas las cepas de A. baumannii probadas y es un componente natural del cromosoma de esta especie (Queenan y Bush, 2007). La presencia de la enzima OXA-24 y OXA-58 en aislamientos responsables de brotes severos de infecciones nosocomiales de A. baumannii en hospitales de Texas, EUA, en la figura 3 se muestra la distribución geográfica de las enzimas OXA-23, OXA-24 y OXA-58 que han demostrado ser los responsables de la resistencia a carbapenemes (Castanheira y cols., 2008). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 12

27 INTRODUCCIÓN Figura 3. Distribución geográfica y caracterización genética de A. baumannii carbapenem-resistente. Países reportando brotes de A. baumannii carbapenem-resistente produciendo OXA-23 (amarillo), OXA- 24/40 (azul) y OXA-58 (rojo). Los países que han reportado brotes por A. baumannii carbapenemresistente y no han identificado enzimas tipo OXA estan indicados con color verde. La líneas verdes punteadas indican la transferencia de pacientes infectados por A. baumannii carbapenem-resistente entre diferentes países. (Tomada de Zarrilli y cols., 2009). Mecanismo catalítico de β-lactamasas tipo OXA Estas enzimas comparten características con otras serina carbapenemasas. El sustrato y la enzima forman un intermediario acil covalente que cataliza la serina con la subsecuente deacilación para producir el antibiótico inactivado e hidrolizado en la unión C-N del anillo β-lactámico. Las principales carbapenemasas tipo OXA se han dividido en subfamilias y se ha demostrado que aquellas cepas de A. baumannii que producen OXA-24 son resistentes a Imipenem (Cuadro 3). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 13

28 INTRODUCCIÓN Cuadro 3. Subgrupos de carbapenemasas de la familia OXA β-lactamasas Grupo Enzima (subfamilia) Miembros adicionales (OXA) 1 OXA-23 OXA-27, OXA-49 2 OXA-24 OXA-25, OXA-26, OXA-40, OXA-72 3 OXA-51 OXA-64 a OXA-71, OXA-75 a OXA-78, OXA-83, OXA-84, OXA-86 OXA-89, OXA-91, OXA-92, OXA- 94, OXA-95 4 OXA-58 Ninguna 5 OXA-55 OXA-SHE 6 OXA-48 OXA-54, OXA-SAR2 7 OXA-50 OXA-50ª - OXA-50d, 8 OXA-60 OXA-60ª - OXA-60d, 9 OXA-62 Ninguna Tomado de Queenan y Bush, Proteínas de Membrana Externa (OMPs): Porinas En la superficie de los procariotas Gram negativos comúnmente conocida como la envoltura celular, consiste de dos membranas, una membrana externa y una interna subyacente. La zona exterior de la membrana externa está constituida casi exclusivamente de lipopolisacárido y de proteínas asociadas, mientras que la pared interna contiene fosfolípidos además de proteínas. La pared interna de la membrana externa citoplasmática tiene un espacio periplásmico que contiene el peptidoglicano y hay una multitud de enzimas hidrolíticas y proteolíticas que tienen la función de hidrolizar tanto macromoléculas extracelulares e intracelulares, para su uso en el metabolismo celular. El peptidoglicano se une covalentemente a la membrana externa a través de lipoproteínas. La membrana externa de las bacterias Gram negativas juega un papel importante en la selección de las moléculas que llegan hasta la célula y las que se excretan en el medio ambiente. Además, pueden desempeñar un papel en la interacción con los anticuerpos y otras proteínas, así como en la interacción con otras células. Uno de las principales tipos de proteínas de la membrana externa (OMP) lo constituyen las porinas. Estas pueden atravesar la membrana externa formando canales. Estos canales tienen un diámetro distintivo que le dan a la membrana externa una función de tamizado molecular; por el cual se da el movimiento de pequeñas moléculas como algunos nutrientes y antibióticos (Kennell y cols., 1992). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 14

29 INTRODUCCIÓN Se desconoce mucha información acerca de las propiedades de OMPs, muy pocas han sido reportadas y sus funciones aún no son muy claras. La cantidad de porinas y su tamaño pueden explicar el decremento en la permeabilidad de la membrana externa en A. baumannii (menos del 5%) comparado con otras bacterias Gram negativas. Estudios recientes han demostrado que A. baumannii posee OMPs que juegan un papel muy importarte en la resistencia a los carbapenemes (Pages y James, 2008). En 2002, se demostró que la resistencia a Imipenem está asociada con la pérdida de una proteína de membrana externa de 29 kda en aislamientos clínicos de A. baumannii. Se ha descrito que A. baumannii posee una OprD homóloga a una proteína llamada D2 que involucra resistencia a carbapenemes en Ps. aeruginosa. Se ha demostrado que cepas de A. baumannii resistentes a Imipenem no expresan naturalmente la proteína OprD de 43 kda (Poirel y Nordmann, 2006). 1.9 Sistemas de bombas de eflujo. A finales de la década de 1980, se descubrieron los primeros sistemas de expulsión activa en procariotas (tanto en bacterias Gram negativas como Gram positivas). Se denomina bombas multidrogas o de eflujo a una serie de proteínas transportadoras que son capaces de expulsar de manera relativamente inespecífica, un amplio número de sustratos no relacionados estructuralmente. Las bombas de eflujo corresponden a una clase de transportadores involucrados en la captación de iones y nutrientes esenciales, excreción de productos del metabolismo bacteriano y de sustancias tóxicas, además de participar en procesos de comunicación entre células y el medio ambiente las cuales se encuentran clasificadas en cinco grandes familias. Dos de estas corresponden a las superfamilias conocidas como ABC (cassete de unión a ATP) y MFS (Superfamilia facilitadora principal). Las otras corresponden a las familias RND (División celular de resistencia a nodulación), MATE (exclusión de compuestos tóxicos y multidrogas) y SMR (resistencia a multidrogas pequeñas). Una diferencia importante entre las distintas familias corresponde a la fuente de energía que emplean para expulsar distintos sustratos. Los transportadores de la superfamilia ABC son dependientes de la hidrólisis de ATP para expulsar los distintos compuestos; en cambio, los transportadores de la familia MATE utilizan un gradiente electroquímico otorgado por Na + ó H +. Por otro lado, las bombas de eflujo pertenecientes a la superfamilia MFS y a las familias RND y SMR, utilizan la fuerza protónmotriz para ejercer su función (figura 4). El principal grupo de bombas de eflujo involucrados en Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 15

30 INTRODUCCIÓN la multi-resistencia a antimicrobianos en A. baumannii corresponde a aquellas que utilizan la fuerza protón-motriz como fuente de energía (Opazo y cols, 2009). Múltiples fármacos c Membrana externa b Multiples fármacos Membrana interna a Citoplasma Figura 4. Representación esquemática de las distintas bombas de expulsión involucradas en la multiresistencia (Modificada de Piddock, 2006). Familia RND. La mayoría de las bombas de expulsión multidrogas de bacilos Gram negativos pertenece a la familia RND. Estas bombas están formadas por tres componentes:a) una proteína transportadora ubicada en la membrana interna, b) una proteína accesoria periplasmática o proteína de fusión de membrana y c) una proteína de membrana externa o porina (Wieczoreck y cols, 2008) (Figura 4). Los genes que codifican los distintos componentes de estas bombas de expulsión se encuentran en el cromosoma bacteriano, generalmente en forma de operones. La importancia de estas bombas de expulsión radica en que poseen un amplio rango de sustratos, por lo que son capaces de contribuir en la resistencia a una gran cantidad de antimicrobianos no relacionados estructuralmente y por ello se clasifican como sistemas multidrogas inespecíficos. En el año 2001 se identificó en una cepa multirresistente de A. baumannii, una bomba de expulsión perteneciente a esta familia, denominada AdeABC, ésta se encuentra constituida por una proteína de fusión de membrana (AdeA), una proteína transportadora multidroga (AdeB) y una proteína de membrana externa (AdeC). En los últimos años se ha asociado esta bomba con la contribución a la resistencia frente a varias clases de antimicrobianos, entre los que se encuentran Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 16

31 INTRODUCCIÓN tetraciclina, eritromicina, cloranfenicol, cefotaxima, gentamicina, kanamicina y tigeciclina. De manera importante, en el año 2005 (Heritier y cols, 2005) se relacionó a la bomba AdeABC con una menor susceptibilidad frente a carbapenémicos; en ese trabajo se informó del aislamiento de una cepa con una mutación puntual en un gen regulador de la expresión de AdeABC; lo que se traduce en la sobreexpresión de la bomba, disminuyendo a la mitad la Concentración mínima inhibitoria (MIC) de Meropenem e Imipenem, en comparación con los valores de MIC de la cepa salvaje. Sin embargo, en el año 2008 (Huang y cols, 2008), asociaron esta bomba directamente con la resistencia a meropenem. Estos investigadores estudiaron dos cepas multirresistentes genéticamente no relacionadas, una de las cuales era productora de la enzima OXA-23; mientras que la otra, no sintetizaba esta carbapenemasa. En esta última cepa, se determinó que el fenotipo de resistencia era debido solamente a la sobreexpresión de la bomba AdeABC (Opazo y cols, 2009). Contribución de AdeABC en la resistencia Un factor importante en la contribución de la bomba AdeABC en la resistencia a antimicrobianos es su nivel de expresión. Un ensayo fenotípico con el cual es posible detectar este mecanismo de resistencia corresponde a la utilización de algún protón-ionóforo como carboxilciadina m- clorofenilhidrazona (CCCP), phe-arg-p-naftilamida (MC o PaβN), 1-(1-naftilmetil)- piperazina (NMP) o reserpina, como inhibidores de los sistemas de expulsión. Estas moléculas producen la interrupción del gradiente de protones en la membrana; por lo cual, los antimicrobianos no pueden ser expulsados por la bomba AdeABC. Si la presencia del protón ionóforo produce la disminución de 1 a 4 veces la MIC del antimicrobiano o una reversión de la resistencia, se considera que existe una contribución del mecanismo de expulsión en la resistencia al agente antibacteriano (Huang L y cols, 2008). Además, es importante considerar que la expresión de los genes adeabc se encuentra regulada por un sistema de dos componentes, denominado AdeRS. Este sistema AdeS corresponde a una proteína quinasa, la cual, en respuesta a estímulos del medio externo (como por ejemplo la presencia de antimicrobianos), se autofosforila en un residuo de histidina. En seguida transfiere el grupo fosfato a un residuo de asparagina de la proteína AdeR, la cual una vez fosforilada, promueve la transcripción de los genes adeabc (Opazo y cols, 2009; Pannek y cols, 2006). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 17

32 INTRODUCCIÓN 1.10 Modificación de Proteínas de unión a Penicilinas (PBPs) Las PBPs son una fuente de resistencia a Imipenem en A. baumannii y han sido poco estudiadas. En un trabajo realizado en 1991, se estudio un aislamiento susceptible a carbapenemes y un derivado mutante resistente obtenido in vitro; se demostró que la mutante resistente tenía una hiperproducción de una PBP de 24 kda se producía otras 6 PBPs en niveles bajos (Gehrlein y cols, 1991). Otro estudio describió la existencia de 12 PBP; en una colección de aislamientos de A.baumannii con perfiles de resistencia variable a β-lactámicos (Fernández-Cuenca y cols, 2003). En aislamientos con Imipenem con MICs > 4 mg/l, la ausencia de la PBP de 73.2 kda ha sido asociada con la resistencia en conjunto con la producción de carbapenemasas (Poirel y Nordmand, 2006). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 18

33 JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS JUSTIFICACIÓN A. baumannii es causante de infecciones intrahospitalarias, productora de brotes y con alta mortalidad en pacientes inmunocomprometidos. En los últimos años se ha observado un incremento en la resistencia a los antibióticos, especialmente a carbapenemes. En México se desconocen los mecanismos de resistencia que presentan las cepas de A. baumannii causantes de infecciones que son resistentes a carbapenemes. La identificación de estos mecanismos de resistencia servirá para el uso adecuado de los antibióticos, prevenir la selección de cepas multirresistentes, y apoyar en la vigilancia y control de las infecciones intrahospitalarias causadas por esta bacteria. HIPÓTESIS Si se detectan los mecanismos de resistencia a los carbapenemes en cepas A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias entonces la producción de enzimas metalo-β-lactamasas será el principal mecanismo de resistencia a los carbapenemes. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 19

34 OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS OBJETIVO GENERAL Caracterizar los mecanismos de resistencia a los Carbapenemes en cepas de A. baumannii causantes de infecciones nosocomiales aisladas en el Hospital Civil de Guadalajara, México. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Determinar la expresion fenotípica de los mecanismos de resistencia a los carbapenemes (producción de Metalo-β-lactamasas, punto Isoeléctrico de OXA-24, pérdida o baja expresión de porinas, sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC) en cepas de A. baumannii. 2. Detectar los genes bla IMP, bla VIM y bla OXA-24 que estan involucrados en la codificación de las carbapenemasas IMP, VIM y OXA Determinar la relación genética y epidemiológica en las cepas de A. baumannii aisladas de Infecciones intrahospitalarias del Hospital Civil de Guadalajara. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 20

35 MATERIAL Y MÉTODOS II. MATERIAL Y MÉTODOS. En la figura 5 se muestra el diagrama general de trabajo donde se incluyen pruebas fenotípicas y genotípicas a las cepas de A. baumannii. 114 cepas presuntivamente Acinetobacter baumannii Confirmación de Género y especie: Pruebas fenotípicas, crecimiento a 44 C y uso de malonato Susceptibilidad a los antimicrobianos Correlación genética y epidemiológica usando el perfil electroforético de PFGE por UPMGA en NTSYS. Identificación fenotípica de MBLs en cepas resistentes a los carbapenemes. Detección fenotípica de la presencia de la bomba de eflujo AdeABC Detección fenotípica de la presencia y ausencia de proteínas de membrana externa: porinas Detección por PCR y secuenciación de los genes bla IMP, bla VIM y bla OXA-24 Detección del punto isoeléctrico y actividad biológica de cepas bla OXA-24 positivas. Fígura5. Diagrama General de Trabajo Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 21

36 MATERIAL Y MÉTODOS 2.2 Selección de la muestra Se trabajó con 114 cepas de A. baumanii consideradas como multirresistentes por el laboratorio de Microbiología del Hospital Civil de Guadalajara, estas cepas fueron enviadas al Laboratorio de Infectología, Microbiología e Inmunología Clínicas del Departamento de Medicina Experimental de la Facultad de Medicina, de la Universidad Nacional Autónoma de México. Todas las cepas fueron aisladas de infecciones intrahospitalarias según los criterios de la Red Hospitalaria de Vigilancia Epidemiológica (RHOVE) durante el periodo y están conservadas a -70ºC en criotubos de caldo Tood Hewitt-glicerol al 40%. 2.3 Pruebas para la identificación de A. baumannii La identificación inicial se realizó en el Hospital Civil Guadalajara (HCG) en el equipo automatizado Micro Scan. En el Laboratorio de Infectología, Microbiología e Inmunología Clínicas se reidentificaron con un método semi-automatizado el Sistema API20NE (biomeriux SA). A la vez se realizaron pruebas adicionales, como la oxidasa y la catalasa. Posteriormente se realizó la prueba de crecimiento a diversas temperaturas (37, 41 y 44 C) y el uso de malonato Crecimiento a diversas temperaturas: 37, 41 y 44 C Se sembraron 114 cepas de Acinetobacter spp. en medio Agar Mac Conkey a 37 C /24 h, se tomó una colonia aislada con un aplicador de madera estéril inoculando un tubo que contenía 1 ml de medio Luria Bertani (LB), posteriormente se incubaron a 37 C durante 24 h, el control negativo empleado fue caldo LB sin inocular. A las 24 h se etiquetaron tubos ependorf y se colocó 500 µl de medio BHI y 10 µl del cultivo de toda la noche. La incubación se realizó en un Thermomixer (eppendorf ) a 37, 41 y 44 C a 350 rpm durante 24 h. (Gerner-Smidt y Tjernberg, 1991). 2.4 Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana a Carbapenemes Por el método de Kirby-Bauer en difusión en agar, se realizó la prueba de susceptibilidad antimicrobiana a 114 cepas de Acinetobacter baumannii y posteriormente se determinó la MIC siguiendo los lineamientos del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2009). Los Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 22

37 MATERIAL Y MÉTODOS valores de corte para Imipenem (IPM) y Meropenem MEM fueron: Sensible 16 mm ó 4 µg/ml, Intermedio = mm ó 8 µg/ml, Resistente 13 mm ó 16 µg/ml (CLSI/2009). Para la interpretación de resultados se utilizó un lector de MIC (BIOMIC), que tiene integrado los valores de corte para cada uno de los antibióticos utilizados por CLSI/2009 video Giles Scientific, USA. 2.5 Detección Fenotípica de producción de Metalo-β-lactamasas A todas las cepas con una MIC de 6 ó 8 g/ml a carbapenemes (IMP y MEM) se les detectó la producción de Métalo- β-lactamasas (Walsh, 2002) con las pruebas de E-test-IPM y doble disco. a) Prueba de E-Test-IPM en cepas Imipenem resistentes Las cepas se sembraron en agar MacConkey 37 C 24 h y posteriormente se ajustó la densidad bacteriana a 0.5 del nefelómetro de Mac Farland en solución salina estéril, para luego sembrar en forma masiva en medio Mueller Hinton. Después se colocó la tira E-Test- IPM que tiene un gradiente de la concentración del antibiótico de 4-26 µg/ml de Imipenem (IP) en un extremo y del otro extremo la misma concentración del antibiótico más EDTA como quelante de los iones zinc en una concentración de 1-64 µg/ml, (IPI). Como control positivo se usó: P. aeruginosa 462/03 y como control negativo P. aeuruginosa ATCC Una cepa es productora de MBLs cuando al dividir la MIC del antibiótico solo, entre la MIC del antibiótico con el EDTA se obtiene un resultado 8 (Figura 6). A B Figura. 6. Producción de Metalo-β-lactamasas (MBLs) por la prueba de E-test-IPM A: P. aeruginosa ATCC 27853, no productora de MBLs, B: P. aeruginosa 462/03 productora de MBLs. b) Prueba de doble disco (MEM + EDTA) en cepas Meropenem resistentes Se sembraron cepas en agar Mac Conkey a 37 C durante 24 h, a partir de las colonias aisladas se ajustó la densidad bacteriana a 0.5 del nefelómetro de Mac Farland en agua destilada estéril, para luego sembrar en forma masiva en medio Műeller Hinton. Se colocaron dos discos de MEM Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 23

38 MATERIAL Y MÉTODOS (10 µg) en cada uno de los extremos de la placa y se agregó 10 µl de EDTA 0.5 M, ph 8 sobre uno de los discos de MEM. Se utilizó como cepa control productora de MBLs, P. aeruginosa 462/03 y como control negativo P. aeuruginosa ATCC Las placas se incubaron a 37 C durante 24 h. La lectura e interpretación de la prueba se realizó extrapolando los valores reportados para el estudio de otros carbapenemes (Imipenem) donde se describe que 7 mm de incremento en el halo de inhibición significa producción de Metalo-β-lactamasas (Clare y cols, 2006 ; Mei-Feng y cols, 2008). 2.6 Extracción de DNA Total Las cepas de A. baumannii resistentes a los carbapenemes se sembraron en agar Mac Conkey con Meropenem a 37 C durante 24 h, las colonias aisladas se resuspendieron en tubos de ensaye que contenía 2 ml de medio Luria Bertani (LB) estéril y se incubaron por 24 h a 37 C en agitación. Se tomó 1.5 ml del cultivo en tubos ependorf y se centrifugaron 1 min a 10,600 x g, se descartó el sobrenadante, posteriormente se adicionó 500 µl de TE 50/20 (Tris HCl 50 mm ph 7.4 y EDTA 20 mm ph 7.8), se resuspendieron las bacterias, se centrifugaron durante 1 min a 10,600 x g y se descartó el sobrenadante. Después se adicionó 175 µl de TE (50/20), 5 µl proteínasa K (20 mg/ml) y 20 µl SDS 10%. Se mezcló cuidadosamente y se incubaron a 56 C durante 1.5 h. Después de ese tiempo se adicionó 500 µl TE 10/1 (Tris HCl 10mM ph 7.4 y EDTA 1mM ph 7.8), 20 µl de NaCl 5 M y se agitaron cuidadosamente. Se agregó 500 µl de fenol- cloroformo- alcohol isoamílico (25:24:1), se agitaron suavemente y se centrifugaron 10,600 x g por 2 min. Se separó la fase acuosa. Se agregó un volumen de 500 µl de isopropanol frío, se agitaron por inversión y se centrifugaron durante 1 min a 10,600 x g a 4 C, se descartó el sobrenadante. Después se agregó 1 ml de etanol al 70% en frío y se centrifugaron durante 1 minuto, se descartó el sobrenadante y se secaron a temperatura ambiente. Después se disolvió en 200 µl de agua desionizada (Pérez-Valdespino, 2007). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 24

39 MATERIAL Y MÉTODOS Detección del gen bla IMP-1 asociado a la resistencia bacteriana a los carbapenemes La amplificación de los genes que codifican a la MBL IMP se llevó a cabo usando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los iniciadores F: 5 - CTACCGCAGCAGAGTCTTTG 3 y R: 5 AACCAGTTTTGCCTTACCAT-3. El tamaño del producto esperado fue de 587 pb. La amplificación se realizó en un volumen final de 20 µl en el termociclador icycler (Bio-Rad ). La mezcla de reacción contenía 0.1 µm de ambos iniciadores, 0.2 mm de la mezcla de dntps, 1 X de amortiguador, 1.5 mm de MgCl 2, 1 U Taq polimerasa y 100 ng de templete de DNA. La desnaturalización inicial fue de 94 C por 2 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 C por 1 min, el alineamiento fue de 55 C 1 min, la extensión de 72 C por 1.5 min. La extensión final fue de 72 C por 7 min. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % a 120 V en una cámara Power Station 300 (Labnet International Inc) y teñido con bromuro de etidio al 1% durante 3 min. Posteriormente los amplicones de cada una de las muestras de las clonas más frecuentes fueron secuenciados, esto debido a que las MBLs son enzimas con una alta tasa de mutación y el cambio en uno solo de los nucleótidos puede dar lugar a una enzima diferente o con un cambio en el perfil de resistencia. (Senda y cols, 1996) Detección del gen bla VIM asociado a la resistencia bacteriana a los carbapenemes La amplificación de los genes que codifican para la MBL VIM se llevó a cabo usando la técnica de PCR con los iniciadores F: 5 - AGTGGTGAGTATCCGACAG 3 y R: 5 - ATGAAAGTGCGTGGAGAC -3. El tamaño del producto fue de 261 pb. La amplificación se realizó en un volumen final de 20 µl en el termociclador icycler (Bio-Rad ). La mezcla de reacción contenía 0.1 µm de ambos iniciadores, 0.2 mm de la mezcla de DNTPs, 1 X de amortiguador, 1.5 mm de MgCl 2, 1 U Taq polimerasa y 100 ng de templete de DNA. La desnaturalización inicial fue de 94 C por 5 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 C por 30 seg, el alineamiento fue de 55 C 45 seg, la extensión de 72 C por 1 min. La extensión final fue de 72 C por 10 min. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % a 120 V en una cámara Power Station 300 (Labnet International Inc) y teñido con bromuro de etidio al 1% durante 3 min. Posteriormente los amplicones de cada una de las muestras que representaban las clonas más frecuentes, fueron secuenciados en el Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 25

40 MATERIAL Y MÉTODOS Departamento de Genoma de Patógenos del Instituto nacional de Referencia Epidemiológica (InDre) (Valenzuela y cols, 2007) Detección del gen bla OXA-24, asociado a la resistencia a carbapenemes Para la detección del gen bla OXA-24 se diseñó un par de iniciadores con el programa primer3 ( usando la secuencia reportada en el banco de genes con el número NC_ y alineados en BLAST ( La amplificación del gen que codifica a la β-lactamasa tipo OXA-24 se llevó a cabo con el iniciador diseñado: OXA-24F1: 5 -TCGGATAACGCCCATTATGT 3 y OXA-24R1: 5 - CCCGCTTTACTTCTTTCTGC-3. El tamaño del amplicon fue de 552 pb. La amplificación fue llevada a cabo en un volumen final de 25 µl con el termociclador icycler (Bio-Rad ). La mezcla de reacción contenía 1 µm de cada uno de los iniciadores, 1X de Master Mix Green (GoTaq Promega) y < 250 ng del templete de DNA. La desnaturalización inicial fue de 94 C por 3 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 C por 1 min, el alineamiento fue de 55 C 1 min, la extensión de 72 C por 1 min. La extensión final fue de 72 C por 7 min. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % a 120 V en una cámara Power Station 300 (Labnet International Inc) y teñido con bromuro de etidio al 1% durante 3 min. Posteriormente los amplicones de cada una de las muestras que representaban las clonas más frecuentes fueron secuenciados en el Departamento de Genoma de Patógenos del Instituto nacional de Referencia Epidemiológica (InDre). 2.7 Prueba de Isoelectroenfoque para la determinación del punto isoeléctrico de la β- lactamasa OXA-24 y ensayo de su actividad biológica con Imipenem Para la preparación de los sonicados se inoculó una colonia en 5 ml de caldo Luria Bertani con Imipenem; de cada una de las muestras a las que se le detectó el gen bla OXA-24 de A. baumannii y como control cepas de E. coli que contenían las β-lactamasas: TLA-1 (pi 9.0), SHV-5 (pi 8.2), SHV-4 (pi 7.8), SHV-3 (pi 7.0) y TEM (pi 5.4). Se incubaron toda la noche a 37 C en agitación y se centrifugaron hasta obtener un botón celular abundante, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en 750 µl de solución de PBS 0.1 M ph 7.4. Posteriormente las muestras se sonicaron en el Sonics Vibra-Cell (modelo VCX-600) en 7 ciclos de 2 min a 4 C con una amplitud de 38%. Los sonicados se centrifugaron durante 20 min a 15,000 x g y se Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 26

41 MATERIAL Y MÉTODOS separó el sobrenadante. La mezcla de pi conocidos fue de 150 µl TLA-1, 150 µl SHV-5, 175 µl SHV-7, 150 µl SHV-4, 175 µl SHV-3 y 12.5 µl TEM, concentrados a 25µL aproximadamente. Se realizó un precorrimiento del gel en el Phastsystem (Pharmacia Biotech ). En la cámara de carga se colocaron 2 µl de las muestras, 2 µl de la mezcla de los pi conocidos y 2 µl del estándar preteñido de IEF (pi ) Bio-Rad y con el peine se embebió y se transfirió al gel precorrido. Una vez que se realizó el corrimiento se reveló el gel adicionando 1 µl (0.02 µg/µl) de la solución de Imipenem a 500 µl de nitrocefin. El gel se cubrió con un papel filtro del tamaño del gel y se humedeció totalmente con Nitrocefin/Imipenem, evitando la formación de burbujas y se esperó durante 5 min aproximadamente para observar puntos de color rosa-rojo. Se escaneó la imagen y se quitó el papel filtro. Se incubó a 37 C por 30 min. Posteriormente el gel se cubrió con una mezcla de 3 ml de agar suave y 400 µl de un cultivo de E. coli J53-2 a una densidad óptica de 0.4 (600 nm). Se incubó a 37 C por 24 h y se observó la hidrólisis del Imipenem con el crecimiento de la bacteria sensible a imipenem en la zona donde se visualizó el punto isoeléctrico de 9.0. de la enzima OXA-24 ( Sanders y cols, 1986). 2.8 Extracción de Proteínas de membrana externa-porinas A 150 ml de caldo Luria Bertani con imipenem y meropenem (16 µg/ml) se le añadió 1.5 ml de un cultivo de toda la noche a 37 C, con agitación de cada una de las cepas a probar, se incubó a 37 C/150 rpm durante 8 h hasta obtener una densidad celular de 0.6 (Hamzehpour y cols, 1995). El perfil de susceptibilidad de las cepas analizadas fue el siguiente: Cepa 56 sensible a Imipenem, Cefotaxima, Gentamicina, Ciprofloxacina y Piperacilina-Tazobactam. Cepas 42 y 62 resistentes a Imipenem (> 16 µg/ml), Cefotaxima (> 32 µg/ml), Gentamicina (> 16 µ g/ml), Ciprofloxacina (> 16 µg/ml) y Piperacilina-Tazobactam (> 128 µg/ml) (Limannsky y cols, 2002). Cepas 789 y 820 resistentes a Meropenem (8 µg/ml y > 16 µg/ml respectivamente). Se cosechó la bacteria a 10,000 x g por 10 min a 4 C. Posteriormente se lavó el paquete celular 2 veces con PBS 1X. El paquete se resuspendió con HEPES 0.01M hasta obtener una densidad óptica de 0.6 a 540 nm (Spectronic Genesys 5). Las bacterias fueron sonicadas 8 ciclos de 1 min con 20% de amplitud en un volumen de 20 ml. El sonicado se centrifugó a 7000 x g por 15 min a 4 C, el sobrenadante se trató con 1 mg/ml de DNAasa, 0.25 mg/ml de RNAsa (Roche ) y 1 volumen de MgCl 2 50 mm durante 20 min a temperatura ambiente. Transcurrido Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 27

42 MATERIAL Y MÉTODOS el tiempo se ultracentrifugó a 94,000 x g por 45 min (Beckman L7-80) para obtener envolturas celulares. El botón se resuspendió en una solución A (ver anexos), se centrifugó a 94,000 x g por 45 min y el botón se resuspendió nuevamente en una solución B (ver anexos), se centrifugó a 94,000 x g por 45 min. Se recuperó el sobrenadante y se adicionó una solución de inhibidor de proteasas (antipaina, bestatina, quimostatina, leupeptina y apotinina: Roche ). Posteriormente se precipitó con tres volúmenes de acetona a -70 C por 18 h. Se recuperó el precipitado y se centrifugó a 15,000 x g por 15 min. El botón se resuspendió en 30 µl de agua destilada estéril e inhibidor de proteasas (Ames y Nikaido, 1976). Se cuantificaron las proteínas por el método Bradford en microplaca (Bio-Rad ) (Brafford, 1976). La concentración de proteína que se utilizó en el gel fue de 1.0 µg y el marcador de carga fue el reactivo Laemmli (Tris-HCl 62.5 mm ph 6.8, glicerol al 20%, dodecil sulfato de sodio SDS al 2% y β-mercaptoetanol al 5%) (Laemmli, 1970) se realizó una electroforesis el gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10% empleando el marcador de peso molecular Broad Range catalogo Bio-Rad. Para el revelado de las proteínas se empleó la tinción de plata siguiendo las indicaciones del proveedor (Silver Stain Plus Bio-Rad ). 2.9 Identificación de la sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC asociada a la resistencia a Meropenem. Se utilizaron 47 cepas de A. baumannii resistentes a uno o ambos carbapenemes (Imipenem y Meropenem). Se probaron dos inhibidores de bombas de eflujo: Phe-arg-β-naftilamida (MC o PaβN) y 1-(1-naftilmetil)-piperazina (NMP), ambos en tres concentraciones: 25 mg, 50 mg y 100 mg/l en agar Műeller- Hinton (Pannek y cols, 2006). Las cepas de A. baumannii se aislaron en agar Mac Conkey y 24 h después se resuspendieron 2 ó 3 colonias en 5 ml de agua destilada estéril, llevándose a una suspensión de 0.5 del nefelómetro de MacFarland, se realizó una siembra masiva en el medio Műeller-Hinton libre de los inhibidores de bombas de eflujo y en las placas que contenían los inhibidores en sus tres concentraciones. Se colocaron los discos de Meropenem (10µg) para cada placa y se incubaron a 37 C durante 24 h. Se midió el halo de inhibición en mm y se extrapoló en el sistema Biomic (Giles Scientific, USA) para la determinación de la MIC. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 28

43 MATERIAL Y MÉTODOS 2.10 Construcción del dendrograma. Para detectar el perfil clonal de las 47 cepas de A. baumannii resistentes a Carbapenemes y su relación fenotípica y genotípica se utilizó la macrorrestricción por Apa I y la separación de los fragmentos por PFGE. Las bandas de PFGE fueron codificadas como datos de presenciaausencia. La relación entre patrones de bandas desplegadas por las cepas; fue visualizado a través de un dendrograma construido por el método de UPGMA a partir de una matriz de similitud obtenida con el índice de Dice. El árbol fue valorado estadísticamente por medio del coeficiente de correlación cofenetica (cccr) estimados a partir de ρ después de 10,000 alineamientos y la marcha de bootstrop. Todos los cálculos se hicieron en el programa NTSYS Versión 2.01 (Sncoth, 2000). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 29

44 RESULTADOS III. RESULTADOS 3.1. Identificación de cepas de A. baumannii En la reidentificaron de las cepas de Acinetobacter spp., las 114 cepas utilizadas fueron identificadas como complejo A. baumannii/calcoaceticus las cuales dieron positiva la prueba de catalasa y negativa la prueba de oxidasa. 110/114 cepas crecieron a 44 C y sólo 98/110 cepas utilizaron el malonato (cuadro 4). Cuadro 4. Crecimiento a diversas temperaturas y uso del malonato en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias del Hospital Civil de Guadalajara. Temperatura C n= 114 Número de cepas con crecimiento Microorganismo Complejo A. baumannii Complejo A. baumannii (98) A. baumannii y (12) A. genoespecies 13 (4) Acinetobacter spp. Uso del malonato 98 A. baumannii Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 30

45 RESULTADOS 3.2. Pruebas de Susceptibilidad a los antimicrobianos En la figura 7, se muestra la susceptibilidad a los carbapenemes, 47/98 (48%) cepas de A.baumannii resultaron resistentes a alguno de los carbapenemes empleados (Imipenem y Meropenem), 12 cepas fueron resistentes a ambos carbapenemes y 35 cepas fueron resistentes sólo a Meropenem. A las 47 cepas de A. baumannii resistentes a uno o ambos carbapenemes se les determinó el perfil de susceptibilidad a 17/21 antibióticos recomendados por el CLSI 2009 para la terapia contra infecciones causadas por esta bacteria utilizando el método de difusión en agar. n= 98 n= 47 Figura 7. Susceptibilidad a los carbapenemes. R: Resistencia, S: Sensible, MEM:Meropenem, IPM: Imipenem En el cuadro 5, se muestran las MICs de 17/21 antimicrobianos recomendados por el CLSI El color rojo indica resistencia, el color amarillo susceptibilidad intermedia y el color verde sensibilidad. En general se observa una multirresistencia a casi todos los antimicrobianos.todas las cepas fueron resistentes a Ciproflaxina, Ceftriaxona, Cefotaxima y Meropenem. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 31

46 RESULTADOS Cuadro 5. Susceptibilidad a antimicrobianos en 47 cepas de A. baumannii resistentes a carbapenemes AISLAMIENTO AMK CAZ CIP CRO CTX FEP GAT GM IMP LVX MEM TOB SAM SXT TE TIM TZP > >20 >128 > >6, > > >256 >128 >20 >128 >256 >96 >6,0 >48 6 >16 >16 >48 4 >256 >48 >256 > > >20 >128 > > > > >20 >128 > > >48 >48 > > >20 >128 > > >48 >48 >256 >48 >256 > > >20 >128 > > >48 48 >256 >48 >256 > > >20 >128 > >6 > >16 >48 2 > >256 > >256 >128 >20 >128 > > >16 >48 > >256 > >256 >128 >20 >128 >256 >96 4 >48 6 >16 >16 >48 >48 > >256 > > >20 >128 > > >48 >48 >256 >48 >256 > > >20 >128 > > >256 6 >256 > > >20 >128 > > >256 4 > > >20 >128 > > >48 >48 >256 >48 >256 > > >20 >128 > > >256 > > >20 >128 > >6,0 6 4 >16 > > > >20 >128 > > >16 >48 >48 > >256 > >20 >128 > > >48 >48 > >256 > > >20 >128 > > > >20 >128 > > >16 >48 >48 >256 >48 >256 > > >20 >128 > > >48 >48 >256 >48 >256 > >20 > > >48 > >256 >512 > > >20 >128 > > >48 >48 > >256 > >20 >128 > > >48 >48 >256 >48 >256 > > >20 >128 > >48 6 >16 >16 >48 >48 > >256 > >20 >128 > > >48 >48 > >256 > >20 >128 > > >16 >48 >48 >256 8 >256 > >20 >128 > > >48 >48 > >256 > >20 >128 > > > > > > >20 >128 > > >16 >48 >48 > >256 > >20 >128 > > >48 48 > >256 > >20 >128 > > >16 >48 >48 > >256 > >20 >128 > > >48 >48 > >256 > >20 >128 > >16 >48 8 > >256 > /04 > >20 >128 > >48 >24 12 >16 >48 16 >256 >48 >256 > /04 10 >128 >20 >128 > > > >256 > /04 > >20 >128 > >48 >24 10 >16 >48 20 >256 >48 >256 > /04 > >20 >128 > >48 >24 12 >16 >48 24 >256 >48 >256 > /04 > >20 >128 > >48 >24 6 >16 >48 24 >256 >48 >256 >512 Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 32

47 RESULTADOS continuación. Cuadro 5. Susceptibilidad a antimicrobianos en 47 cepas de A. baumannii resistentes a carbapenemes AISLAMIENTO AMK CAZ CIP CRO CTX FEP GAT GM IMP LVX MEM TOB SAM SXT TE TIM TZP 066/04 > >20 >128 > >6 >48 24 >16 >16 >48 24 >256 >48 >256 > /04 > >20 >128 > >48 >24 8 >16 >48 48 >256 >48 >256 > /04 >256 >128 >20 >128 > >48 >24 8 >16 >48 20 >256 >48 >256 > / >20 >128 > > >16 >48 >48 > >256 > /04 > >20 >128 > > >16 >41 8 >256 >48 >256 > /04 > >20 >128 > >24 >24 10 >16 >48 48 >256 >48 >256 > /04 > >20 >128 > >6 >48 >24 10 >16 > >48 >256 > /04 >256 >128 >20 >128 > >48 >24 >16 >16 >48 16 >256 >48 >256 > /04 > >20 >128 > >48 >24 8 >16 >48 16 >256 >48 >256 >512 AMK: Amikacina, CAZ: Ceftazidima, CIP: Ciprofloxacina, CRO: Ceftriaxona, CTX: Cefotaxima, FEP: Cefepima, GAT: Gatifloxacino, GM: Gentamicina, IMP: Imipenem, LVX: Levofloxacino, MEM: Meropenem, TOB: Tobramicina, SAM: Ampicilina-Sulbactam, SXT: Trimetropin-Sulfametoxasol, TE: Tetraciclina, TIM: Ticarcilina /clavulanato, TZP: Piperacilina/Tazobactam Pruebas para la detección fenotípica de la producción de Métalo-β-lactamasas a) Prueba de E-Test-MBLs para cepas IPM resistentes En el cuadro 6, se muestra la determinación de MBLs en 12 cepas de A. baumannni resistentes a Imipenem y Meropenem por medio de la prueba de E-test-Imipenem. El 100% de estas cepas fueron productoras de MBLs. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 33

48 RESULTADOS Cuadro 6. Producción de MBLs en 12 cepas de A. baumannii resistentes a Imipenem y Meropenem Cepa mm KB MIC IPM (µg/ml) IPM+EDTA (µg/ml) IPM/IPM+ EDTA 8 µg/ml MBLs + Produción de MBLs 041/04 6 (R)> Positiva 042/04 6 (R)> Positiva 044/04 6 (R)> Positiva 045/04 6 (R)> Positiva 046/04 7 (R)> Positiva 051/04 6 (R)> Positiva 058/04 10 (R) Positiva 060/04 6 (R)> Positiva 062/04 6 (R)> Positiva 063/04 6 (R)> Positiva 064/04 6 (R)> Positiva 066/04 6 (R)> Positiva 462/03* 6 (R)>24 > Positiva ATCC: 27853** 25 (S) 1.0 < Negativa MIC= Concentración Mínima Inhibitoria, KB= Kirby Bauer, mm (milimetros), IPM= Imipenem, EDTA= Etilendiaminotetracetico, MBLs= Metalo-β-lactamasas, R= Resistente, S= Sensible. *cepa P. aeruginosa control positivo, **Cepa P. aeruginosa control negativo. b) Técnica de doble disco con Meropenem para la identificación de MBLs Se realizó la técnica de doble disco para 35 cepas cepas de A. baumannii resistentes a Meropenem. Un incremento del halo de inhibición 7 mm significa que la cepa es productora de MBLs (Clare y cols, 2006, Mei-Feng y cols, 2008) 27/35 (77.1%) de estas cepas presentaron MBLs y 8/35 (22.8%) no presentaron MBLs (Cuadro 7). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 34

49 RESULTADOS Cuadro 7. Producción de MBLS en 27/35 cepas de A. baumannii resistentes a Meropenem cepa Meropenem (MEM) mm MEM +EDTA Incremento en mm Producción de MBLs 59/ Positiva 221/ Positiva 532/ Positiva 535/ Positiva 541/ Positiva 736/03 735/ / Positiva 741/ Positiva 745/ Positiva 751/ Positiva 755/ Positiva 764/ Positiva 773/ Positiva 776/ Positiva 785/ Positiva 787/ Positiva 816/ Positiva 781/ Positiva 788/ Positiva 814/ Positiva 817/ Positiva 819/ Positiva Positiva Positiva 821/ Positiva 822/ Positiva 185/ Positiva 227/ Positiva Total = 27 67/ Negativa 765/ Negativa 777/ Negativa 782/ Negativa 789/ Negativa 793/ Negativa 818/ Negativa 820/03 Total= Negativa 462/03* Positiva 27853** Negativa MEM: Meropenem, MEM+EDTA: disco de Meropenem (10µg) +10µL de EDTA 0.5M ph 8. *cepa P. aeruginosa control positivo, **Cepa P. aeruginosa control negativo. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 35

50 RESULTADOS 3.4. Detección de genes que codifican para β-lactamasas tipo B y D relacionadas con la resistencia a carbapenemes Detección del gen bla IMP-1 Utilizando la técnica de PCR se observó que 7/47(14.8%) de las cepas de A. baumannii resistentes a Imipenem y Meropenem presentaron el gen bla IMP-1 (Figura 8). Estas cepas poseen una MIC elevada 16 µg/ml a meropenem y una MIC de 24 µg/ml a Imipenem pb Figura 8. Corrimiento electroforético en gel de agarosa al 1% del amplicón del gen bla IMP. Carril 1: Talla Molecular 100 pb, Carril 2: Control positivo, Pseudomonas aeruginosa bla IMP, Carril 3: Control negativo Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Carril 4-7 A. baumannii cepas 41, , 46 respectivamente. Carril 9-11 A.baumannii cepas 51, 58, 60 respectivamente Detección del gen bla VIM Utilizando la técnica de PCR se observó que 7/47(14.8%) de las cepas de A. baumannii resistentes a Meropenem presentaron el gen bla VIM (Figura 9). Estas cepas poseen una MIC de 16 µg/ml a Meropenem y son sensibles a Imipenem (2-6 µg/ml). Se secuenciaron los amplificados de 2 de las clonas más representativas, para cada cepa se obtuvieron dos secuencias, una secuencia con el iniciador forward y la otra con el reverse. A partir de las secuencias nucleotídicas generadas se realizó un alineamiento en blastx entre las secuencias de problemas y las secuencias reportadas en el GenBank. Se detectó 100% de identidad de secuencia con la secuencia del gen bla VIM-4 de P. aeruginosa. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 36

51 RESULTADOS pb Figura 9. Corrimiento electroforético en gel de agarosa al 1% del amplicón del gen bla VIM. Carril 1: Talla Molecular 100 pb, Carril 2: Control positivo Pseudomonas aeruginosa bla VIM, Carril 3: Control negativo Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Carril 4-10 A. baumannii cepas 781, , 817, 819, 821 y 822 respectivamente Detección del gen bla OXA-24 La identificación del gen que codifica para la β-lactamasa tipo OXA (OXA-24) se hizo utilizando un par de iniciadores diseñados en este estudio. Se observó que 12/47 (25.5%) de las cepas de A. baumannii presentaron el gen, estas cepas fueron 100% resistentes a Imipenem y Meropenem. Adicionalmente hubo 7 de estas cepas que presentaron el gen bla IMP (Figura 8 y 10). Se secuenciaron los amplificados de 3 de las clonas más representativas para cada cepa, se obtuvieron dos secuencias, una secuencia con el iniciador forward y la otra con el reverse. A partir de las secuencias nucleotídicas generadas se realizó un alineamiento en blastx entre las secuencias problemas y las secuencias reportadas en el GenBank. Se detectó 100% de identidad de secuencias del gen bla OXA-24 de A. baumannii pb Figura 10. Corrimiento electroforético en gel de agarosa al 1% del amplicón del gen bla OXA-24. Carril 1: Talla Molecular 100 pb, Carril 2: Control positivo A. baumannii bla OXA-24, Carril 3: Control negativo Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Carril 4-15 cepas 41, , 45, 46, 51, 58, 60, 62, 63, 64 y 66 respectivamente. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 37

52 RESULTADOS En la figura 11, se resume la producción de Carbapenemasas en 47 cepas de A. baumannii resistentes a uno o ambos carbapenemes (IPM y MEM). De manera fenotípica 39/47 (82.9%) cepas fueron productoras de MBLs y solo 8/47 (17.02%) no las producen. De manera genotípica 19/47 cepas presentan alguno de los genes de β-lactamasas tipo bla IMP, bla VIM y bla OXA-24. Siete cepas que fueron resistentes solo a Meropenem presentaron el gen bla VIM, hubo siete cepas con resistencia a ambos carbapenemes que mostraron la presencia del gen bla IMP y doce cepas mostraron la presencia del gen bla OXA-24 de estas cepas 7 cepas fueron las mismas que mostraron el gen bla IMP. Entonces de manera fenotípica, 20 de ellas no presentan los genes de las MBLs buscadas en este estudio. 39 (82.9%) FENOTIPO GENOTIPO 20 (42.5%) 8 (17.02%) 7 (14.8%) 7 (14.8%) 5 (10.6%) 8 (17.02%) MEM R IPM R MEM R IPM R MEM R MEM R Figura 11. Producción de carbapenemasas en cepas de A. baumannii resistentes a uno o ambos carbapenemes Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 38

53 RESULTADOS 3.5. Detección de OXA-24 por Isoelectroenfoque y prueba biológica con Imipenem Todas las cepas probadas (6/6) mostraron la presencia de la enzima OXA-24 con un pi 9.0 y otra enzima con un pi entre 5.4 y 7.0, la prueba biológica demostró la actividad de las mismas hidrolizando al Imipenem y permitiendo el crecimiento de la cepa control E. coli J53-2 sensible a este antibiótico en los sitios donde se encontraban las enzimas (Figura. 12). A B pi p Fig. 12. A y B. Detección de OXA-24 por Isoelectroenfoque y prueba de la actividad biológica de OXA-24 con Imipenem. Carril 1. Cepa 41 A. baumannii. Carril 2. Cepa 44, 3. Cepa 45, Carril 4. Cepa 62, Carril 5. Cepa 63, Carril 6. Cepa 66, p= preteñido de IEF (rango 4.5 a 9.6) pi: mezcla de β-lactamasas con pis de 5.4 (TEM), 7.0 (SHV-3), 7.8 (SHV-4), 8.2 (SHV-5) y 9.0 (TLA-1) Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 39

54 RESULTADOS 3.6. Extracción de proteínas de membrana externa (OMPs): porinas La pérdida de expresión de porinas de 22, 29 y 43 kda está asociada a la resistencia a los carbapenemes en cepas de A. baumannii. En la figura 13, se muestra el gel SDS-PAGE de las OMPs de cepas de A. baumannii y que fueron resistentes a uno o ambos carbapenemes, una cepa clínica de A. baumannii sensible a ambos carbapenemes (cepa 56) se utilizó como control. La cepa 56 presentó proteínas de 22, 29 y 43 kda. Las cepas 48, 42 y 62 (resistentes a ambos carbapenemes) y las cepas 789 y 820 (resistentes solo a meropenem) no expresaron esas proteínas. La cepa 62 expresa de manera débil la porina de 43 kda. kda PM Figura 13: Perfil electroforético de proteínas de membrana externa (porinas) en cepas de A. baumannii. Cepa 56: sensible a Imipenem y Meropenem, cepa 48: Acinetobacter genoespecie 13 resistente a Imipenem y Meropenem, cepa 42 y 62 resistentes a Imipenem y Meropenem, 789 y 820 resistentes a Meropenem. Las proteínas fueron teñidas con la técnica de tinción de plata (Silver Stain Plus Biorad ). (~1.0 µg de proteína) 3.7. Sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC asociada a la resistencia a Meropenem. 10/47 cepas presentaron una disminución de 1 a 2 veces la MIC (o una reversión de la resistencia) que presentaban cuando se probaron sin los inhibidores de bombas de eflujo (Figura 14). Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 40

55 RESULTADOS Figura 14. Sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC asociada a la resistencia a Meropenem. Los inhibidores de bombas de eflujo: Phe-arg-β-naftilamida (PaβN) y 1-(1-naftilmetil)-piperazina (NMP), ambos en tres concentraciones: 25 mg/l, 50mg/L y 100 mg/l. Se expresa la MIC determinada por extrapolación del halo de inhibición en el sistema BIOMIC. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 41

56 RESULTADOS El cuadro 8, indica el total de las cepas agrupadas por la técnica de PFGE que se muestra en la figura 15. La agrupación I mostró como principal mecanismo de resistencia a los carbapanemes la evidencia fenotípica de la bomba de eflujo AdeABC. La agrupación II mostró la presencia del gen bla VIM-4 así como su producción enzimatica como principal mecanismo. La agrupación III mostró la presencia del gen bla IMP y bla OXA-24 y como principal característica en esta agrupación se encuentra el mayor número de defunciones. Cuadro 8. Total de cepas de A. baumannii con características epidemiológicas, fenotípicas y genotípicas Agrupación por PFGE Número de clonas Número de cepas Producción de MBLs bla IMP bla 4 bla VIM- OXA- 24 Detección bomba AdeABC Ausencia de porinas Defunciones I II III IV Total Relación entre clonas de A. baumannii resistentes a carbapenemes: su fenotipo, genotipo y epidemiología. Utilizando los patrones electroforeticos obtenidos por PFGE en la parte inicial de este proyecto de investigación se determinó la relación entre las diferentes clonas obtenidas construyendo un dendrograma con las 47 cepas de A.baumannii resistentes a los carbapenemes. Se obtuvieron 4 agrupaciones y 15 clonas (Figura 15). En el dendrograma (figura 15) se observan 4 agrupaciones que tienen valores de similitud por arriba del 50%. El grupo I contiene 5 clonas: 1, 3, 6, 7 y 9 (12 cepas) que no expresan ninguno de los genes que codifican para las MBLs analizadas en este estudio (IMP y VIM), ni la β- lactamasa OXA-24. Sin embargo, todas las cepas de las clonas 1, 6 y 9 tuvieron evidencia fenotípica de la sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC que está asociada a la resistencia a Meropenem (Opazo, 2009), aunado a la expresion fenotípica de la producción de MBLs. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 42

57 RESULTADOS La agrupación II contiene 4 clonas: 4, y 12, dos de ellas (clona 4 y 11) fueron las más frecuentes y se presentaron como una clona endémica (todo el año 2007) y en un brote en el mes de julio-agosto de 2007, respectivamente. En esta agrupación se encontraron 7 cepas que poseen el gen bla VIM-4, dos de ellas presentaron también la sobreexpresión de la bomba AdeABC, 5 cepas no presentaron ninguno de los mecanismos buscados en este estudio y 2 cepas han perdido las porinas de 22, 29 y 43 kda. En la agrupación III se encontraron 5 clonas: 5, 13, 15, 14 y 8. La clona 13 fue una de las 3 clonas mas frecuentes y se presentó como causante de un brote en noviembre-diciembre del Todas las cepas mostraron de manera fenotípica la producción de MBLs, pero solo 7 expresaron el gen bla IMP, 12 el gen bla OXA-24 (resistentes a ambos carbapenemes) y 1 cepa tuvo la sobreexpresión de la bomba de eflujo AdeABC. La agrupación III contiene las cepas con el mayor número de mecanismos de resistencia (entre 3 y 4) que en conjunto les confieren resistencia a ambos carbapenemes. Además estas cepas, coinciden con 10 de las 18 defunciones presentadas en este estudio (Cuadro 8). En general el 59.5% de las cepas mostraron más de 2 mecanismos de resistencia analizados, el 29.7% al menos 1 y el 10% a ninguno de los mecanismos estudiados en este trabajo. El mecanismo de resistencia asociado a la pérdida o disminución de porinas se investigó únicamente en dos cepas representantes de las clonas 13 (cepa 62) y 14 (cepa 42) de la agrupación III, las cuales presentaron el fenotipo de pérdida de porinas 22 y 29 kda (figura 13). La cepa 62 expresó débilmente una banda correspondiente a la porina de 43 kda, esta cepa solo presenta el gen bla OXA-24 y la cepa 42 expresó tanto el gen bla IMP como el gen bla OXA-24, lo que podría indicar que la pérdida de las porinas de 22 y 29 kda son significativas para la resistencia a Imipenem. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 43

58 RESULTADOS I 51% 60% CCCr= ρ= II 79% 51% 33% 82% III 88% 51% 45% IV Coeficiente Dice Figura 15. Dendrograma de 47 cepas de A. baumannii resistentes a uno o ambos carbapenemes. Sitio de aislamiento. SHQX: Secreción de herida quirúrgica, LCF: líquido cefalorraquídeo, CAT: Catéter, S: Sangre, SB: Secreción bronquial, LP: Líquido peritoneal. Área hospitalaria: CG: Cirugía general, INFEC: Infectología pediátrica y adultos, UCI: Unidad de cuidados intensivos, OT: ortopedia y traumatología, HO: Hematología y oncología, TC: Tórax y Cardiología, UR: Urología. Sobrevida. M: mejoría, D: Defunción, H: Hospitalización. MBLs: Metalo-β-lactamasas. Susceptibilidad: R: resistencia, S: Sensible, I: Intermedio. IPM: Imipenem, MEM: Meropenem. El símbolo significa pérdida o reducción de la expresión de porinas: 29kDa y 43kDa. Mecanismos de resistencia a carbapenemes en cepas de A. baumannii aisladas de infecciones intrahospitalarias 44