TRES ETAPAS EN LA HISTORIA DE LA CITOGENÉTICA CLÍNICA Edurdo A. Pstene L er pre-ndeo Y desde principios del 1900 se cept l ide de que el mteril hereditrio est contenido en los cromosoms; hipótesis que fue confirmd por los experimentos de Boveri en erizo de mr y de Sutton en sltmontes en 1902. Desde entonces el cmpo de l citogenétic niml y vegetl fue desrrollándose hst lcnzr l crcterizción morfológic del juego de cromosoms completo de diverss especies. Sin emrgo, ls metodologís utilizds en el estudio cromosómico no ern decuds pr descriir el criotipo humno. Hci medidos del siglo XX diverss pulicciones pretendín demostrr que l especie humn contiene 48 cromosoms en sus céluls somátics y muchs más sn sus experiencis en dich firmción que er universlmente ceptd. Durnte tres décds l comunidd científic perseveró en el error hst que en 1956 Tjio y Levn demostrron sin migüedd que ls céluls somátics humns normles contienen 46 cromosoms. Independientemente, en el mismo ño, Ford y Hmerton confirmron est oservción. L técnic de Moorhed & cols. pr otener preprdos de cromosoms en metfse prtir de muestrs de sngre periféric significó un importnte vnce. El rresto mitótico con colchicin y l posterior hipotonizción celulr, fcilitron enormemente el nálisis microscópico y que permitín otener preprdos con myor cntidd de céluls en metfse y con cromosoms menos superpuestos entre sí. Desde entonces se sucedieron un serie de descurimientos de ptologís humns con errciones cromosómics en número y en morfologí que dejron en clro l importnci de l citogenétic en l clínic médic. c Figur 1. Síndrome de Down por trisomí 21. () Jerôme Lejeune; () metfse de un pciente con síndrome de Down pulicd por Lejeune, Gutier y Turpin en 1959; y (c) criotipo de l metfse nterior. L primer ptologí citogenétic humn en ser descuiert es tmién l más frecuentemente oservd en l polción mundil: el síndrome de Down por trisomí 21. Los primeros trjos que reveln l presenci de un cromosom extr en pcientes con síndrome de Down fueron pulicdos por Jerôme Lejeune y colordores en 1959. Entre 1959 y 1963 se pulicron trjos relciondos con l presenci de neuploidís de cromosoms sexules en los síndromes de Turner y Klinefelter, sí como l primer ptologí definid como un síndrome de errción estructurl: el síndrome de cri du cht ( llnto de gto ) por deleción prcil del rzo corto de un cromosom del grupo B (el cromosom 5), y el descurimiento del cromosom Phildelphi en pcientes con leucemi mieloide crónic, producto de un trnslocción recíproc entre un cromosom 9 y un cromosom 22. 1
Tmién en ls décds del 60 y 70 se destcó l utilizción de l tecnologí citogenétic como herrmient de investigción y dignóstico en toxicologí genétic. El recuento de roturs cromosómics y de micronúcleos en individuos expuestos rdiciones está en relción direct con el dño cusdo l ADN por l exposición. Figur 2. Inestilidd cromosómic. () Micronúcleo; () Roturs y errciones cromosómics en un pciente con nemi de Fnconi. Asimismo, se detectron diverss ptologís genétics de deficienci en l reprción del ADN que en generl presentn un cntidd inusul de roturs cromosómics, nomlís estructurles y micronúcleos, como por ejemplo l nemi de Fnconi y l txi telngiectsi. L er post-ndeo Hci fines de los ños 60 Torjörn Cspersson y Lore Zech oservron que los cromosoms teñidos con ciertos colorntes del ADN como l quincrin presentn un ptrón de nds específico. Este hllzgo fue equiprdo con lo oservdo lguns décds ntes por Theodosius Dozhnsky en cromosoms politénicos de Drosophil: cd pr cromosómico humno present un ptrón de nds único y reproducile que podí utilizrse pr su identificción y pr l detección de nomlís. A principios de los 70 dos trjos independientes demostrron que ls nds producids por l quincrin podín reproducirse en preprdos teñidos con colorntes no fluorescentes como los colorntes del tipo Romnowski: colorntes de Giems, de Leishmn y de Wright. L técnic utilizd por l Dr Mrin Seright en Inglterr consistí en colorer los preprdos luego de someterlos un digestión con un enzim proteolític: l tripsin. Por otro ldo, Sumner y Evns, en Edinurgo, otenín el mismo resultdo luego de un pretrtmiento de los preprdos con un solución slin 60 ºC. En mos csos se otení un ptrón de nds, luego de l tinción con colornte de Giems, que er entermente equivlente l ptrón de nds Q (de quincrin) otenido por Cspersson. En este ndeo no fluorescente, ls nds que se teñín de oscuro (nds G) ern ls misms que se oservn rillntes en l tinción con quincrin, mientrs que ls nds clrs correspondín ls nds pgds u opcs con quincrin. Este ptrón de nds no fluorescentes se denominó G (de Giems). c Figur 3. Bndeos cromosómicos. () Bndeo Q; () Bndeo G; (c) Bndeo R 2
Durnte l mism époc, en Frnci, Dutrillux y Lejeune oservn que los cromosoms humnos pretrtdos con uffer fosfto de Sørensen ph 6.8 y 60 ºC proporcion un ptrón de nds inverso l ptrón de nds G de Seright y de Sumner-Evns. Ls nds G oscurs se coloren más pálids y ls nds G clrs (nds R) se oservn con tinción más intens. Este ptrón de nds se denominó R (de reverso). El ptrón de nds R, otenido por est técnic, er hitulmente mucho más difuso que el ptrón de nds G otenido por l técnic de Seright o por l de Sumner y Evns; sin emrgo se estleció en Frnci como el prdigm de ls técnics de ndeo cromosómico. Hci fines de los ños 70 el ndeo R fue perfecciondo provechndo el hllzgo de que ls nds R replicn ntes que ls nds G y que ls regiones heterocromátics. El uso de loqueo de l replicción en fse S y sustitución de l timidin por BUdR (romodesoxiuridin) permití colorer en form diferencil ls nds de relicción temprn proporcionndo un ptrón de ndeo tipo R. L técnic consistí en incorporr timidin en l cden de ADN durnte ls etps temprns de l replicción (previs l loqueo) y BUdR durnte ls etps posteriores. De este modo se otení un ndeo R con un visulizción mucho más gud de ls nds. Est técnic se denomin ndeo R de replicción. L colorción finl podí Figur 4. Bndeo R de replicción, coloredo con nrnj de cridin. ser fluorescente (con Nrnj de Acridin) o no fluorescente (con colorntes tipo Romnowski). Durnte los ños 80 se desrrollron técnics pr invertir el orden de incorporción de BUdR y timidin oteniéndose ndeos G de replicción. En el trnscurso de l décd de 1980, y con el perfeccionmiento de ls técnics de microscopí de fluorescenci, se siguió indgndo cerc del efecto de ndeo producido sore los cromosoms humnos por diversos colorntes que interccionn directmente con el ADN. Así se llegó l conclusión de que ls nds R son rics en pres GC y ls nds G son rics en AT, y que los colorntes con finidd por pres GC (como l cromomicin A3) reveln un ptrón de nds R cundo se utilizn pr teñir cromosoms fijdos en metfse, mientrs que los colorntes con finidd por pres AT (como DAPI y Hoechst 33258) reveln un ptrón de nds Q en igules circunstncis. Por otr prte, y desde los ños 70 se desrrollron técnics citogenétics que permitín distinguir selectivmente diverss crcterístics estructurles de los cromosoms: el ndeo C (centromérico), que colore selectivmente ls regiones de heterocromtin constitutiv compuests de secuencis ltmente repetitivs ordends en tndem que se loclizn en undnci (pero no exclusivmente) en ls regiones proximles (pericentromérics); el ndeo NOR (Nocleolr Orgnizer Regions) que consiste en un tinción con nitrto de plt que colore ls regiones orgnizdors nucleolres uicds normlmente en los tllos de los stélites de cromosoms crocéntricos; l técnic hrlequín de colorción diferencil de cromátides que permite oservr intercmios de cromátides hermns (SCE, Sister Chromtid Exchnge); lguns técnics como Giems 11 o Distmicin/DAPI que permiten oservr suconjuntos de regiones heterocromátics; técnics de ptrones de replicción sds en l oservción de ndeos de replicción prciles (G y/o R incompletos); el ndeo T (telomérico), que permite distinguir un suconjunto de nds R con myor concentrción de pres GC que el resto, y que en su myorí (pero no exclusivmente) se loclizn en ls regiones distles (telomérics). Tod est terí de técnics yudó distinguir nomlís cromosómics imposiles de oservr con técnics de colorción homogéne, como por ejemplo inversiones 3
prcéntrics y trnslocciones entre frgmentos cromosómicos de tmño similr que no modificn l morfologí de los cromosoms prticipntes. Entre tods ests técnics ls que permitín diferencir cd cromosom en tod su extensión (ndeo Q, ndeo G y ndeo R) revelron myor utilidd l hor de relcionr ptologís clínics con errciones cromosómics; y ddo que l microscopí de fluorescenci result un medio más oneroso que l microscopí de cmpo clro se impusieron ls técnics no fluorescentes, en prticulr el ndeo G en l myor prte del mundo y el ndeo R en Frnci y píses frncoprlntes. En l Conferenci de Prís, en 1971 quedron estlecids ls regls de nomencltur citogenétic sds principlmente en el ndeo G. Ests norms, hoy conocids como ISCN (Interntionl System of Chromosome Nomenclture) fueron umentds y ctulizds sucesivmente en 1975, 1978, 1981, 1985, 1991, 1995, 2005 y 2009. Figur 5. Técnics selectivs y especiles de colorción. () Bndeo C; () Colorción diferencil de cromátides hermns. Hci fines de los ños 70 l técnic de ndeo G y hí lcnzdo un cierto grdo de desrrollo, suficiente como pr resultr de sum utilidd en l descripción de nomlís cromosómics grosers. Se definieron diversos síndromes de deleciones y se destcó l relción ptognomónic entre diverss trnslocciones recurrentes y neoplsis hemtológics. Se mejoró l técnic citogenétic hst posiilitr l otención de nds G en cromosoms en metfse temprn y en profse trdí. Los cromosoms en etps temprns de l mitosis presentn un cntidd de nds que puede llegr duplicr y hst triplicr l cntidd de nds otenids en cromosoms metfásicos. Est mejor en l resolución del ndeo permitió detectr nomlís cromosómics pequeñs que no ern oservles por ls técnics clásics, o que lo ern con much dificultd. Ls técnics citogenétics en l er pre-ndeo sólo permitín detectr nomlís cromosómics de tmño considerle, cpces de provocr evidentes distorsiones en l morfologí del cromosom. Ls deleciones en pcientes con síndrome de cri du cht son de tmño muy vrile, pero frecuentemente rcn más de l mitd del rzo corto del cromosom 5, lo cul implic por lo menos uns 8 10 M. Ls técnics de ndeo G en metfse permiten detectr nomlís ms fins como deleciones de 5 o 6 M y ls técnics de lt resolución lcnzn diferencir regiones de hst 3 M. (1M=1 megse=1.000.000 de pres de ses en el ADN) L er moleculr Y hci fines de los ños 60 Gll y Prdue pulicron un trjo en el cul demostrn l loclizción espcil del ARN riosómico mrcdo rdictivmente en ovocitos de Xenopus. Este trjo erigió los cimientos sore los cules se desrrolló en ños posteriores un diversidd de metodologís sds en l hiridizción de frgmentos de ácidos nucleicos sore cromosoms en metfse y núcleos en interfse, denominds técnics de hiridizción in situ. Hci principios de l décd del 80 se desrrollron metodologís de hiridizción in situ ADN-ADN con mrcción rdictiv. Ls primers técnics utilizn como sonds, secuencis ltmente repetitivs orgnizds en tndem. Diferencis significtivs entre secuencis lfoides de ls regiones pericentromérics de diferentes cromosoms, hicieron posile lcnzr un hiridizción lo suficientemente selectiv como pr posiilitr l identificción cromosómic. Así se desrrollron sonds centromérics que hirizn sólo 4
con el cromosom 18, o sólo con el cromosom X, por ejemplo. Sin emrgo, ls secuencis lfoides de lgunos cromosoms, como el 13 y el 21, conservn un grdo de similitud demsido lto como pr poder ser discriminds entre sí. Figur 6. Hiridizción in situ fluorescente. () pinting del cromosom 3; () FISH del gen de l región de deleción del síndrome de Willims, loclizdo en 7q11.23, y sond control del rzo lrgo del cromosom 7. Un vnce importnte en el desrrollo de ls técnics de hiridizción in situ fue l detección por métodos no rdictivos, utilizndo técnics de inmunofluorescenci (Vn Prooijen-Knegt y cols., 1982). Hci fines de los ños 80 y principios de los 90 se populrizron los métodos de hiridizción in situ fluorescentes (Fluorescente in situ hyridiztion, FISH) portndo myor precisión en l detección y un procedimiento menos engorroso. Hci 1985, Lndegent y cols. loclizron un gen por primer vez utilizndo técnics de hiridizción in situ no rdictiv. Sin emrgo, todví result dificultos l oservción microscópic de sonds de secuenci únic demsido pequeñs pr ser oservds con uen resolución y sin migüeddes. Con el dvenimiento de métodos decudos pr l seprción de cromosoms, tles como l citometrí de flujo y l hiridizción de céluls somátics, se hizo posile otener sonds de ADN específics pr un único pr cromosómico que coloren un pr cromosómico completo (pinting o pintdo cromosómico). Asimismo, hci fines de los ños 80 se desrrollron técnics de microdisección que hicieron posile l preprción de sonds específics de regiones sucromosómics. Estos eventos umentron enormemente l verstilidd del ls técnics de FISH. Figur 7. Pinting multicolor. () Pinting comintorio de tres fluorocromos pr siete cromosoms; () criotipdo espectrl (SKY). Durnte los ños 90 ls mejors en l preprción de sonds y en l óptic microscópic, l preprción de nuevos fluorocromos y el desrrollo del procesmiento de 5
imágenes computrizdo potenciron ún más l difusión de ls técnics de FISH. Se desrrolló entonces un nuev terí de técnics sds en l cominción de fluorocromos con diferentes colores de emisión. Desde que Nederlof y cols en 1989 difundieron un metodologí comintori pr oservr tres colores prtir de dos fluorocromos, est técnic se fue perfeccionndo hst logrr diferencir 23 o más colores, es decir, un color pr cd pr cromosómico. Así, ls técnics de criotipdo espectrl (spectrl kryotypig, SKY) y M-FISH diferencin cd pr cromosómico con un color distintivo utilizndo cominción de siete o menos fluorocromos diferentes. L comintori de colores conjuntmente con l posiilidd de seprr por microdisección, mplificr, purificr y mrcr con fluorocromos segmentos cromosómicos de diversos tmños, dio lugr l ide de generr cominciones de sonds de distints regiones cromosómics mrcds con diferentes fluorocromos, originndo sí ndeos rtificiles d hoc y con visulizción multicolor (multicolor nding, m-bnding) útiles en csos muy específicos de difícil resolución. Figur 8. Bndeos multicolores. () Criotipo ndedo con técnic m-bnding; () Célul nded con técnic Rx-FISH usndo sonds de pinting de gión. Otr técnic de ndeo multicolor, denomind RxFISH, se s en l hiridizción de especies cruzds: se preprn sonds de pinting multicolor de cromosoms de gión y se hiridizn sore metfses de céluls humns. El ptrón de ndeo otenido revel ls lterciones cromosómics ocurrids durnte l evolución de ms especies, pero demás result de utilidd pr l detección de diverss nomlís citogenétics de difícil resolución por los métodos trdicionles. L técnic Rx-FISH es en relidd un técnic comprtiv entre especies. Pero otr técnic comprtiv entre un genom norml y uno ptológico dentro de l mism especie h resultdo de sum importnci en el desrrollo de técnics sds en l hiridizción in situ deido su potencil pr detectr deslnces cromosómicos muy frecuentes en ptologís oncológics y oncohemtológics. Se trt de l hiridizción genómic comprtiv (comprtive genomic hyridiztion, CGH). Est técnic, descrit por Kllioniemi y col en 1992, consiste revemente en hiridizr metfses normles con un mezcl de ADN genómico mrcdo con un fluorocromo A (por ejemplo FITC) de un individuo norml y ADN genómico mrcdo con un fluorocromo B diferente (por ejemplo Rojo Texs) del individuo cuy ptologí se estudi. Amos ADNs genómicos deen encontrrse en igules cntiddes, de tl mner que compitn entre sí pr hiridizrse con ls metfses normles que les sirven de lnco. En quells regiones en ls que el genom ptológico teng exceso de dosis (trisomís o polisomís totles o prciles), prevlecerá el color correspondiente l fluorocromo B, mientrs que en ls regiones delecionds en el genom ptológico prevlecerá el fluorocromo A. En el resto del criotipo se oservrá un colorción resultnte de l cominción de mos fluorocromos. Generlmente el nálisis se reliz trvés de un softwre que present en form gráfic un perfil de desvición de l fluorescenci hci el verde o hci el rojo pr cd pr cromosómico promedido sore un número determindo de metfses. Est técnic es de much utilidd en l detección de deslnces cromosómicos generdos por errciones estructurles que muy frecuentemente se oservn en preprdos oncohemtológicos. Sin emrgo, el nivel de resolución lcnzdo depende del tmño de ls metfses que se utilizn como lnco de hiridizción. 6
Figur 9. Análisis CGH en un neurolstom. El ADN genómico del neurolstom está mrcdocon FITC mientrs que el ADN control está mrcdo con Rojo Texs. Ls regiones con desvición hci fluorescenci verde presentn exceso de dosis (trisomís prciles), mientrs que ls regiones con desvición l rojo son regiones delecionds en el ADN de prue. Un mplición de l técnic de CGH es l técnic de Arry-CGH. Aquí l hiridizción de l mezcl de ADNs norml y ptológico no se hce sore cromosoms metfásicos sino sore un plc que contiene vrios miles de clones BAC específicos de distints regiones cromosómics ordendos de tl mner de rcr todo el genom o l región prticulr en estudio. L técnic de rry-cgh constituye un versión totlmente moleculr de un técnic citogenétic-moleculr y l principl deficienci con respecto l resto de ls técnics citogenétics reside en que l muestr prolem pierde l integridd de sus cromosoms. Tnto en CGH como en rry-cgh dee extrerse y frccionrse el ADN de l muestr pr hiridizr sore un lnco norml (cromosoms o plcs de BACs), de mner que y no resultrá posile detectr nomlís lnceds como trnslocciones recíprocs o inversiones. Sin emrgo, los niveles de resolución umentn considerlemente llegndo ser detectles deslnces del orden de ls kiloses. Los tmños de deslnces que pueden ser detectdos por rry-cgh sólo están limitdos por l construcción de los BACs. 7
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