Clostridium difficile Confirmación Instituto de Salud Pública de Chile. 6 de Junio de 2012

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María del Carmen Olivares Navarro
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2 Clostridium difficile Historia: 1935, Hall y O Toole : Bacillus difficilis Investigando flora comensal de deposiciones en recién nacidos 1937, Snyder : Cepas toxigénicas y no toxigénicas (ensayos) 1938, Prèvot : Clostridium difficile 1978, Barlett y cols. : Demostraron el papel etiológico de C. difficile en la colitis pseudomembranosa. Características: Bacilo Gram positivo 0,5 x 3-6 µm Anaerobio estricto Produce esporas Productor de toxinas A, B o ambas. Colonias blancas o amarillentas 2-5 mm Olor característico a estiércol (p-cresol) Hábitat: Ha sido aislado de suelos, heno y arena En animales de granja, como también en perros, gatos y roedores En el humano está asintomáticamente como parte de la microbiota del intestino 50% de los neonatos sanos durante el primer año de vida 3 a 5 % de los adultos sanos. 15% enfermos hospitalizados sin diarrea 25% enfermos hospitalizados con tratamiento ATB En el ambiente hospitalario (principal agente nosocomial asociado a diarrea) 2

Características: Bacilo Gram positivo 0,5 x 3-6 µm Anaerobio estricto Produce esporas Productor de toxinas A, B o ambas.

3 Clostridium difficile Factores de virulencia asociados a Clostridium difficile Factores de virulencia Enterotoxina (toxina A) Citotoxina (toxina B) Factor de adhesión Hialuronidasa Formación de esporas Actividad biológica Produce quimiotaxis: induce producción de citocinas, inflamación con hipersecreción de fluido, necrosis hemorrágica Induce la despolimerización de la actina con pérdida del citoesqueleto celular Interviene en la unión a las células colónicas humanas Produce actividad hidrolítica Permite la supervivencia del microorganismo durante meses o años en el medio ambiente. Resist. a altas temperaturas y HCL gástrico, germinan en el Inst. delgado. 3

hemorrágica Induce la despolimerización de la actina con pérdida del citoesqueleto celular Interviene en la unión a las células colónicas humanas Produce actividad

4 Clostridium difficile Características de la cepa NAP1/027: Hiperproductora de ambas toxinas A y B, incremento en la producción de 16 a 20 veces mas que la cepa normal Delección parcial o total del gen tcdc Presenta toxina binaria CDT (cepas normales 4%) Resistencia a ciertas fluoroquinolonas (hasta un 100%) Levofloxacin Gatifloxacin Moxifloxacin 4

Delección parcial o total del gen tcdc Presenta toxina binaria CDT (cepas normales 4%)

5 5

6 Requisito de envío de muestras Tipo de muestra: 6

7 Requisito de envío de muestras Almacenamiento y transporte 7

8 Requisito de envío de muestras Contacto: 8

9 9

10 Instituto de Salud Pública Caracterización de aislamientos C. difficile Cultivo y determinación de toxina Estudio de deleción gen regulador tcdc por PCR y secuenciación Tipificación genética por Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE) según protocolo estandarizado ISP con asistencia técnica del Instituto Nacional de Salud de Quebec, Canadá Tipificación por secuenciación de multilocus MLST Ribotipificación 10

secuenciación Tipificación genética por Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE) según protocolo

11 Instituto de Salud Pública Tipificación Molecular C. difficille Electroforesis de Campo Pulsado PFGE Clon no identificado en base de datos PFGE del INSPQ-Quebec Tres bandas de diferencia, correspondería a variante chilena de NAP-1 Secuenciación de multilocus (MLST) revela ST1, perteneciente a complejo clonal relacionado a cepas NAP-1 Presenta deleción de 18 nt en el gen regulador de producción de toxina tcdc 11

INSPQ-Quebec Tres bandas de diferencia, correspondería a variante chilena de NAP-1 Secuenciación de

12 Test diagnósticos de C.difficile: clasificación 1. Detectan productos de CD GDH (glutamatodeshidrogenasa) Toxinas A y/o B Acidos grasos aromáticos 2. Métodos de cultivo para detección de CD y confirmar productor de toxina (cultivo toxigénico). 3. Detección de genes, PCR : RNA 16 S, genes de toxinas, genes GDH 12

13 Test diagnósticos de C.difficile Target Toxina C. difficile Método del Test Citotoxicidad celular* Inmunoensayos (EIA & membrana) C. difficile Cultivo Detección Antígeno GDH C. difficile toxigénico Cultivo citotoxigénico* PCR L *Los métodos de referencia detectan diferentes targets y no son directamente comparables 13

C. difficile Cultivo Detección Antígeno GDH C.

14 Laboratorio métodos de referencia Citotoxicidad en cultivo celular gold standard tradicional, identifica efecto citopático inducido por toxina B (1978) (células redondeadas)las células Vero son las más sensibles. S: E:85-100% Cultivo anaerobio es lo más sensible, pero poco específico (desarrollo de cepas no toxigénicas). Agares selectivos y cromógenos. Cultivo toxigénico, con detección in vitro de toxina en la cepa asilada, nuevo gold standard, significado clínico debatible (más sensible y menos afectado por la conservación o transporte) 14

S:67-100 E:85-100% Cultivo anaerobio es lo más sensible, pero poco específico (desarrollo de cepas no toxigénicas).

15 Diagnóstico laboratorio ELISA incorporada en 1984, test rápido, reactivos disponibles comercialmente, técnicamente sencillo. Detección de toxinas A y/o B, múltiples técnicas y formatos Detección GDH, enzima exclusiva de CD, detecta colonización por CD. Detección combinada de GDH y toxina PCR : detección y estudio genotípico. 15

Detección de toxinas A y/o B, múltiples técnicas y formatos Detección GDH, enzima

16 Efecto de la prevalencia en VPP a < prevalencia <VPP Se define como test aceptable S:> 90% y E:97% 16

17 Evaluación EIA (toxinas) Resultados heterogéneos Ningún test cumple con criterios de aceptabilidad ( ) 17

18 18

19 Conclusiones del estudio Las técnicas de referencia son lentas, requieren laboratorios especializados y expertos. Las técnicas de EIA son sencillas, rápidas poco sensibles (75-85%) y muy específicas (97-98%) No hay diferencia importante entre S y E entre EIA de pocillo o membrana para detectar toxina, cuando el estándar de referencia es citotoxina. Cuando el estándar de referencia es el cultivo toxigénico, todos los métodos analizados tienen baja sensibilidad, con excepción de los métodos moleculares. EIA que detectan toxinas A y/o B tienden a ser menos sensibles que otros test EIA para detección de GDH es menos específico para detectar CD toxigénico que EIA para toxinas o R-PCR. 19

detectar toxina, cuando el estándar de referencia es citotoxina.

20 Disponibilidad de kits para toxinas C. difficile en el país (Encuesta) Nombre Kit Diagnóstico Sensibilidad Especificidad Distribuidor Técnica C. difficile Tox A/B Test, Techlab 96 % 83.3% 100% 98.7 Medica Tec Inmunoensayo de membrana Toxinas A y B Quick Chek Complete, Techlab 90.5% 83.9% 78.3% J Clin Microbiol. 2010; 48(2): % (Para GDH) Enf Infecc Microbiol Clin, 2012, in press 93.1% 99.7% 100.0% J Clin Microbiol. 2010; 48(2): ,1% (Para GDH) Enf Infecc Microbiol Clin, 2012, in press Medica Tec Inmunoenzayo de membrana GDH + Inmunoensayo de membrana toxinas A y B Xpect C. difficile Toxin A/B Test, Remel 86.3% 82.0% 87.0% Clin Lab. 2008;54(1-2): % 96.2% 100.0% Clin Lab. 2008;54(1-2):9-13 PVEquip Inmunoensayo de membrana 20

100% (Para GDH) Enf Infecc Microbiol Clin, 2012, in press 93.1% 99.7% 100.0% J Clin Microbiol. 2010; 48(2): 603 605.

21 Inmunocard Toxins A/B, Meridian Bioscience Meridian Premier Toxins A/B ELISA, Meridian Bioscience Vidas CDA A+B, Biomerieux Rida Quick, C. difficile Tox A/B, R- Biopharm % Comparado con estudio de citotoxicidad CTA 89.6% 94.7% Comparado con estudio de citotoxicidad CTA 94.8% 69.6% J Clin Microbiol. 2010;48(2): % Comparado con otros métodos comerciales ELISA y PCR 75.7% 100% Dato fabricante. Comparado con otros métodos comerciales: ELISA, PCR % Comparado con estudio de citotoxicidad CTA 99.3% 97.3% Comparado con estudio de citotoxicidad CTA 97.0% 100% J Clin Microbiol. 2010; 48(2): % Comparado con otros métodos comerciales ELISA y PCR 93.1% ProLab ProLab Biomerieu x Inmunoensayo de membrana ELISA Inmunoensayo con lectura en fluorescencia automatizada. 91% Dato fabricante. Comparado con otros métodos comerciales: ELISA, PCR. Microbact Inmunocromatografía 21

22 Agradecimientos: Dra. Erna Cona, Lab. Hospital FACH Dr. Simón Levesque, INSPQ, Quebec 22

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