TESIS Que para obtener el grado de Maestra en Ciencias Quimicobiológicas. PRESENTA QFB Gloria Karina Chimal Ramírez

Transcripción

1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Caracterización de la actividad proteolítica y metastásica de la interacción entre células neoplásicas de mama e histiocitos malignos en un modelo de cocultivo tridimensional. TESIS Que para obtener el grado de Maestra en Ciencias Quimicobiológicas PRESENTA QFB Gloria Karina Chimal Ramírez Directora interna: Dra. María Lilia Domínguez López Directora externa: Dra. María Dolores Utrera Barillas México, D.F. DICIEMBRE, 2008.

2 La presente tesis se realizó: En el Departamento de Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Unidad Profesional Lázaro Cárdenas, IPN, bajo la dirección de la Dra. María Lilia Domínguez López. Y En el Laboratorio de Invasión y Metástasis de la Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, en el Hospital de Oncología, CMN S XXI del IMSS, bajo la dirección de la Dra. María Dolores Utrera Barillas.

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4 AGRADECIMIENTOS Mis más sinceros agradecimientos: A la Dra. Dolores, por todo su apoyo, tiempo, dedicación y paciencia brindados durante este proyecto. Por abrirme las puertas a nuevas oportunidades, conocimientos y experiencias y porque con su ayuda, crecí como persona y como profesionista. A la Dra. Lilia, por su confianza en mi, por los conocimientos, apoyo y tiempo dedicados a este proyecto. A Marta Castro, Miguel Ángel Sandoval y Rita Mota, por su ayuda, por su compañía, por su amistad y por los buenos momentos que pasamos. Al Dr. Luis Benítez, por sus valiosas aportaciones a este proyecto, por su disposición y por compartir sus conocimientos y experiencias. Al Dr. Juan Velázquez y Susana Godina, por todo su apoyo y valiosas aportaciones a este proyecto, por todas las atenciones y ayuda recibidas. Al Dr. Janusz Franco, por su tiempo, conocimientos, disposición y las atenciones recibidas. A la Dra. Hilda Villegas y el Dr. Francisco Martínez, por su apoyo a este proyecto. A la Dra. Alejandra Contreras, por compartir sus conocimientos y por sus valiosas aportaciones a este proyecto. A la Dra. María de Lourdes, por su apoyo y sus valiosas aportaciones a este proyecto. A los compañeros de la ENCB y de la UIMEO, por su compañía y apoyo.

5 DEDICATORIAS Dedico el trabajo y esfuerzo para realizar esta tesis A mi mamá, por su amor, sus sacrificios, su compañía, sus enseñanzas, su ejemplo de vida. Te amo mami, eres la mujer que más admiro. A mi hermano, por su amor, su ayuda, sus consejos, su alegría y su energía contagiosa de vivir. Gracias por estar siempre para mí. A mi papá, por todos sus sacrificios para poder darme una infancia feliz y por todas las cosas buenas que dejó en mi. A Sebastián, por este tiempo maravilloso que hemos compartido. Gracias por tu amor, comprensión y respeto. A mis amigas Claudia, Edith, Derika y Roxana, por su amistad sincera e incondicional. Dedico también este trabajo a la memoria de mi amigo Leonel Alcántara Trejo. Descanse en paz. Gracias Leonel, dondequiera que estés, por tu amistad, por los buenos recuerdos y por tus buenos deseos.

6 ÍNDICE PÁGINA ABREVIATURAS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS RESUMEN ABSTRACT i iv v vi vii I. INTRODUCCIÓN 1 a. Generalidades 1 b. Carcinogénesis 2 c. Cáncer de mama 4 II. ANTECEDENTES 6 a. Microambiente neoplásico 6 b. Genes asociados a la invasión y la metástasis en el cáncer de mama 7 1. Ciclooxigenasa Integrinas Osteopontina Proteasas de matriz extracelular Receptor 1 del factor de crecimiento del endotelio vascular 16 c. Participación de los macrófagos en el cáncer de mama 18 d. Modelo de cultivo celular tridimensionales 20 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 22 IV. HIPÓTESIS 23

7 V. OBJETIVOS 24 a. General 24 b. Particular 24 VI. MATERIALES Y MÉTODOS 25 VII. RESULTADOS 39 a. Líneas celulares MCF MDA-MB U b. Co-cultivos bidimensionales Análisis en microscopio invertido Síntesis de proteasas de matriz extracelular 43 c. Co-cultivos tridimensionales Análisis con microscopía confocal Expresión genética 64 VIII. DISCUSIÓN 73 IX. CONCLUSIONES 86 X. PERSPECTIVAS 87 XI. BIBLIOGRAFÍA 88

8 ABREVIATURAS 2D = Bidimensional 3D = Tridimensional ADN = Ácido desoxirribonucleico ARN = Ácido ribonucleico bfgf = Factor de crecimiento de fibroblastos básicos (del inglés Basic fibroblasts growth factor) BRCA1 = Gen Breast Cancer 1 BRCA2 = Gen Breast Cancer 2 CB = Catepsina B CCL = Quimiocina con dos residuos de cisteína CD34 = Grupo de diferenciación 34 (del inglés Cluster differentiation 34) CD44 = Grupo de diferenciación 44 (del inglés Cluster differentiation 44) CD51 = Grupo de diferenciación 51 (del inglés Cluster differentiation 51) cdna = ADN complementario CO 2 = Dióxido de carbono COX-1/PTGS1 = Ciclooxigenasa 1/ PG-endoperóxido sintasa-1 COX-2/PTGS2 = Ciclooxigenasa 2/ PG-endoperóxido sintasa-2 Cp = Crossing Point CXCR4 = Receptor 4 de quimiocina tipo CXC (del inglés CXC Chemokine Receptor 4) DAB = 3, 3 -diaminobencidina tetrahidrocloruro D-MEM/F-12 = Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 DMSO = Dimetilsulfóxido EDTA = Ácido etilendiaminotetraacético EGF = Factor de crecimiento epidérmico (del inglés Epidermal Growth Factor) EGFR = Receptor del factor de crecimiento epidérmico (del inglés Epidermal Growth Factor Receptor) EHS = Sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm ERs = Receptores de estrógeno (del inglés Estrogen Receptors) FACS = Clasificador de células activado por fluorescencia (del inglés Fluorescence Activated Cell Sorter) i

9 FAK = cinasas de focos de adhesión (del inglés Focal Adhesion Kinases) FITC = Isotiocianato de fluoresceína (del inglés Fluorescein isothiocyanate) GAPDH = Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (del inglés Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) H 2 O DEPC = Agua tratada con dietilpirocarbonato HER-2 = Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (del inglés Human Epidermal growth factor Receptor-2) HGF = Factor de crecimiento de hepatocitos (del inglés Hepatocyte growth factor) HEPES = N-2-hidroxietilpiperazina-N -2-etano sulfonato (del inglés N-(2- hydroxyethyl)-piperazine-n'-2-ethanesulfonic acid HRP = Peroxidasa de rábano (del inglés Horseradish Peroxidase) IL = Interleucina (del inglés Interleukin) INEGI = Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática M-CSF o CSF-1 = Factor estimulante de colonias de macrófagos (del inglés Macrophage-colony stimulating factor) MEC = Matriz extracelular MMP = Metaloproteasa de matriz (del inglés Matrix Metalloprotease) MT1-MMP = Metaloproteasa de matriz tipo 1 de membrana (del inglés Membrane Type-1- Matrix Metalloprotease) NF-κB = Factor nuclear potenciador de la cadena ligera kappa de linfocitos B activados (del inglés Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NK = Células asesinas natrulares (del inglés Natural Killers) OPN = Osteopontina (del inglés Osteopontin) PAI-1 = Inhibidor 1 del activador de plasminógeno (del inglés Plasminogen activator inhibitor-1) PDGF = Factor de crecimiento derivado de plaquetas (del inglés Plateletderived growth factor) PG = Prostaglandina (del inglés Prostaglandin) PGE2 = Prostaglandina E2 (del inglés Prostaglandin E2) PGG2 = Prostaglandina G2 (del inglés Prostaglandin G2) PGT2 = Prostacilcina (del inglés Prostacyclin) ii

10 PMA = 4α-forbol-12-miristato-13-acetato (del inglés Phorbol 12-myristate- 13-acetate) RT-PCR = Reacción en cadena de la polimerasa acoplado a transcriptasa reversa (del inglés Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) TAMs = Macrófagos asociados a tumor (del inglés Tumor associated macrophages) TGF-β = Factor de crecimiento transformante-β (del inglés Transforming growth factor-β) TIMPs = Inhibidores tisulares de metaloproteasas (del inglés Tissue inhibitors of Metalloproteases) TNF-α = Tumor necrosis factor-α o factor de necrosis tumoral-α TPA = 12-O-tetradecanoil-13-acetato (del inglés 12-O-tetradecanoylphorbol- 13-acetate) upa = Activadores de plasminógeno tipo urocinasa (del inglés Urokinase type plasminogen activator) upar = Receptor de activadores de plasminógeno tipo urocinasa (del inglés Urokinase type plasminogen activator receptor) VCAM-1 = Molécula de adhesión de células vasculares-1 (del inglés Vascular cell adhesion molecule-1) VEGF = Factor de crecimiento del endotelio vascular (del inglés Vascular endothelial growth factor) VEGFR = Receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (del inglés Vascular endothelial growth factor receptor) VLA-4 = Antígeno retardado-4 (del inglésvery late antigen-4) iii

11 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Caja de petri de 35mm 30 Figura 2. Curvas de cinética de las reacciones de PCR en tiempo real 38 Figura 3. Monocapa de células MCF-7 39 Figura 4. Monocapa de células MDA-MB Figura 5. Cultivo de células U Figura 6. Co-cultivo de MCF-7 y U937 a los 5 días 42 Figura 7. Co-cultivo de MDA-MB-231 y U937 a los 5 días 42 Figura 8. Expresión de las cuatro proteasas de las células MCF7 44 Figura 9. Expresión de las cuatro proteasas de las células MDA-MB Figura 10. Expresión de las cuatro proteasas de las células U Figura 11. Expresión de proteasas de las células MCF7 (Gráfica) 47 Figura 12. Expresión de proteasas de las células MDA-MB-231 (Gráfica) 48 Figura 13. Expresión de proteasas de las células U937 (Gráfica) 49 Figura 14. Ejemplo de imágenes obtenidas en el microscopio confocal 50 Figura 15. Degradación de colágena: células MCF-7 (Sistema 1) 52 Figura 16. Degradación de colágena: células MCF-7 (Sistema 2) 54 Figura 17. Degradación de colágena: células U937 (Sistema 2) 55 Figura 18. Degradación de colágena: células MDA-MB-231 (Sistema 2) 57 Figura 19. Degradación de colágena: células U937 (Sistema 2) 58 Figura 20. Degradación de colágena: células MCF-7 (Sistema 3) 60 Figura 21. Degradación de colágena: células U937 (Sistema 3) 61 Figura 22. Degradación de colágena: células MDA-MB-231 (Sistema 3) 62 Figura 23. Co-cultivo de células MDA-MB-231 y U937 (Sistema 3) 63 Figura 24. Degradación de colágena: células U937 (Sistema 3) 64 Figura 25. Resultados de expresión relativa de MCF-7 68 Figura 26. Resultados de Cp del gen de OPN en células MCF-7 69 Figura 27. Resultados de expresión relativa de las células U Figura 28. Resultados Cp s de MMP9 y OPN en las células U Figura 29. Resultados de expresión relativa de las células MDA-MB Figura 30. Resultados de Cp del gen de MMP9 en células MDA-MB iv

12 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Tabla de fluoróforos utilizados y sus características 31 Tabla 2. Composición de las mezclas de matrigel utilizadas 33 Tabla 3. Primers utilizados en el RT-PCR tiempo real 36 Tabla 4. Datos de Cp s y expresión relativa del gen de COX-2 65 Tabla 5. Datos de Cp s y expresión relativa del gen de integrina α4β1 66 Tabla 6. Datos de Cp s y expresión relativa del gen de MMP9 66 Tabla 7. Datos de Cp s y expresión relativa del gen de OPN 67 Tabla 8. Datos de Cp s y expresión relativa del gen de VEGFR1 67 Tabla 9. Tabla de resumen de resultados 85 v

13 RESUMEN En México, el cáncer de mama es ya la primera causa de muerte por cáncer en las mujeres. Se sabe que los tumores se encuentran en íntima relación con su microambiente; en el cáncer de mama, la presencia de un elevado infiltrado inflamatorio de macrófagos en el tumor está asociado a un mal pronóstico. Con base en esto, se ha encontrado que, bajo condiciones patológicas como la inflamación, los macrófagos pueden favorecen la proliferación, sobrevivencia, invasión y migración de las células malignas a través de sus productos de secreción, como citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, enzimas, etc. Por ello, es imperativo contar con un modelo experimental dinámico, cuyo microambiente refleje, en lo posible, lo que sucede in vivo para comprender mejor la patobiología del cáncer y que ayude a establecer parámetros útiles para la predicción de la respuesta al tratamiento. Se estandarizó un modelo de cultivo tridimensional utilizando matrigel y colágena marcada con FITC. Para ello se utilizaron dos líneas celulares de carcinoma de mama, una con baja (MCF-7) y otra con alta capacidad proteolítica (MDA-MB-231), que se co-cultivaron cada una con histiocitos malignos (U-937). Como controles se cultivó cada línea celular de forma independiente. Se analizó la capacidad proteolítica de cada una de las líneas celulares (microscopía confocal) y la transcripción (PCR en tiempo real) de algunos genes relacionados con los procesos de invasión y metástasis como son COX-2, OPN, VEGFR1, MMP9 y la integrina α4β1. Las células de mama incrementaron su capacidad proteolítica en cocultivo con los histiocitos malignos; en las MCF-7 se abatió el transcrito de COX-2 en co-cultivo y se indujo el de OPN tanto en el control como en el cocultivo. Por otro lado, en las MDA-MB-231 se incrementó el transcrito de COX-2 en el co-cultivo y se abatió el de VEGFR1 en el control. En las células U937, la transcripción de los genes COX-2 y MMP9 se incrementó e indujo, respectivamente, al co-cultivarse con MDA-MB-231 y no así con las MCF-7. En el modelo de co-cultivo en tridimensional estandarizado se pudo diferenciar la capacidad proteolítica de cada estirpe celular en los co-cultivos, con respecto a los controles, así como los niveles de expresión del transcrito de los genes en estudio. vi

14 ABSTRACT In Mexico, breast cancer is already the first cancer-related cause of death in women. Tumors are known to establish an intimate relationship with their microenvironment: in breast cancer, an elevated macrophage infiltrate is associated with a poor prognosis. Based on this, recent findings indicate that under pathological conditions such as inflammation, macrophages contribute to proliferation, survival, invasion, and migration processes of malignant cells through their secretion products, such as cytokines, chemokines, growth factors, enzymes, etc. Hence, the need of a dynamic experimental model, whose microenvironment reflects the in vivo conditions to the greatest degree, in order to achieve a better understanding of the pathobiology of cancer, and furthermore to establish useful therapeutic response prediction parameters. A matrigel and DQ collagen IV-based 3D culture model was standardized for this purpose. We used two breast adenocarcinoma cell lines: the poorly invasive MCF-7 cell line, and the highly invasive MDA-MB-231 cell line. Each was co-cultivated with the human histiocytic lymphoma cell line U937. As controls, all three cell lines were cultivated separately. Proteolytic activity of the cell lines in 3D cultures was analyzed (laser confocal microscopy), as well as their transcription (Real time RT-PCR) of five invasion and metastasis processes-related genes (COX-2, OPN, VEGFR1, MMP9, and integrin α4β1). Proteolytic activity of both breast cancer cell lines was enhanced in cocultures with U937 cells; in MCF-7 cells, transcription of COX-2 gene was depleted when co-cultured, while transcription of OPN gene was induced in both control and co-culture. In contrast, transcription of COX-2 gene was enhanced in MDA-MB-231 when co-cultured, while transcription of VEGFR1 gene was depleted in control. In U937 cells transcription of COX-2 and MMP9 was increased and induced, respectively, when co-cultured with MDA-MB-231 cells, but not with MCF-7 cells. In the 3D culture model standardized for each cell line, it was possible to differentiate their proteolytic capacity in controls from that in co-cultures, as well as transcription levels of the genes under study. vii

15 I. INTRODUCCIÓN a. Generalidades El término cáncer, acuñado por Hipócrates, proviene del griego karkinos, que significa cangrejo. Este nombre surgió debido a la gran similitud que hay entre la forma anatómica de un cangrejo y la de la masa tumoral que se desarrolla en el carcinoma de mama. Otros términos utilizados para nombrar a esta patología son neoplasia ( nuevo crecimiento ) y tumor maligno (1). La aparición de una neoplasia en un individuo es el resultado de múltiples procesos que llevan a una proliferación celular ilimitada, por la evasión de los mecanismos fisiológicos de control del crecimiento, diferenciación y desarrollo normales. El problema clínico del cáncer son los procesos de invasión y de metástasis, que implican la destrucción de tejido normal que rodea a la neoplasia y la diseminación a otros tejidos y órganos distantes, que conducen finalmente a la muerte del huésped. Las neoplasias presentan dos componentes básicos: 1) las células transformadas, y 2) estroma de sostén, constituido por la matriz extracelular y por células propias de tejido conjuntivo, así como vasos sanguíneos y linfáticos. Este hecho es de relevancia para poder explicar el proceso carcinogénico, como se verá más adelante. Como es ampliamente conocido, existen tumores benignos y tumores malignos. Los tumores benignos, en su mayoría, están constituidos por células que tienen una gran similitud anatómica y funcional a las células normales de las que se originan. Presentan un crecimiento lento, en forma de masas expansivas, rodeadas por una cápsula de tejido conjuntivo en su parte periférica. No atraviesan dicha cápsula ni infiltran los tejidos adyacentes normales. Gracias a esta característica, se facilita su remoción quirúrgica. Para su nomenclatura, generalmente se utiliza el sufijo oma. Por ejemplo, entre los tumores mesenquimantosos benignos están el lipoma, fibroma, angioma, osteoma y leiomioma. En contraste, los tumores malignos generalmente presentan un grado de diferenciación menor que el de sus contrapartes benignas, además de que pueden observarse patrones de crecimiento con diferentes grados de - 1 -

16 diferenciación (desde bien, hasta pobremente diferenciados). La pérdida de diferenciación o anaplasia, es el rasgo más importante de las células malignas. Presentan polimorfismo nuclear y celular, hipercromatismo, mitosis abundantes, un incremento en la relación núcleo-citoplasma y una desorganización total de la estructura tisular. La mayor parte de los tumores malignos presenta un crecimiento más rápido que los tumores benignos. No obstante, algunos cánceres crecen lentamente durante años hasta que muestran finalmente una fase de crecimiento rápido y otros crecen rápidamente desde sus etapas iniciales (2). Se clasifican en carcinomas (de origen epitelial) y sarcomas (de origen mesenquimatoso). Su nomenclatura se ha establecido de acuerdo al tipo histológico. Por citar un ejemplo, los tumores epiteliales malignos que se originan en glándulas se denominan adenocarcinomas, en cambio los que se originan de músculo liso se denominan leiomiosarcomas. b. Carcinogénesis A partir de la década de los años 20 s se iniciaron los estudios experimentales para generar tumores en animales de laboratorio, utilizando distintos compuestos químicos, con el fin de conocer el proceso carcinogénico. Como resultado de estos estudios se propuso el modelo de carcinogénesis inducida en piel (1, 3), el cual consiste de tres etapas, ellas son: Iniciación. Etapa de duración corta, casi instantánea, causada por un agente químico, físico o biológico que provoca un daño o defecto específico en el ADN. El efecto es duradero y aditivo (4). Las células más susceptibles al daño son aquellas con capacidad de dividirse. Las células iniciadas son indistinguibles morfológicamente de las células normales (5). Promoción. Es un proceso lento, reversible y no aditivo. El principal efecto de los agentes promotores es la hiperplasia y la destrucción de las uniones intercelulares (6, 7). A nivel experimental los ésteres de forbol son clásicos agentes promotores, a nivel fisiológico las hormonas pueden cumplir este papel (8)

17 Progresión. Esta etapa es irreversible y clínicamente aparente. Rous y Kidd propusieron este concepto en 1941 (9), que años más tarde converge con la idea de la inestabilidad genética propuesta por Nowell (10, 11). Básicamente, los defectos genéticos de las células iniciadas que se encuentran en proliferación incrementada (por efecto de algún promotor) favorecen rupturas cromosómicas y translocaciones, resultando en la aparición de nuevas clonas. Sólo algunas de las clonas generadas, las más agresivas, sobreviven por la presión selectiva que ejercen la respuesta inmune del huésped, la hipoxia, la escasez de nutrientes, la quimioterapia, etc. El resultado clínico global es el crecimiento acelerado del tumor, la invasión, la presencia de metástasis y la resistencia a la quimioterapia. Posteriormente Vogelstein, en cáncer de colon, propuso otro modelo más detallado en el cual describe la activación de oncogenes asociados a la pérdida de varios genes que normalmente son supresores (1). Actualmente se considera que el desarrollo de una neoplasia involucra la adquisición de múltiples cambios genéticos y epigenéticos que causan ganancias o pérdidas aberrantes de las funciones de diferentes proteínas celulares. En conjunto, dichos cambios alteran de forma significativa el comportamiento de las células neoplásicas (12). Hanahan y Weinberg propusieron que las siguientes seis alteraciones en la fisiología celular caracterizan el crecimiento maligno: 1) incremento del potencial proliferativo, 2) disminución de la sensibilidad a la apoptosis, 3) producción autónoma de señales de crecimiento, 4) insensibilidad a señales de inhibición de crecimiento, 5) potencial angiogénico y 6) capacidad migratoria e invasora (13). Como ya se mencionó anteriormente, las células neoplásicas se encuentran inmersas en el estroma, el cual constituye una barrera física para la expansión de la neoplasia, pero también puede proveer estímulos importantes que en un momento dado contribuyen a su crecimiento e incluso favorecen el proceso metastásico. Así, dada la gran importancia de la participación del microambiente en el proceso carcinogénico y la complejidad de su composición, numerosos estudios se han enfocado a su análisis

18 c. Cáncer de mama En la actualidad, se desarrolla cáncer de mama en aproximadamente una de cada diez mujeres a lo largo de la vida (2). De acuerdo con las últimas estimaciones estadísticas de GLOBOCAN 2002 (14), actualmente el cáncer de mama es la neoplasia más probable para la población femenina mundial, registrándose más de nuevos casos cada año. El panorama epidemiológico de esta patología en la población mexicana se transformó en los últimos 50 años y el cáncer mamario ha pasado a ser un grave problema de salud pública (15). Las estadísticas de mortalidad del INEGI indican que en 2004 el cáncer de mama ocasionó el 13.3% de los fallecimientos por cáncer en mujeres mexicanas. Para el año 2006, según la misma fuente, la cifra sólo disminuyó al 13%. En nuestro país, la edad de presentación más frecuente es entre los 45 y 59 años (16). Este patrón sugiere que los estrógenos son uno de los agentes involucrados en la patogénesis de esta neoplasia (17). Los factores de riesgo más importantes para el desarrollo del cáncer mamario son los siguientes: Historia familiar. Las mujeres con familiares de primer grado que han padecido cáncer de mama tienen un riesgo 2 a 5 veces mayor que la población general (2). Factores genéticos. Están implicadas las alteraciones genéticas de p53, BRCA-1, BRCA-2, ATM y PTEN. Sin embargo, estas mutaciones sólo explican del 5 al 10% de todos los cánceres de mama, probablemente debido a su baja frecuencia alélicas en la población general (18, 19). Factores reproductivos. El tiempo de exposición a hormonas sexuales endógenas durante la vida constituye un factor importante. El máximo riesgo lo presentan las mujeres con menarquia temprana y menopausia tardía, ya que su vida fértil es más prolongada (20 22). Es más frecuente en nulíparas que en multíparas y en las mujeres con el primer embarazo después de los 30 años (23). Exposición a hormonas exógenas. Se ha comprobado que existe un incremento estadísticamente significativo de riesgo de cáncer de mama en las mujeres que ingieren anticonceptivos orales (24)

19 Dieta e ingesta de alcohol. El consumo de más de 60g de alcohol al día y el alto consumo de carne bien cocida y de grasas, especialmente ácidos grasos insaturados, han sido asociados al incremento del riesgo de cáncer de mama (25 27). Obesidad y poca actividad física (28, 29). La glándula mamaria se compone de lóbulos y lobulillos conectados mediante conductos. El cáncer de mama se origina en las estructuras ductales y glandulares de la mama. La clasificación de los principales tipos de carcinoma de mama es la siguiente (2): A. No invasores (no infiltrantes). 1a. Carcinoma intraductal. 1b. Carcinoma intraductal con enfermedad de Paget. 2. Carcinoma lobulillar in situ. B. Invasores (infiltrantes). 1a. Carcinoma ductal infiltrante sin otra especificación. 1b. Carcinoma ductal infiltrante con enfermedad de Paget. 2. Carcinoma lobulillar invasor. 3. Carcinoma medular. 4. Carcinoma coloide (carcinoma mucinoso). 5. Carcinoma tubular. 6. Carcinoma adenoide quístico. 7. Carcinoma apocrino. 8. Carcinoma papilar invasor. Aproximadamente el 80% de los carcinomas son ductales y el resto son lobulillares (2). Una célula neoplásica de mama generalmente se duplica cada días (30). Una neoplasia de mama de 1cm realiza cerca de 30 duplicaciones antes de alcanzar este tamaño, por lo que este cáncer tiene, como mínimo, unos siete años de evolución (15). Esta simple estimación sugiere la utilidad de la detección temprana y el mejoramiento de las estrategias de tratamiento para reducir la mortalidad

20 II. ANTECEDENTES a. Microambiente neoplásico En 1889 el cirujano inglés Stephen Paget publicó su hipótesis conocida como semilla y tierra para explicar que los patrones de metástasis no son fortuitos (31). Fue el primero en sugerir que las interacciones entre las células malignas, las células del huésped y su microambiente son factores críticos en la regulación de la carcinogénesis. De acuerdo a la teoría de Paget, ciertas células neoplásicas (las semillas ), son afines al ambiente que favorece su crecimiento (la tierra ), así la metástasis sólo ocurre cuando la semilla y la tierra son compatibles. En los últimos años se ha retomado este concepto y se ha generado un gran conocimiento a nivel celular y molecular sobre los componentes de la tierra en la regulación del crecimiento neoplásico, entre ellos: 1) la matriz extracelular (MEC), 2) las células del estroma, 3) los vasos sanguíneos y linfáticos y 4) las células inflamatorias (32). El microambiente neoplásico varía entre los distintos tipos de neoplasias y etapas de su evolución. Está reportado que los cambios patológicos en el microambiente favorecen la progresión de la neoplasia. Una de las observaciones más consistentes, es la inflamación, la cual se ha asociado a cánceres epiteliales. El infiltrado inflamatorio incluye linfocitos, neutrófilos, macrófagos y células cebadas. Estas células se comunican a través de moléculas de adhesión, citocinas, quimiocinas y receptores de superficie, creando una red compleja de interacciones celulares, que sin duda, tienen un efecto muy importante sobre las células neoplásicos y las del estroma (32). En la progresión de la neoplasia, el microambiente del tumor primario favorece la diseminación de las células neoplásicas, su motilidad y su invasión local hacia vasos linfáticos y/o sanguíneos (proceso de intravasación). En cambio, el microambiente de las metástasis debe favorecer la adhesión celular, la proliferación, la angiogénesis (formación de vasos sanguíneos) y la linfangiogénesis (formación de vasos linfáticos). Estos dos últimos procesos son una de las contribuciones esenciales del microambiente, una neoplasia simplemente no puede progresar si no existe formación de vasos que las nutra, - 6 -

21 oxigene y transporte. Existen mecanismos adicionales mediante los cuales el microambiente influye sobre el fenotipo metastásico de las células malignas, entre ellos: cambios en la composición glico-proteínica de la matriz extracelular que alteran la adhesión, la motilidad, la proliferación y la tasa apoptótica de las células neoplásicas; las proteinasas que degradan la matriz extracelular, facilitando el movimiento de las células malignas al eliminar la barrera del estroma; la liberación de fragmentos de la matriz extracelular biológicamente activos y/o factores de crecimiento que promueven o inhiben la progresión neoplásica (33). b. Genes asociados a la invasión y la metástasis en el cáncer de mama. Varios estudios se han enfocado a la búsqueda de factores pronósticos y predictivos en cáncer de mama. Los factores pronósticos evalúan el riesgo de recaída de los pacientes basados en indicadores tales como, biología intrínseca del tumor y etapa clínica en el momento del diagnóstico. Además, orientan a los médicos a determinar qué pacientes requieren terapia adyuvante. Los factores predictivos, en cambio, se refieren a determinar la respuesta de un tumor particular a un tratamiento específico, esto es qué terapia adyuvante es la más apropiada. Dentro del primer grupo, el estado ganglionar (positivo o negativo) es el parámetro más importante que se utiliza para definir el nivel de riesgo en las etapas tempranas de cáncer de mama. Ejemplos del segundo grupo es la presencia de receptores de estrógenos y/o de progesterona y sobreexpresión del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano o HER2/neu, sin embargo no todas las pacientes con receptores de estrógeno positivas se benefician de la terapia endocrina y no todas las pacientes con sobre-expresión de HER2/neu, son sensibles al trastuzumab (inhibidor de la actividad de cinasa de HER2/neu), reflejando la complejidad genética del cáncer de mama. Hasta el momento, no hay un solo factor predictivo aceptado de forma universal (34). El diagnóstico temprano y la terapia adyuvante sistemática (quimioterapia y terapia hormonal) reducen considerablemente el riesgo de - 7 -

22 metástasis. Sin embrago la terapia adyuvante tiene efectos secundarios a corto y largo plazo e implica gastos médicos elevados (35). Por tanto, se requieren métodos y/o marcadores con valor predictivo más precisos que apoyen al personal clínico a orientar la terapia adyuvante. Actualmente, se evalúa el riesgo de los pacientes para desarrollar metástasis con base en criterios clínicos, como el tamaño del tumor, estatus ganglionar y grado histológico. Entre el 70 y 80% de los pacientes que reciben terapia adyuvante bajo esos criterios, podrían haber sobrevivido sin ella (36), sufriendo efectos secundarios tóxicos por la terapia adyuvante innecesaria. Dada esta situación, es necesario contar con estudios predictivos para definir el riesgo de las pacientes de desarrollar metástasis y proporcionarles la terapia más adecuada. El desarrollo de la tecnología de los microarreglos de DNA, es una herramienta poderosa de análisis para la investigación del cáncer. La evaluación simultánea de la expresión de miles de genes en un solo experimento ha generado un gran conocimiento sobre la biología tan compleja del cáncer, tal información ha permitido definir perfiles génicos con valor pronóstico, sin embargo su potencial predictivo es controversial. Varios grupos han publicado diferentes perfiles génicos con valor pronóstico (37 43). El grupo de van t Veer identificó un grupo de 70 genes asociados a un mal pronóstico y a la aparición de metástasis a corto plazo (38). El grupo de Wang identificó un perfil pronóstico de 76 genes en pacientes con ganglios linfáticos negativos que no habían recibido tratamiento adyuvante (39). Comparando los dos estudios mencionados, se puede observar que únicamente coinciden en tres genes. Resultados tan diversos entre los diferentes grupos de investigación, dificultan la identificación de los genes específicos asociados a un mal pronóstico en cáncer de mama. Los desacuerdos entre los perfiles de expresión se deben, en parte, al uso de diferentes plataformas de microarreglo, diferente selección de pacientes y, en general, distintos procedimientos experimentales (44). Algunos de los genes reportados en la literatura que con mayor frecuencia se relacionan con los procesos de invasión y metástasis en el cáncer de mama son los siguientes: ciclooxigenasa 2, integrinas, metaloproteasas, osteopontina y receptor 1 del factor de crecimiento del endotelio vascular

23 1. Ciclooxogenasa 2 La familia de las ciclooxigenasas comprende dos miembros: COX-1 o PTGS1 (PG-endoperóxido sintasa-1), cuya expresión generalmente se considera ubicua y COX-2 o PTGS2 (PG-endoperóxido sintasa-2) que se expresa constitutivamente sólo en algunos tejidos como la placenta, el cerebro y el riñón (45,46). Sin embargo, la sobre-expresión de COX-2 puede estimularse por diversos factores incluyendo citocinas, factores de crecimiento y oncogenes, además es un gen de respuesta temprana en el proceso inflamatorio. Las dos enzimas COX catalizan la conversión de ácido araquidónico a prostaglandina G2 (PGG2) y ésta a su vez en prostaglandina H2, que es un sustrato para múltiples isomerasas, las responsables de generar productos eicosanoides como la prostaglandina E2 (PGE2), la prostaciclina (PGI2) y el tromboxano A2. Los prostanoides derivados de COX contribuyen en muchas funciones fisiológicas la agregación plaquetaria, funciones gástricas y renales y varios procesos reproductivos femeninos (47,48). Los eicosanoides son también mediadores clave del dolor, la fiebre e inflamación. De ahí que las enzimas COX sean los blancos de analgésicos comunes como los fármacos antiinflamatorios no esteroidales. En años recientes ha crecido el interés por la participación de la familia de las ciclooxigenasas y la síntesis de prostaglandinas en el cáncer. La activación aberrante de la ruta de señalización de COX/PG está ampliamente difundida en las neoplasias humanas (45,48). La sobre producción de la isoforma inducible de COX-2 se ha identificado en muchos tipos de cáncer y lesiones precancerosas. Inicialmente se detectó en el cáncer colorrectal, pero también se ha encontrado una sobre expresión de COX-2 en aproximadamente el 40% de los casos de cáncer de mama así como en las lesiones pre-invasivas de carcinoma ductal in situ (49-62). Diversos análisis epidemiológicos sugieren un efecto protector de fármacos inhibidores de COX en cáncer de colon y mama. Estas observaciones indican que COX-2 es un buen candidato como blanco molecular para la prevención del cáncer de mama (47). En las neoplasias de mama, la presencia de la proteína COX-2 se confina predominantemente al epitelio (57, 61). El papel que juega su expresión - 9 -

24 en el estroma aún no está bien determinado. Sin embargo, su sobre expresión se correlaciona con varios de los parámetros característicos de un cáncer de mama agresivo que incluyen: un tumor de gran tamaño, etapa avanzada de la enfermedad, tasa de proliferación elevada, ausencia de receptores de hormonas y sobre expresión del HER2/neu (49, 60, 62, 63). Ristimaki y colaboradores (62) identificaron una relación inversa entre los niveles de proteína de COX-2 y la sobrevida libre de enfermedad. La alta frecuencia de sobre expresión de COX-2 en el carcinoma ductal in situ, sugiere que la señalización de COX/PG puede ser un blanco útil para prevenir la progresión a la etapa invasiva. (49, 53, 56, 57, 59, 64, 65). En modelos experimentales de cáncer de mama en roedores se ha observado que la inhibición de la actividad de COX-2 utilizando fármacos antiinflamatorios no esteroideos o su ablación genética disminuye la formación, crecimiento y desarrollo de la neoplasia. Por el contrario, su sobre-expresión transgénica es suficiente para inducir el desarrollo de la neoplasia mamaria (47, 66, 67, 68, 69). 2. Integrinas Como ya se ha establecido, las interacciones entre las células tumorales y la matriz extracelular ejercen una influencia importante sobre el desarrollo de las neoplasias, modulan la proliferación y sobrevida celular, así como la capacidad de migrar más allá del tumor primario e invadir otros tejidos para formar metástasis. Muchas de estas interacciones están mediadas por las integrinas, una familia de moléculas de adhesión que se expresa de forma ubicua. Las integrinas son esenciales para el anclaje de células y participan ampliamente en el control de la migración celular, la progresión del ciclo celular y la muerte celular programada. En estos procesos actúan en sinergia con otras rutas de transducción de señales (70). Las integrinas conforman una de las familias más importantes de moléculas de adhesión celular (71, 72). Se trata de moléculas heterodiméricas constituidas por una subunidad α y una β que se unen de manera no covalente. Los genomas de los mamíferos contienen 18 genes de subunidades alfa y

25 genes de subunidades beta. Se han identificado ya 24 combinaciones alfa-beta diferentes (73). Ambos tipos de subunidades son proteínas transmembranales de tipo I, poseen dominios extracelulares largos y, por lo general, dominios citoplasmáticos cortos (74, 75). Dentro del citoplasma, las integrinas coordinan el ensamblaje de las proteínas del citoesqueleto y complejos de señalización; su dominio extracelular interactúa con macromoléculas de la matriz extracelular o con receptores de superficie de células adyacentes. Gracias a estas funciones bidireccionales de las integrinas, las células se pueden integrar a su microambiente (76, 77). En años recientes se ha observado que las integrinas tienen una participación evidente en prácticamente todas las etapas de la progresión del cáncer. La transformación maligna, regularmente, va acompañada de cambios en la expresión de integrinas y en la preferencia de sus sustratos. Varios fármacos que se están estudiando en el área clínica actúan como antagonistas de las integrinas y han tenido efectos prometedores como antiangiogénicos, antiproliferativos y antimetastásicos en modelos experimentales en ratones (78). La integrina α4β1 o VLA-4 (del inglés Very Late Antigen-4) se expresa en células del sistema inmune y en otros tipos de células en todo el cuerpo. Entre sus ligandos se encuentran la fibronectina (una de las proteínas que componen la matriz extracelular) y la molécula de adhesión VCAM-1 (del inglés Vascular Cell Adhesion Molecule-1), uno de los receptores de superficie de células endoteliales y macrófagos. Esta integrina une a la célula que la expresa con la matriz extracelular. Como resultado de esta interacción se transmiten señales que modifican las funciones celulares por la vía de la activación de la cinasa FAK (cinasa de focos de adhesión), en respuesta a variaciones en el microambiente (79). En el 2000, Pender y colaboradores, encontraron que la interacción entre la integrina α4β1 y VCAM-1 facilita la migración de células mesenquimales a través de la matriz extracelular, proceso que induce la sobreexpresión de metaloproteasas de matriz tipo 1 de membrana (MT1-MMP, del inglés Membrane Type-1-Matrix Metalloproteinase) y la producción de Gelatinasa A (MMP-2) activada. Estos resultados y otros más, sugieren que la

26 expresión de esta integrina podría conferir a la célula un fenotipo migratorio (79,80). 3. Osteopontina La osteopontina (OPN) es una glicoproteína fosforilada de secreción y de unión a calcio. Adquirió este nombre debido a que fue aislada por primera vez de tejido óseo. Su estructura incluye una secuencia de arginina-lisina-ácido aspártico con la cual puede interactuar con integrinas de superficie celular como la αvβ3, αvβ1, αvβ5, α4β1, α9β1 y α8β1, entre otras. La OPN se expresa de forma constitutiva en varios tejidos y fluidos corporales en condiciones normales. Es abundante en los huesos y otros tejidos mineralizados. Su expresión se eleva en condiciones patológicas como el cáncer, procesos inflamatorios, remodelamiento vascular, enfermedades renales, etc. (81). La contribución de la OPN en la transformación maligna puede darse por diferentes vías. Una de ellas es por su interacción con las integrinas. Recientemente se encontró que la línea celular metastásica de cáncer de mama MDA-MB-435 utiliza la integrina αvβ3 para migrar en dirección a la OPN (82), además se observó que las células transformadas que son capaces de expresar dicha integrina para interactuar con la OPN presentan resistencia a la apoptosis (83). La OPN también puede unirse a otro tipo de receptores de superficie como lo es la molécula CD44. Esta unión también está mediada por integrinas β1, y a través de ella se induce extensión celular y migración (84). Una consecuencia más de la unión entre OPN e integrinas es la inducción de proteasas como los activadores de plasminógeno de tipo urocinasa (upa), su receptor (upar) y diferentes metaloproteasas de matriz (85-90). Por este mecanismo la OPN participa en la degradación de la matriz extracelular y en la invasión de las células malignas. La relación entre la OPN y la angiogénesis en la transformación maligna es otro tema de estudio en la actualidad. La angiogénesis es un proceso complejo que requiere la acción coordinada de factores de crecimiento y sus receptores, proteínas extracelulares, moléculas de adhesión y enzimas proteolíticas (91-94). La OPN interacciona con la integrina αvβ3, expresada en

27 las células endoteliales neovasculares estimulando la regeneración y reparación vascular; en conjunto con el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF, del inglés Vascular Endothelial Growth Factor) estimula la adhesión y la migración de células endoteliales (95, 96, 97) y a través del factor de transcripción NFκB protege a las células endoteliales de la apoptosis (98). Por otro lado, las células malignas que secretan OPN promueven la infiltración de células inflamatorias como los macrófagos (99, 100), cuya relevancia en el desarrollo del cáncer de mama se discutirá más adelante. Es importante mencionar que tanto las células neoplásicas como los macrófagos pueden ser fuentes de OPN en los tumores primarios (101). 4. Proteasas de matriz extracelular Para que la célula neoplásica invada, se requiere la degradación de la membrana basal y de la matriz extracelular. Este proceso se lleva a efecto por múltiples proteasas de matriz extracelular, incluyendo las metaloproteasas de matriz (MMPs, del inglés Matrix Metalloproteases), entre las cuales destacan la MMP-2 y la MMP9; las serino-proteasas como los activadores de plasminógeno tipo urocinasa (upa); las aspártico-proteasas como la catepsina D y las cisteíno-proteasas como la catepsina B (102). La familia de MMPs humanas incluye al menos 25 miembros, la mayoría son endopeptidasas dependientes de zinc que escinden más de un componente de la matriz extracelular y cada componente de ésta misma, generalmente puede ser degradado por más una MMP. Otra función de las MMPs es la liberación de factores de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β, de sus siglas en inglés Transforming Growth Factor-β) y del VEGF, entre otros. El efecto de la sobre-expresión o inhibición de las MMPs en el desarrollo neoplásico puede ser compleja, ya que estas proteasas son capaces de promover procesos relevantes de la transformación maligna como la proliferación, apoptosis, angiogénesis y metástasis (103). En particular, las metaloproteasas MMP2 y MMP9 (también conocidas como gelatinazas o colagenasas) están implicadas en la

28 degradación de la colágena tipo IV, el componente principal de las membranas basales, dicho proceso se considera esencial en el desarrollo de los carcinomas y la metástasis. Ambas proteasas son secretadas como zimógenos, para activarse deben ser escindidas por otras proteasas; además, su actividad se encuentra regulada de forma estricta por diferentes mecanismos, uno de ellos es por acción de los inhibidores de metaloproteasas de tejido (TIMPs, de sus siglas en inglés Tissue Inhibitors of Metaloproteases). En estudios previos se ha reportado que tanto el transcrito como la proteína de la MMP9 están sobre expresados ya en el carcinoma lobular in situ, por lo que se ha propuesto como blanco de terapia quimiopreventiva para evitar su progresión (104). Las catepsinas conforman otra clase importante de proteasas implicadas en la interacción compleja entre el tumor y el estroma. Las catepsinas se subdividen en aspárticas y cisteínicas. La mayoría de estas proteasas son lisosomales, pero algunas son de secreción o de membrana. Las mejor caracterizadas son las cisteínicas, de las cuales se han identificado 11 en los humanos. Algunas de éstas, se expresan de forma constitutiva, como la catepsina B, y otras solamente en algunos tipos de células, como la catepsina K. Muchas de estas proteasas, incluyendo a la catepsina K, son secretadas y el sustrato de cada una varía mucho en función de su localización, ya sea lisosomal o extracelular. También existen inhibidores naturales de las catepsinas cisteínicas, como las cistatinas A, B y C. Se ha descrito una multitud de funciones en condiciones tanto fisiológicas como patológicas llevadas a cabo por las catepsinas (105, 106). Se ha demostrado que tanto las células malignas como las células del estroma asociadas al tumor (entre ellas: células endoteliales y macrófagos) expresan estas proteasas. Su cantidad y nivel de expresión cambia durante la progresión de la neoplasia (107). Por ejemplo, se ha observado una expresión incrementada de la catepsina B en los bordes invasivos de muchos tumores. La expresión alterada y la actividad en la interfase tumor-estroma sugieren que esta proteasa puede jugar un papel clave en los eventos asociados a la invasión tumoral. Se ha demostrado que la catepsina B activa a la proteasa serínica pro-upa para convertirse en upa y éste a su vez activa al factor de crecimiento transformante β (TGF-β, de sus siglas en inglés Transforming Growth Factor-β). La catepsina B también

29 aumenta la actividad de las MMPs directamente mediante la activación de las pro-enzimas, e indirectamente, a través de la degradación de los inhibidores de las MMPs de los tejidos (102). Los componentes del sistema de activación del plasminógeno participan tanto en rutas proteolíticas como en no proteolíticas durante la progresión del cáncer (108, 109). El plasminógeno es el zimógeno central de este sistema, es secretado como una proteína glicosilada de cadena simple con un residuo N- terminal de ácido glutámico, contiene cinco sitios de unión a lisina para su activación y un dominio C-terminal (110). El plasminógeno puede ser activado a plasmina, una proteasa de amplio espectro, por varias proteasas como el activador de plasminógeno tisular, los factores XIa y XIIa y la calicreína, mediante la escisión del enlace peptídico entre la arginina 561 y la valina 562 (111). Sin embargo, el activador de plasminógeno tipo urocinasa (upa) se considera el activador de plasminógeno más significativo durante la degradación tisular (112, 113). Esta serino-proteasa se secreta como el zimógeno de 53kDa pro-upa, se encuentra en la superficie celular unido a su receptor upar (112). El upa activado consiste en dos cadenas, la cadena A contiene un domino de tipo factor de crecimiento y la cadena B contiene el dominio de proteasa (114). La activación recíproca del pro-upa por plasmina y viceversa es un mecanismo de regulación importante para la actividad de la plasmina (115). Existen amplias evidencias del papel de los upa como reguladores clave de la invasión y metástasis en cáncer de mama y otros tipos de neoplasias (116, 117). En cáncer de mama, se ha reportado que niveles altos de upa y uno de sus inhibidores, PAI-1, se asocian a un intervalo libre de enfermedad más corto y en general a un mal pronóstico (109, 118). Existen niveles significativamente más altos de upa y upar en la superficie de células metastáticas de cáncer de mama, las cuales son capaces de unir a una mayor cantidad de plasminógeno a la superficie celular, que las células no metastáticas (119). Se ha demostrado que existe una interacción directa, aunque no a través del sitio activo, entre la cadena A del upa y el plasminógeno en la superficie de las células monocíticas U937 (120). También se encontró que la fracción amino terminal del upa es la mediadora de la activación del plasminógeno y de la activación recíproca de pro-upa por la plasmina (121). Así, el incremento del upa activado puede ser un paso crucial

30 para el proceso de la invasión tumoral y la metástasis, mediante el control de los niveles de plasminógeno activado en la superficie celular y la cantidad de plasminógeno que puede capturar (122). Las cascadas proteolíticas, en las cuales las proteasas se activan unas a otras, parecen ser la base del proceso invasivo. En los cánceres ováricos, por ejemplo, se ha encontrado que la catepsina B inicia la cascada proteolítica mediante la activación del pro-upa, lo que resulta finalmente en la degradación de la matriz extracelular (123, 124). Esto es congruente con los estudios en los que, al utilizar inhibidores de cisteino-proteasas reducen la degradación e invasión de las células de cáncer ovárico (125). La degradación pericelular de la matriz extracelular, por parte de las células de cáncer de mama, es consistente con una cascada proteolítica de catepsina B, serino-proteasas y MMPs (126). 5. Receptor 1 del factor de crecimiento del endotelio vascular Como sucede con muchos tumores sólidos, los cánceres de mama requieren de la generación de nuevos vasos sanguíneos (neovascularización) si crecen más allá de unos cuantos milímetros de diámetro. Los nuevos vasos no solamente ayudan a cubrir las demandas metabólicas crecientes del tumor mediante el abastecimiento de nutrientes adicionales, sino que también proporcionan rutas potenciales para la diseminación del tumor y el establecimiento de metástasis (127). En los capilares normales quiescentes, las células endoteliales están en contacto con una membrana basal rica en laminina y de 1 a 2 pericitos que les proporciona sostén. Durante la angiogénesis, las conexiones con los pericitos adyacentes deben debilitarse y la membrana basal debe ser degradada. Las células endoteliales entran nuevamente a ciclo celular e invaden la matriz del estroma, invasión que es facilitada por las moléculas de adhesión a integrinas (128). Una vez formado el nuevo vaso, las células endoteliales inician la síntesis de moléculas de membrana basal, salen de ciclo y se reclutan pericitos hacia los capilares recién formados para auxiliar en el proceso de maduración