PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO.

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1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 72 Tests P/N: CMV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVCAP PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent USO PREVISTO La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV es una prueba de amplificación in vitro de ácidos nucleicos para la cuantificación del ADN del citomegalovirus en plasma humano conservado en EDTA mediante el equipo COBAS AmpliPrep para el procesamiento de muestras automático y el analizador COBAS TaqMan o el analizador COBAS TaqMan 48 para la amplificación y la detección automáticas. La prueba puede cuantificar el ADN del CMV en el intervalo de 150 a copias/ml. Una copia de ADN del CMV (definida con la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV) equivale a 0,91 unidades internacionales (UI) [1,1 cp/ui] según el primer estándar internacional de la OMS para técnicas de amplificación de ácidos nucleicos del citomegalovirus humano (NIBSC 09/162) 40. La prueba se emplea junto con datos clínicos u otros marcadores de laboratorio en el diagnóstico y el tratamiento de la infección por CMV en pacientes con riesgo de padecer la enfermedad producida por el CMV. La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV no está indicada para utilizarse como prueba de detección sistemática de la presencia del CMV en sangre o hemoderivados ni como prueba diagnóstica para confirmar la presencia de una infección por CMV. Los resultados de la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV deben interpretarse en el marco de todos los datos clínicos y de laboratorio relevantes. RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA El citomegalovirus humano (CMVH o CMV) es un patógeno vírico humano que pertenece a la familia Herpesvirus, presente tanto en sociedades industriales desarrolladas como en grupos aborígenes aislados. 1,2 Puede transmitirse a través de la sangre, las secreciones orofaríngeas, la orina, las excreciones uterinas y vaginales, los fluidos espermáticos, la leche materna, las lágrimas y las heces. 3-9 Las infecciones primarias del CMV en personas inmunocompetentes suelen ser asintomáticas y, con frecuencia, dan lugar a infecciones latentes no detectadas. Los puntos de infección principales parecen ser las células mononucleares de sangre periférica y las células endoteliales. El CMV permanece en fase latente en los monocitos/macrófagos humanos. 2 En las personas con infección latente, el virus puede propagarse intermitentemente a sus fluidos corporales y, de este modo, pueden infectar a otros. Las personas inmunocomprometidas, como los recién nacidos, los pacientes trasplantados y los pacientes con SIDA, presentan un alto riesgo de desarrollar infecciones por CMV graves que pueden derivar en una tasa de morbilidad y mortalidad más elevada. 10 Entre las manifestaciones clínicas graves de la enfermedad producida por el CMV, se incluyen el síndrome del CMV, la retinitis, la gastroenteritis, la hepatitis, la encefalitis, la esofagitis, la enterocolitis, la pancreatitis y la neumonía Los métodos de laboratorio para el diagnóstico de infecciones diseminadas y enfermedades de órganos activas causadas por el citomegalovirus humano, incluyen el aislamiento del virus mediante cultivo de leucocitos de sangre periférica (LSP), histología de biopsias, métodos serológicos, determinación del antígeno pp65 y detección del ADN del CMV a través de métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 14 El valor predictivo de los métodos para ensayos de cultivo es reducido: los resultados tardan entre 48 horas y 3 semanas y tienen un uso limitado, especialmente para pacientes inmunocomprometidos. El ensayo pp65 de antigenemia requiere un trabajo intensivo y, para realizarlo, es necesario que la sangre se procese en el plazo de seis horas desde la extracción, debido al descenso de antigenemia que se produce durante el almacenamiento. 15,22 El ensayo pp65 también resulta difícil de llevar a cabo en pacientes neutropénicos graves. El apartado de información de revisión del documento se halla al final del documento ES 1 Doc Rev. 2.0

2 Se ha demostrado que la obtención de resultados positivos del ADN del CMV en plasma mediante PCR se corresponde con un resultado positivo en el cultivo de LSP y con un incremento del riesgo de desarrollar una enfermedad sistémica ocasionada por el CMV. Existen diversos estudios que demuestran la asociación entre la carga vírica del CMV y el riesgo de desarrollar una enfermedad provocada por el CMV El riesgo de que se produzcan enfermedades originadas por el CMV está claramente relacionado con la carga vírica elevada, lo que subraya la importancia de la función de los títulos víricos en la patogénesis de la enfermedad. 18,27,30,31 Se han realizado estudios con receptores de trasplantes y pacientes con SIDA que demuestran que la detección por PCR del ADN del CMV es altamente predictiva del desarrollo posterior y los resultados clínicos de la enfermedad. 17,23-26 Las valoraciones cuantitativas de los niveles del ADN del CMV demuestran que las cargas víricas elevadas, así como los incrementos de carga vírica a lo largo del tiempo, se asocian a peores pronósticos clínicos para determinados estados de riesgo del CMV. 18,27,28 Asimismo, los ensayos por PCR cuantitativos permiten la monitorización de la eficacia del tratamiento 26,29,30, 32 antivírico y la evaluación indirecta de la resistencia vírica. Las directrices actuales para el tratamiento en el trasplante de órganos sólidos recomiendan utilizar la carga vírica del CMV para monitorizar a los pacientes ante el riesgo a que desarrollen una enfermedad ocasionada por el CMV y debido a la necesidad de un tratamiento preventivo, y para monitorizar a los pacientes con una enfermedad provocada por el CMV activa a fin de observar la respuesta al tratamiento. 21,22 También se recomienda su uso como parte de los criterios de diagnóstico para identificar enfermedades derivadas del CMV en receptores de trasplantes de médula ósea. 33 PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV es una prueba de amplificación de ácidos nucleicos para la cuantificación del ADN del citomegalovirus (CMV) en plasma humano. La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV se basa en dos procesos principales: (1) preparación de la muestra para aislar el ADN del CMV y (2) amplificación mediante PCR del ADN del fragmento objetivo y detección simultánea de la sonda oligonucleótida doblemente marcada, escindida y específica del fragmento objetivo. La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV permite la preparación automatizada de la muestra seguida de la amplificación mediante PCR y la detección de ADN del fragmento objetivo del CMV y ADN del estándar de cuantificación (QS) del CMV también automatizadas. El reactivo de mezcla maestra contiene cebadores (primers) y sondas específicas tanto para el ADN del CMV como para el ADN del QS del CMV. La detección del ADN amplificado se realiza utilizando sondas oligonucleótidas doblemente marcadas específicas para el fragmento objetivo y para el QS respectivamente que permiten la identificación independiente del amplicón del CMV y el amplicón del QS del CMV. La cuantificación del ADN vírico del CMV se realiza empleando el QS del CMV. El estándar compensa los efectos de inhibición y controla los procesos de preparación y amplificación para permitir una cuantificación más exacta del ADN del CMV presente en cada muestra. El QS del CMV es un constructo de ADN no infeccioso que contiene sitios de unión a cebadores idénticos a los del ADN del fragmento objetivo del CMV y una región exclusiva de unión a la sonda que permite distinguir el amplicón del QS del CMV del amplicón del fragmento objetivo del CMV. El QS del CMV se añade a cada una de las muestras en un número de copias conocido y está presente durante los pasos posteriores de preparación de las muestras y amplificación mediante PCR y detección simultánea de las sondas oligonucleótidas doblemente marcadas y escindidas. El analizador COBAS TaqMan o el analizador COBAS TaqMan 48 calcula la concentración de ADN de CMV presente en las muestras de prueba comparando la señal del CMV con la señal del QS del CMV para cada muestra y control. Selección del fragmento objetivo Se utiliza un método de preparación de muestras genérico basado en sílice para capturar el ADN del CMV y el ADN del QS del CMV y se utilizan oligonucleótidos definidos como cebadores para la amplificación del ADN del CMV y el ADN del QS del CMV. Una sonda oligonucleótida doblemente marcada específica para el fragmento objetivo y para el QS respectivamente permite la identificación independiente del amplicón del CMV y el amplicón del QS del CMV. La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV utiliza dos cebadores de ES 2 Doc Rev. 2.0

3 amplificación para PCR. Una sonda doblemente marcada generadora de señal se hibrida con una de las dos cadenas para posteriormente ser escindida por la ADN polimerasa Z05 durante la extensión de los cebadores. Preparación de la muestra La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV utiliza la preparación automatizada de la muestra en el equipo COBAS AmpliPrep mediante una técnica de captura genérica basada en sílice. El procedimiento procesa 500 μl de plasma. Se lleva a cabo la lisis de las partículas víricas del CMV mediante incubación a alta temperatura con una proteasa y un tampón de lisis/unión caotrópico que libera los ácidos nucleicos y protege al ADN del CMV liberado de las DNasas presentes en el plasma. Junto con el reactivo de lisis y las micropartículas magnéticas, se introducen en cada muestra proteasa y un número conocido de moléculas de ADN del QS del CMV. Posteriormente, se incuba la mezcla, y el ADN del CMV y el ADN del QS del CMV quedan unidos a la superficie de las micropartículas magnéticas. Las sustancias no unidas, tales como sales, proteínas y otras impurezas celulares, se eliminan mediante el lavado de las micropartículas magnéticas. Tras la separación de las micropartículas magnéticas y la completa realización de los pasos de lavado, los ácidos nucleicos adsorbidos se eluyen a temperatura elevada con una solución acuosa. Se añade entonces la muestra procesada, que contiene el ADN del CMV y el ADN del QS del CMV liberados, a la mezcla de amplificación que se transfiere al analizador COBAS TaqMan o al analizador COBAS TaqMan 48. Amplificación mediante PCR La reacción de amplificación mediante PCR se lleva a cabo con la enzima ADN polimerasa termoestable recombinante de Thermus specie Z05 (Z05). En presencia de magnesio (Mg 2+ ) y bajo condiciones de tampón apropiadas, Z05 presenta actividad de ADN polimerasa. 34 Esto permite que la amplificación mediante PCR tenga lugar junto con la detección en tiempo real del amplicón. Las muestras procesadas se añaden a la mezcla de amplificación en tubos de amplificación (tubos K) donde se produce la amplificación mediante PCR. En presencia de Mg 2+ y un exceso de desoxinucleótidos trifosfatos (dntps), entre los que se encuentran trifosfatos de desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina, desoxiuridina y desoxitimidina, la polimerasa Z05 extiende los cebadores hibridados para formar cadenas de ADN. Amplificación del fragmento objetivo El termociclador del analizador COBAS TaqMan o del analizador COBAS TaqMan 48 calienta la mezcla de reacción para desnaturalizar el ADN bicatenario y exponer las secuencias del fragmento objetivo del cebador específicas. A medida que la mezcla se enfría, los cebadores se hibridan con el ADN del fragmento objetivo. La polimerasa Z05, en presencia de Mg 2+ y un exceso de desoxinucleótidos trifosfatos (dntps), prolonga la fase de annealing de los cebadores a lo largo de la plantilla del fragmento objetivo para producir moléculas de ADN bicatenario denominadas amplicón. El analizador COBAS TaqMan o el analizador COBAS TaqMan 48 repite automáticamente este proceso durante un número de ciclos predeterminado, con el fin de duplicar en cada ciclo la cantidad de ADN amplicón. El número de ciclos requerido se programa previamente en el analizador COBAS TaqMan o en el analizador COBAS TaqMan 48. La amplificación tiene lugar únicamente en la región del genoma del CMV situada entre los cebadores. No se amplifica el genoma entero del CMV. Amplificación selectiva La amplificación selectiva del ácido nucleico del fragmento objetivo de la muestra se logra en la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV mediante el uso de la enzima AmpErase (uracil-nglicosilasa) y el trifosfato de desoxiuridina (dutp). La enzima AmpErase reconoce y cataliza la destrucción de las cadenas de ADN que contienen desoxiuridina, 35 pero no del ADN que contiene desoxitimidina. El ADN natural carece de desoxiuridina que, sin embargo, está siempre presente en el amplicón debido al uso de trifosfato de desoxiuridina como uno de los dntps del reactivo de la mezcla maestra; por lo tanto, sólo el amplicón contiene desoxiuridina. La desoxiuridina permite que la enzima AmpErase pueda destruir el amplicón contaminante antes de la amplificación del ADN del fragmento objetivo. Además, la enzima AmpErase destruye cualquier producto inespecífico que se pueda formar tras la activación inicial de la mezcla maestra por el magnesio. La enzima AmpErase, que se incluye en el reactivo de la mezcla maestra, cataliza la escisión del ADN que contiene desoxiuridina en la posición de los residuos de desoxiuridina ES 3 Doc Rev. 2.0

4 abriendo la cadena de la desoxirribosa en la posición C1. Cuando se calienta en el primer paso del ciclo térmico, la cadena de ADN amplicón se rompe en la posición de la desoxiuridina, por lo que el ADN ya no puede amplificarse. La enzima AmpErase permanece inactiva durante un período de tiempo prolongado una vez expuesta a temperaturas superiores a los 55 C, es decir, durante los pasos de la ciclación térmica y, por consiguiente, no destruye el amplicón del fragmento objetivo formado durante la amplificación. Detección de productos de la PCR en una prueba COBAS TaqMan La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV utiliza la tecnología de PCR en tiempo real 36,37. El uso de sondas marcadas con doble marcador fluorescente permite detectar en tiempo real la acumulación del producto de la PCR mediante la supervisión de la intensidad de emisión de los marcadores emisores (reporter) fluorescentes liberados durante el proceso de amplificación. Las sondas constan de sondas oligonucleótidas específicas para el CMV y el QS del CMV con un marcador emisor y un marcador silenciador (quencher). En la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV, las sondas del CMV y del QS del CMV están marcadas con diferentes marcadores emisores fluorescentes. Cuando las sondas están intactas, la proximidad del marcador silenciador suprime la fluorescencia del marcador emisor debido a efectos de transferencia de energía de tipo Förster. Durante la PCR, la sonda se hibrida con una secuencia del fragmento objetivo y se escinde por la actividad de las nucleasas 5' 3' de la ADN polimerasa Z05 termoestable. Cuando se han liberado y separado el marcador emisor y el marcador silenciador, cesa el enmascaramiento (quenching) y la actividad fluorescente del marcador emisor experimenta un aumento. La amplificación del ADN del CMV y del ADN del QS del CMV se mide de forma independiente a distintas longitudes de onda. Este proceso se repite durante un número de ciclos predeterminado, aumentando en cada ciclo la intensidad de emisión de los marcadores emisores individuales, lo que permite la identificación independiente del ADN del CMV y del ADN del QS del CMV. El ciclo de la PCR en el que la curva de crecimiento adquiere forma exponencial está relacionado con la cantidad de material de partida presente al inicio de la PCR. Fundamentos de la cuantificación en una prueba COBAS TaqMan La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV ofrece resultados cuantitativos en un intervalo dinámico muy amplio puesto que la supervisión del amplicón se realiza durante la fase exponencial de la amplificación. Cuanto más alto sea el título de CMV de una muestra, antes se apreciará la fluorescencia del marcador emisor de la sonda del CMV por encima del nivel de fluorescencia que constituye la línea de base (consulte la ilustración 1). Puesto que la cantidad de ADN del QS del CMV es la misma para todas las muestras, la fluorescencia del marcador emisor de la sonda del QS del CMV debería aparecer en un ciclo similar para todas ellas (consulte la ilustración 2). En muestras en las que la fluorescencia del QS se vea afectada, la concentración se ajusta en consonancia. La aparición de las señales fluorescentes específicas se comunica como un valor umbral crítico (Ct). El Ct se define como el número de ciclo fraccional en el que la fluorescencia del marcador emisor supera un umbral predeterminado (el nivel de fluorescencia asignado) y comienza la fase de crecimiento exponencial de la señal (consulte la ilustración 3). Los valores de Ct más altos indican un menor título de material del fragmento objetivo del CMV inicial. En general, una duplicación del título se relaciona con una disminución de 1 Ct para el ADN del fragmento objetivo del CMV, mientras que una disminución de 3,3 Ct se relaciona con un aumento de 10 veces del título. La ilustración 1 muestra ejemplos de curvas de crecimiento correspondientes al fragmento objetivo para una serie de diluciones que abarcan un intervalo de 5-log 10. A medida que aumenta la concentración del virus, las curvas de crecimiento se desplazan hacia ciclos más tempranos. Por lo tanto, la curva de crecimiento situada más a la izquierda corresponde al nivel de título vírico más alto, mientras que la situada más a la derecha corresponde al nivel de título vírico más bajo ES 4 Doc Rev. 2.0

5 Ilustración 1 Curvas de crecimiento del fragmento objetivo para una serie de diluciones del virus que abarcan un intervalo de 5-log 10 Fluorescencia normalizada Título más alto Título más bajo Número de ciclo La ilustración 2 muestra ejemplos de curvas de crecimiento correspondientes al estándar de cuantificación para las muestras de una serie de dilución del virus que abarca un intervalo de 5-log 10. La cantidad de estándar de cuantificación añadida a cada muestra es constante para cada reacción. El valor de Ct correspondiente al estándar de cuantificación es similar con independencia del título vírico. Ilustración 2 Curvas de crecimiento del estándar de cuantificación para una serie de dilución del virus que abarca un intervalo de 5-Log 10 Fluorescencia normalizada Título más bajo Título más alto Número de ciclo La ilustración 3 constituye un ejemplo de la normalización de los valores de fluorescencia en cada ciclo de cada curva de crecimiento. El número de ciclo fraccional (Ct) se calcula como el punto donde la señal de fluorescencia intersecciona con el nivel de fluorescencia asignado ES 5 Doc Rev. 2.0

6 Ilustración 3 Valores de fluorescencia obtenidos en cada ciclo normalizados para cada curva de crecimiento Fluorescencia normalizada Nivel de fluorescencia asignado Valor Ct = 27,3 Número de ciclo Cuantificación del ADN del CMV La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV cuantifica el ADN vírico del CMV utilizando una segunda secuencia diana (estándar de cuantificación del CMV) que se añade en una concentración conocida a cada muestra de prueba. El QS del CMV es un constructo de ADN no infeccioso que contiene fragmentos de secuencias del CMV con regiones de unión a cebadores idénticas a las de la secuencia del fragmento objetivo del CMV. El QS del CMV contiene regiones de unión a cebadores del CMV y genera un producto de amplificación con la misma longitud y composición de bases que el ADN del fragmento objetivo del CMV. Se ha modificado la región de unión de la sonda de detección del QS del CMV para diferenciar el amplicón del QS del CMV del amplicón del CMV del fragmento objetivo. Durante la fase de annealing de la reacción PCR en el analizador COBAS TaqMan o en el analizador COBAS TaqMan 48, las muestras se iluminan y excitan con luz filtrada, lo que permite recoger los datos de emisión de fluorescencia filtrada correspondientes a cada muestra. Las lecturas obtenidas para cada muestra se corrigen entonces para compensar fluctuaciones instrumentales. El equipo envía esas lecturas de fluorescencia al programa AMPLILINK y las almacena en una base de datos. Se utilizan comprobaciones previas para determinar si los datos de ADN del CMV y ADN del QS del CMV constituyen conjuntos válidos. Asimismo, se generan avisos cuando los datos están fuera de límites prefijados. Una vez completadas y superadas todas las comprobaciones previas, las lecturas de fluorescencia se procesan para generar valores de Ct correspondientes al ADN del CMV y al ADN del QS del CMV. Se utilizan constantes de calibración específicas del lote incluidas con la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV para calcular el título de las muestras y los controles en función de los valores de Ct obtenidos para el ADN del CMV y el ADN del QS del CMV. Los resultados de títulos se comunican en copias/ml (cp/ml) ES 6 Doc Rev. 2.0

7 REACTIVOS COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMV CS1 (Casete de reactivo de micropartículas magnéticas) Micropartículas magnéticas Tampón Tris-base 0,09% de azida sódica 0,1% de metilparabén CMV CS2 (Casete de reactivo de lisis CMV) Citrato de sodio dihidratado 42,5% de tiocianato de guanidina 3,6% de polidocanol 1,8% de ditiotreitol Xn 42,5% (p/p) de tiocianato de guanidina CMVCAP 72 pruebas 1 x 72 pruebas 1 x 72 pruebas Nocivo R20/21/22-R52/53-R32: Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel. Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. En contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. S24/25-S36/37/39-S61: Evítese el contacto con los ojos y la piel. Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad. CMV CS3 Casete de multireactivos para CMV, que contiene: Pase (Solución de proteinasa) Tampón Tris < 0,05% de EDTA Cloruro de calcio Acetato de calcio 7,8% de proteinasa Glicerol Xn 7,8% (p/p) de proteinasa 1 x 72 pruebas 1 x 3,8 ml Nocivo R36-R42: Irrita los ojos. Posibilidad de sensibilización por inhalación. S23-S45: No respirar los vapores. En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). EB (Tampón de elución) Tampón Tris-base Hidróxido de sodio 0,09% de azida sódica 1 x 8,1 ml ES 7 Doc Rev. 2.0

8 CMV CS4 Casete de reactivos específico para la prueba CMV, que contiene: CMV QS (Estándar de cuantificación del CMV) Tampón Tris-HCl EDTA < 0,005% de ARN Poli Ar (sintético) < 0,001% de ADN plásmido no infeccioso (microbiano) que contiene secuencias de unión a cebadores del CMV y una región exclusiva de unión a sonda 0,05% de azida sódica CMV MMX (Mezcla maestra para CMV) Tampón tricina Acetato de potasio Hidróxido potásico < 20% de sulfóxido de dimetilo Glicerol < 0,05% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01% de cebadores ascendente y descendente del CMV < 0,01% de aptámero oligonucleótido < 0,01% de sondas oligonucleótidas marcadas con fluorescente específicas para el CMV y el estándar de cuantificación del CMV < 0,05% de ADN polimerasa Z05 (microbiana) < 0,1% de enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasa) (microbiana) 0,09% de azida sódica MgCl 2 (Solución de magnesio para CAP/CTM) < 0,6% de cloruro de magnesio 0,09% de azida sódica CMV H(+)C (Control positivo alto del CMV) < 0,001% de fago Lambda que contiene ADN del CMV Plasma humano, no reactivo según pruebas autorizadas por la FDA de EE.UU. para anticuerpos frente al HCV, anticuerpos frente a HIV-1/2 y antígeno p24 del HIV o ARN del HIV-1, HBsAg y ADN del CMV no detectables mediante el método de PCR. 1 x 72 pruebas 1 x 6,2 ml 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml 6 x 0,65 ml 0,1% de conservante ProClin 300 Xi (3:1) mezcla de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona y 2-metil-2H-isotiazol-3-ona Irritante S24-S37: Evítese el contacto con la piel. Úsense guantes adecuados. R43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel ES 8 Doc Rev. 2.0

9 CMV L(+)C (Control positivo bajo del CMV) < 0,001% de fago Lambda que contiene ADN del CMV con un promedio de concentración aproximadamente 100 veces inferior al promedio de concentración del ADN del CMV en CMV H(+)C Plasma humano, no reactivo según pruebas autorizadas por la FDA de EE.UU. para anticuerpos frente al HCV, anticuerpos frente a HIV-1/2 y antígeno p24 del HIV o ARN del HIV-1, HBsAg y ADN del CMV no detectables mediante el método de PCR. 6 x 0,65 ml 0,1% de conservante ProClin 300 Xi (3:1) mezcla de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona y 2-metil-2H-isotiazol-3-ona Irritante S24-S37: Evítese el contacto con la piel. Úsense guantes adecuados. R43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. CMV ( ) C (Control negativo del CMV) Plasma humano, no reactivo según pruebas autorizadas por la FDA de EE.UU. para anticuerpos frente al HCV, anticuerpos frente a HIV-1/2 y antígeno p24 del HIV o ARN del HIV-1, HBsAg y ADN del CMV no detectables mediante el método de PCR. 6 x 0,65 ml 0,1% de conservante ProClin 300 Xi (3:1) mezcla de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona y 2-metil-2H-isotiazol-3-ona Irritante S24-S37: Evítese el contacto con la piel. Úsense guantes adecuados. R43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. CMV H(+)C Clip (Clip de código de barras para control positivo alto del CMV) CMV L(+)C Clip (Clip de código de barras para control positivo bajo del CMV) CMV ( ) C Clip (Clip de código de barras para control negativo del CMV) 1 x 6 clips 1 x 6 clips 1 x 6 clips COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reactivo de lavado COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR (Reactivo de lavado COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Citrato de sodio dihidratado < 0,1% de N-metilisotiazolona-HCl PG WR 1 x 5,1 l ES 9 Doc Rev. 2.0

10 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES A. PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO. B. Esta prueba está diseñada para su uso con plasma humano recogido en anticoagulante EDTA. C. No pipetee con la boca. D. No se debe comer, beber ni fumar en las áreas de trabajo del laboratorio. Utilice guantes desechables, batas de laboratorio y protección ocular para manipular las muestras o los reactivos del kit. Lávese bien las manos después de manipular las muestras y los reactivos de las pruebas. E. Evite la contaminación microbiana y con nucleasa de los reactivos cuando extraiga alícuotas de los viales de control. F. Se recomienda la utilización de pipetas estériles desechables y puntas de pipetas exentas de DNasa. G. No mezcle controles de distintos lotes o de distintos viales de un mismo lote. H. No mezcle casetes de reactivos o controles de distintos kits. I. No abra los casetes COBAS AmpliPrep ni cambie, mezcle, retire o añada botellas. J. Elimine los reactivos no utilizados, así como los desechos y las muestras, según las reglamentaciones nacionales, federales, estatales y locales. K. No utilice los kit con posterioridad a la fecha de caducidad. L. Puede solicitar Hojas de datos de seguridad del material (Material Safety Data Sheets, MSDS) en su oficina local de Roche. M. Las muestras y los controles deben tratarse como si fueran infecciosos, siguiendo los procedimientos de seguridad de laboratorio como los descritos en la publicación Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 y en el documento M29-A3 del CLSI. 39 Limpie y desinfecte minuciosamente todas las superficies de trabajo con una solución recién preparada de hipoclorito de sodio al 0,5% de agua destilada o desionizada. Nota: la lejía doméstica comercial contiene normalmente hipoclorito de sodio en una concentración del 5,25%. Mediante dilución en proporción 1:10 de la lejía doméstica se obtendrá una solución de hipoclorito de sodio al 0,5%. N. PRECAUCIÓN: los reactivos CMV ( ) C, CMV L(+)C y CMV H(+)C contienen plasma humano derivado de sangre humana. El material de origen ha sido probado con resultado no reactivo para la presencia de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), anticuerpos frente al HIV-1/2 y al HCV, y antígeno p24 del HIV o ARN del HIV-1. El análisis del plasma humano negativo mediante el método de PCR no muestra niveles detectables de ADN del CMV. Ningún método de prueba conocido puede garantizar totalmente que un producto derivado de la sangre humana no transmitirá agentes infecciosos. Por lo tanto, cualquier material de procedencia humana debería considerarse potencialmente infeccioso. Los reactivos CMV ( ) C, CMV L(+)C y CMV H(+)C deben tratarse como si fueran infecciosos, siguiendo los procedimientos de seguridad de laboratorio como los descritos en la publicación Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 y en el documento M29-A3 del CLSI. 39 Limpie y desinfecte minuciosamente todas las superficies de trabajo con una solución recién preparada de hipoclorito de sodio al 0,5% de agua destilada o desionizada. O. Los reactivos MGP, EB, CMV QS, MgCl 2 y CMV MMX contienen azida sódica. La azida sódica puede reaccionar con las tuberías de plomo o cobre y formar azidas metálicas muy explosivas. Al desechar soluciones que contengan azida sódica por los fregaderos del laboratorio, deje correr grandes cantidades de agua por el desagüe para evitar la acumulación de azidas. P. Utilice protección ocular, batas de laboratorio y guantes desechables para manipular cualquier reactivo. Evite el contacto de estos materiales con la piel, los ojos o las membranas mucosas. En caso de contacto, lave inmediatamente la zona afectada con abundante agua. Pueden producirse quemaduras si se deja sin tratar. Si se derrama alguno de estos reactivos, dilúyalo con agua antes de limpiarlo con un paño ES 10 Doc Rev. 2.0

11 Q. No permita que el reactivo CMV CS2 ni los residuos líquidos del equipo COBAS AmpliPrep, que contienen tiocianato de guanidina, entren en contacto con la solución de hipoclorito de sodio (lejía). Tales mezclas pueden producir gases muy tóxicos. R. Cuando deseche las cubetas de reacción (SPU) COBAS AmpliPrep, que contienen tiocianato de guanidina, evite el contacto con soluciones de hipoclorito de sodio (lejía). Tales mezclas pueden producir gases muy tóxicos. REQUISITOS DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACIÓN A. No congele los reactivos ni los controles. B. Almacene los reactivos CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 y CMV CS4 a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C. Sin usar, estos reactivos se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada. Una vez usados, los reactivos permanecen estables durante 70 días a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C o hasta la fecha de caducidad, lo que se produzca primero. Los reactivos CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 y CMV CS4 pueden utilizarse para un máximo de 6 ciclos instrumentales, hasta acumular un máximo de 100 horas totales en el equipo COBAS AmpliPrep. Entre ciclos instrumentales, los reactivos deben almacenarse a una temperatura comprendida entre 2 y 8 ºC. C. Almacene los controles CMV H(+)C, CMV L(+)C y CMV ( ) C a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C. Los controles se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada. Una vez abiertos, deben desecharse las partes sobrantes. D. Almacene los clips de código de barras [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip y CMV ( ) C Clip] a una temperatura comprendida entre 2 y 30 C. E. Almacene el reactivo PG WR a una temperatura comprendida entre 2 y 30 C. PG WR se mantiene estable hasta la fecha de caducidad indicada. Una vez abierto, el reactivo es estable durante 28 días a una temperatura comprendida entre 2 y 30 C o hasta su fecha de caducidad, lo que se produzca primero. MATERIALES SUMINISTRADOS A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMV CS1 (Casete de reactivo de micropartículas magnéticas para CMV) CMV CS2 (Casete de reactivos de lisis para CMV) CMV CS3 (Casete de multireactivos para CMV) CMV CS4 (Casete de reactivo específico para la prueba CMV) CMV H(+)C (Control positivo alto del CMV) CMV L(+)C (Control positivo bajo del CMV) CMV ( ) C (Control negativo del CMV) CMV H(+)C Clip (Clip de código de barras para control positivo alto del CMV) CMV L(+)C Clip (Clip de código de barras para control positivo bajo del CMV) CMVCAP ES 11 Doc Rev. 2.0

12 CMV ( ) C Clip (Clip de código de barras para control negativo del CMV) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reactivo de lavado COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR PG WR (Reactivo de lavado COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS Instrumentos y software Equipo COBAS AmpliPrep Analizador COBAS TaqMan o analizador COBAS TaqMan 48 Opcional: Docking Station Opcional: equipo cobas p 630 Programa AMPLILINK, versión 3.3 Series Ordenador del programa AMPLILINK, con impresora Manuales del programa AMPLILINK v3.3 Series: Manual del equipo COBAS AmpliPrep para su uso con el analizador COBAS TaqMan, el analizador COBAS TaqMan 48 o el equipo cobas p 630, y el programa AMPLILINK, versión 3.3 Series Analizador COBAS TaqMan (con Docking Station opcional) para su uso con el Manual de aplicaciones del programa AMPLILINK, versión 3.3 Series Manual del equipo del analizador COBAS TaqMan 48 para su uso con el Manual de aplicaciones del programa AMPLILINK versión 3.3 Series Manual de aplicaciones del programa AMPLILINK versión 3.3 Series para su uso con el equipo COBAS AmpliPrep, el analizador COBAS TaqMan, el analizador COBAS TaqMan 48 y el analizador COBAS AMPLICOR O Manual de aplicaciones del programa AMPLILINK versión 3.3 Series para su uso con el equipo COBAS AmpliPrep, el analizador COBAS TaqMan, el analizador COBAS TaqMan 48 y el equipo cobas p 630 Consumibles Cubetas de reacción: SPU Tubos para introducción de la muestra (tubos S) con clip de código de barras Bandejas de puntas K Bandejas de tubos K ES 12 Doc Rev. 2.0

13 OTROS MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS Bandeja de muestras (bandeja de 24 tubos) Bandeja de reactivos Bandeja de SPU K-carrier Transportador de K-carrier Bandeja de K-carrier (sólo se requiere para su uso con el analizador COBAS TaqMan 48) Pipeteadores con puntas exentas de DNasa con filtro para aerosol o desplazamiento positivo (con capacidad para μl)* Guantes desechables, sin polvo Agitador vórtex * La precisión de las pipetas debe estar dentro del 3% del volumen indicado. Para evitar la contaminación cruzada de la muestra y el amplicón, deben usarse puntas exentas de DNasa con filtro para aerosol o desplazamiento positivo cuando así se especifique. OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Nota: manipule todas las muestras y los controles como si pudieran transmitir agentes infecciosos. Nota: esta prueba se ha validado para su uso con plasma humano recogido en anticoagulante EDTA únicamente. La realización de la prueba en otros tipos de muestras puede dar lugar a resultados inexactos. A. Obtención de las muestras La prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV ha sido concebida para su uso con muestras de plasma. La sangre debe recogerse en tubos estériles y utilizar EDTA (tapón lavanda) como anticoagulante; posteriormente, debe mezclarse adecuadamente según las instrucciones del fabricante del tubo. B. Transporte de las muestras La sangre total debe conservarse a una temperatura comprendida entre 2 y 25 C durante un período no superior a 6 horas. Separe el plasma de la sangre total en un plazo de 6 horas tras su recogida mediante centrifugación a entre 800 y x g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transfiera el plasma a un tubo de polipropileno estéril. El transporte de sangre total, suero o plasma debe cumplir las reglamentaciones locales, estatales, federales y nacionales para el transporte de agentes etiológicos. 41 La sangre total debe transportarse a una temperatura comprendida entre 2 y 25 C y procesarse dentro de las 6 horas siguientes a su extracción. El plasma puede transportarse a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C o congelarse a una temperatura a -20 C. C. Almacenamiento de las muestras Las muestras de plasma pueden almacenarse a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C durante un máximo de 7 días. Las muestras de plasma se mantienen estables durante 6 semanas si se congelan a una temperatura a -20 C. Se recomienda almacenar las muestras en alícuotas de 550 a 600 μl depositadas en tubos de polipropileno estériles con tapones de rosca de 2,0 ml de capacidad (por ejemplo, los tubos Sarstedt ). La ilustración 4 muestra los datos de estabilidad de las muestras obtenidos de los estudios de almacenamiento de muestras realizados con la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV ES 13 Doc Rev. 2.0

14 Ilustración 4 Estabilidad del CMV en plasma con EDTA Título de log 10 (cp/ml) 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Muestra 2-8 ºC 0 d 2-8 ºC 3 d 2-8 ºC 7 d -20 ºC 6 s Las muestras de plasma se pueden congelar y descongelar hasta 3 veces sin que se produzca pérdida significativa de ADN del CMV. La ilustración 5 muestra los datos de congelación-descongelación obtenidos de los estudios realizados con la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. Ilustración 5 Resultados del CMV después de 3 ciclos de congelación-descongelación (C-D) (plasma con EDTA) 3,50 Título de log10 (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Muestra 0x congelación/descongelación 2x congelación/descongelación 1x congelación/descongelación 3x congelación/descongelación ES 14 Doc Rev. 2.0

15 INSTRUCCIONES DE USO Nota: para obtener instrucciones detalladas sobre el funcionamiento, una descripción exhaustiva de las posibles configuraciones, la impresión de los resultados y la interpretación de los avisos, comentarios y mensajes de error, consulte (1) el Manual del equipo COBAS AmpliPrep para su uso con el analizador COBAS TaqMan, el analizador COBAS TaqMan 48 o el equipo cobas p 630, y el programa AMPLILINK, versión 3.3 Series; (2) el analizador COBAS TaqMan (con Docking Station opcional) para su uso con el Manual de aplicaciones del programa AMPLILINK, versión 3.3 Series; (3) el Manual del equipo del analizador COBAS TaqMan 48 para su uso con el Manual de aplicaciones del programa AMPLILINK versión 3.3 Series; (4) el Manual de aplicaciones del programa AMPLILINK, versión 3.3 Series para su uso con el equipo COBAS AmpliPrep, el analizador COBAS TaqMan y el analizador COBAS TaqMan 48 o el Manual de aplicaciones del programa AMPLILINK, versión 3.3 Series para su uso con el equipo COBAS AmpliPrep, el analizador COBAS TaqMan, el analizador COBAS TaqMan 48 y el equipo cobas p 630. Tamaño del lote Cada kit contiene reactivos suficientes para 72 pruebas, que pueden realizarse en lotes de 12 a 24 pruebas. En cada lote debe incluirse como mínimo una réplica de cada uno de los controles CMV ( ) C, CMV L(+)C y CMV H(+)C (consulte el apartado "Control de calidad"). Flujo de trabajo La serie se debe iniciar en el analizador COBAS TaqMan o en el analizador COBAS TaqMan 48 durante los 120 minutos posteriores a la finalización de la preparación de las muestras y los controles. Nota: no congele ni almacene muestras o controles procesados a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C. Preparación de las muestras y los controles Nota: si utiliza muestras congeladas, déjelas a temperatura ambiente hasta conseguir su completa descongelación y sométalas al agitador vórtex durante 3-5 segundos antes de usarlas. Los controles se deben extraer de su lugar de almacenamiento a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C con tiempo suficiente para que alcancen el equilibrio con la temperatura ambiente antes de su uso. Configuración del equipo COBAS AmpliPrep Parte A. Mantenimiento y cebado A1. El equipo COBAS AmpliPrep está listo para su funcionamiento en modo Stand-by. A2. Encienda la estación de datos del software AMPLILINK (ON). Prepare el ordenador tal y como se indica a continuación: a. Inicie una sesión en el sistema operativo Windows XP. b. Haga doble clic sobre el icono del programa AMPLILINK. c. Inicie una sesión en el programa AMPLILINK introduciendo el identificador de usuario y la contraseña asignados. A3. Compruebe el suministro de PG WR en la pantalla Status y repóngalo en caso necesario. A4. Lleve a cabo todas las tareas de mantenimiento que aparecen en la pestaña Due. El equipo COBAS AmpliPrep procederá automáticamente al cebado del sistema ES 15 Doc Rev. 2.0

16 Parte B. Carga de casetes de reactivos Nota: todos los casetes de reactivos se deben extraer de su lugar de almacenamiento a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C para cargarlos inmediatamente en el equipo COBAS AmpliPrep y dejar que alcancen el equilibrio con la temperatura ambiente en el equipo durante al menos 30 minutos antes de proceder con el procesamiento de la primera muestra. No permita que los casetes de reactivos alcancen la temperatura ambiente fuera del equipo, ya que podría formarse condensación en las etiquetas de código de barras. En caso de aparecer condensación en las etiquetas de código de barras, no trate de eliminarla con un paño. B1. Coloque CMV CS1 en una bandeja de reactivos. Coloque CMV CS2, CMV CS3 y CMV CS4 en una bandeja de reactivos distinta. B2. Cargue la bandeja de reactivos que contiene CMV CS1 en la posición para bandejas A del equipo COBAS AmpliPrep. B3. Cargue la bandeja de reactivos que contiene CMV CS2, CMV CS3 y CMV CS4 en la posición para bandejas B, C, D o E del equipo COBAS AmpliPrep. Consulte la tabla 1 para obtener información adicional. Parte C. Carga de consumibles Nota: determine el número de casetes de reactivos COBAS AmpliPrep, cubetas de reacción (SPU), tubos de entrada de muestras (tubos S), puntas K y tubos K necesarios. Se necesita una SPU, un tubo S de entrada, una punta K y un tubo K por cada muestra o control. Hay múltiples configuraciones posibles de uso del equipo COBAS AmpliPrep con el analizador COBAS TaqMan o el analizador COBAS TaqMan 48. Consulte la tabla 1 que se muestra a continuación como referencia. Según el flujo de trabajo utilizado, cargue el número apropiado de bandejas de casetes de reactivos, bandejas de muestras con tubos S de entrada, bandejas de SPU, bandejas de puntas K, bandejas de tubos K y K-carrier en las bandejas de K-carrier en las respectivas posiciones de bandeja del equipo COBAS AmpliPrep (consulte la tabla 1 para obtener información adicional). C1. Coloque las SPU en las bandejas de SPU y cargue las bandejas en la posición para bandejas J, K o L del equipo COBAS AmpliPrep. C2. Según el flujo de trabajo utilizado, cargue las bandejas llenas de tubos K en la posición para bandejas M, N, O o P del equipo COBAS AmpliPrep. C3. Cargue las bandejas llenas de puntas K en la posición para bandejas M, N, O o P del equipo COBAS AmpliPrep. C4. Para el flujo de trabajo 3 con el analizador COBAS TaqMan 48, cargue los K-carrier en las bandejas de K-carrier en la posición para bandejas M, N, O o P del equipo COBAS AmpliPrep ES 16 Doc Rev. 2.0

17 Tabla 1 Posibles flujos de trabajo para utilizar el equipo COBAS AmpliPrep con el analizador COBAS TaqMan o el analizador COBAS TaqMan Flujo de trabajo Equipo COBAS AmpliPrep con Docking Station y con analizador COBAS TaqMan Equipo COBAS AmpliPrep con analizador COBAS TaqMan Equipo COBAS AmpliPrep con analizadores COBAS TaqMan 48 Modo de transferencia al analizador COBAS TaqMan o al analizador COBAS TaqMan 48 Transferencia automatizada de K-carrier Transferencia manual de tubos K mediante bandejas de muestras en el analizador COBAS TaqMan Transferencia manual de K-carrier mediante bandejas de K-carrier al analizador COBAS TaqMan 48 Bandejas, transportadores y consumibles Tubos K en bandejas llenas de tubos K Puntas K en bandejas llenas de puntas K Tubos S de entrada con muestras y controles en bandejas de muestras SPU en bandejas de SPU CS1 en bandeja de casetes CS2, CS3, CS4 en bandeja de casetes Tubos K en bandejas llenas de tubos K Puntas K en bandejas llenas de puntas K Tubos S de entrada con muestras y controles en bandejas de muestras SPU en bandejas de SPU CS1 en bandeja de casetes CS2, CS3, CS4 en bandeja de casetes Una vez completado el procesamiento de las muestras: Tubos K en bandejas de muestras (listas para su transferencia manual) Tubos K en bandejas de muestras Puntas K en bandejas llenas de puntas K Tubos S de entrada con muestras y controles en bandejas de muestras SPU en bandejas de SPU CS1 en bandeja de casetes CS2, CS3, CS4 en bandeja de casetes K-carrier vacío con código de barras en bandeja de K-carrier Una vez completado el procesamiento de las muestras: Tubos K en K-carrier en bandeja de K-carrier Posición en el equipo COBAS AmpliPrep M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Igual que arriba (F H) F - H M - P F - H J - L A B - E M - P Igual que arriba (M P) ES 17 Doc Rev. 2.0

18 Parte D. Peticiones y carga de muestras D1. Prepare las bandejas de muestras tal y como se indica a continuación: coloque un clip de etiqueta de código de barras en cada posición de la bandeja de muestras donde se vaya a colocar una muestra (en tubo S). Coloque uno de los clips de etiqueta de código de barras específicos para los controles [CMV ( ) C, CMV L(+)C y CMV H(+)C] en cada posición de la bandeja de muestras donde se vayan a colocar los controles (en tubo S). Los clips de etiqueta de código de barras de los controles deben tener el mismo número de lote de control que los viales de control incluidos en el kit. Preste atención para asignar cada control correctamente en posición con el clip con código de barras apropiado. Coloque un tubo S de entrada en cada posición que contenga un clip de etiqueta de código de barras. D2. Con el programa AMPLILINK, cree peticiones de muestra para cada muestra y control de la carpeta Sample de la ventana Orders. Seleccione el archivo de pruebas adecuado y guarde la información. D3. Asigne las peticiones de muestras y controles en las posiciones de bandeja de muestras en la carpeta Sample Rack de la ventana Orders. El número de bandeja de muestras debe corresponder a la bandeja preparada en el paso D1. D4. Imprima el informe Sample Rack Order para usarlo como hoja de trabajo. D5. Prepare las bandejas de muestras y controles en el área designada para la adición de muestras y controles, tal y como se indica a continuación: Someta al agitador vórtex cada una de las muestras y los controles [CMV ( ) C, CMV L(+)C y CMV H(+)C] durante 3-5 segundos. Evite la contaminación de los guantes durante la manipulación de las muestras y los controles. D6. Transfiera 500 μl de cada muestra y control [CMV ( ) C, CMV L(+)C y CMV H(+)C] al tubo S de entrada con la etiqueta de código de barras apropiada utilizando para ello un micropipeteador con filtro para aerosol o punta exenta de DNasa con desplazamiento positivo. Evite la transferencia de partículas o coágulos de fibrina que pudieran estar presentes en la muestra original al tubo S de entrada. Las muestras y los controles se deben transferir a las posiciones de tubo asignadas y registradas en la hoja de trabajo en el paso D4. Los clips de etiqueta de código de barras de los controles deben tener el mismo número de lote de control que los viales de control incluidos en el kit. Asigne cada control correctamente a la posición que tenga el clip con código de barras apropiado. Evite la contaminación de la parte superior de los tubos S con muestras o controles. D7. Para las configuraciones 1 y 2, cargue las bandejas de muestras llenas de tubos S de entrada en las posiciones de bandeja F, G o H del equipo COBAS AmpliPrep. D8. Para el flujo de trabajo 3 mediante el analizador COBAS TaqMan 48, cargue las bandejas de muestras con tubos S de entrada y tubos K (uno por cada tubo S de entrada, cargados en la posición derecha adyacente a los tubos S de entrada) en la posición para bandejas F, G o H del equipo COBAS AmpliPrep. Parte E. Inicio de la serie en el equipo COBAS AmpliPrep E1. Inicie el equipo COBAS AmpliPrep mediante el programa AMPLILINK. Parte F. Finalización de la serie en el equipo COBAS AmpliPrep y transferencia al analizador COBAS TaqMan o al analizador COBAS TaqMan 48 (sólo para los flujos de trabajo 2 y 3) F1. Compruebe si hay algún aviso o mensaje de error. F2. Retire las muestras y los controles procesados del equipo COBAS AmpliPrep, bien en bandejas de muestras (para el analizador COBAS TaqMan sin Docking Station), o en bandejas de K-carrier (para el analizador COBAS TaqMan 48), en función del flujo de trabajo. Encontrará más información al respecto en la parte G. F3. Elimine los residuos del equipo COBAS AmpliPrep ES 18 Doc Rev. 2.0

19 Nota: no se pueden exponer a la luz las muestras ni los controles procesados tras completarse la preparación de muestras y controles. Amplificación y detección Configuración del analizador COBAS TaqMan o del analizador COBAS TaqMan 48 La serie se debe iniciar en el analizador COBAS TaqMan o en el analizador COBAS TaqMan 48 durante los 120 minutos posteriores a la finalización de la preparación de las muestras y los controles. Nota: no congele ni almacene muestras o controles procesados a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C. Parte G. Carga de muestras procesadas G1. En función del flujo de trabajo, lleve a cabo los pasos apropiados para transferir los tubos K al analizador COBAS TaqMan o al analizador COBAS TaqMan 48: Flujo de trabajo 1: Flujo de trabajo 2: Flujo de trabajo 3: Transferencia automatizada de K-carrier, a través de la Docking Station, al analizador COBAS TaqMan. No se requiere intervención manual. Transferencia manual de tubos K en bandejas de muestras al analizador COBAS TaqMan. Transferencia manual de K-carrier en bandejas de K-carrier al analizador COBAS TaqMan 48. Transferencia manual de los K-carrier al analizador COBAS TaqMan 48 mediante el transportador de K-carrier. Parte H. Inicio de la serie en el analizador COBAS TaqMan o en el analizador COBAS TaqMan 48 H1. Inicie el analizador COBAS TaqMan o el analizador COBAS TaqMan 48 usando una de las opciones que se ofrecen a continuación en función del flujo de trabajo utilizado: Flujo de trabajo 1: Flujo de trabajo 2: Flujo de trabajo 3: No se requiere intervención. Inicio automático del analizador COBAS TaqMan tras la introducción de las bandejas de muestras. Llene el K-carrier con tubos K vacíos si hay menos de 6 tubos K en el K-carrier. El programa AMPLILINK guía el proceso de llenado. Abra la cubierta del termociclador, cargue el K-carrier en el mismo y cierre la cubierta. Inicie la serie en el analizador COBAS TaqMan 48. Parte I. Finalización de la serie en el analizador COBAS TaqMan o en el analizador COBAS TaqMan 48 I1. Una vez completada la serie en el analizador COBAS TaqMan o en el analizador COBAS TaqMan 48, imprima el informe de resultados. Compruebe si hay algún aviso o mensaje de error en el informe de resultados. Los resultados obtenidos para muestras con avisos y comentarios se interpretan tal como se describe en el apartado "Resultados". Una vez aceptados los datos, guárdelos en un archivo. I2. Retire los tubos K usados del analizador COBAS TaqMan o el analizador COBAS TaqMan ES 19 Doc Rev. 2.0

20 RESULTADOS El analizador COBAS TaqMan o el analizador COBAS TaqMan 48 determina automáticamente la concentración de ADN del CMV presente en las muestras y los controles. La concentración de ADN del CMV se expresa en copias (cp)/ml. El factor de conversión entre copias/ml (definidas con la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV) y unidades internacionales (UI)/ml del ADN del CMV es de 1,1 cp/ui [0,91 UI/cp], calculado según el primer estándar internacional de la OMS para técnicas de amplificación de ácidos nucleicos del citomegalovirus humano (NIBSC 09/162) 40. Este factor de conversión entre copia y UI puede variar con relación a otros ensayos de ADN del CMV. Programa AMPLILINK: Determina el valor de ciclo umbral (Ct) correspondiente al ADN del CMV y al ADN del QS del CMV. Determina la concentración de ADN del CMV según los valores de Ct calculados para ADN del CMV y ADN del QS del CMV y los coeficientes de calibración específicos del lote incluidos en los códigos de barras de los casetes. Determina si las cp/ml calculadas para CMV L(+)C y CMV H(+)C están dentro de los intervalos asignados. Validación de series AMPLILINK versión 3.3 Series Compruebe los posibles avisos y comentarios en la ventana de resultados del programa AMPLILINK o la impresión de resultados para asegurarse de que el lote es válido. Para peticiones de control, se realiza una comprobación para determinar si el valor en cp/ml correspondiente al control está dentro del intervalo asignado. Si el valor en cp/ml correspondiente al control está fuera del intervalo asignado, se genera un aviso para indicar que el control no ha superado la prueba. El lote se considera válido cuando no aparece ningún aviso para los controles [CMV ( ) C, CMV L(+)C y CMV H(+)C]. El lote no es válido si aparece cualquiera de los avisos siguientes para los controles del CMV: Control negativo Aviso Resultado Interpretación NC_INVALID Invalid Un resultado no válido o un resultado válido que no fue negativo para el fragmento objetivo de CMV Control positivo bajo del CMV Aviso Resultado Interpretación LPCINVALID Invalid Resultado no válido o control fuera del intervalo Control positivo alto del CMV Aviso Resultado Interpretación HPCINVALID Invalid Resultado no válido o control fuera del intervalo Si el lote no es válido, repita todo el lote incluyendo los pasos de preparación, amplificación y detección de las muestras y los controles ES 20 Doc Rev. 2.0