Antimicrobiano: Producto farmacológico que tiene capacidad de eliminar el agente etiológico.

Transcripción

1 Página 1 de OBJETIVO Establecer las técnicas para el diagnóstico de Vibrio cholerae pandémico y epidémico empleando procedimientos de identificación bioquímica, determinación de serotipos para los Laboratorios De Salud Pública Departamentales y Distritales. 2. ALCANCE Este documento se aplica como única referencia para el proceso del diagnóstico de cólera por el laboratorio de salud pública para los aislamientos de Vibrio cholerae pandémico y epidémico a través de los métodos de Identificación por medio de pruebas bioquímicas y serotipificación. 3. RESPONSABILIDAD Es responsabilidad del cumplimiento de lo especificado en el presente instructivo al personal que ha sido capacitado para el diagnostico de cólera en los entes territoriales por el Grupo de Microbiología de la Subdirección Red Nacional de Laboratorios. 4. DEFINICIONES Antígeno Bacteriano: Molécula capaz de ser reconocida por un anticuerpo (Ac), por células presentadoras de antígenos (Ag) y que tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune. Antimicrobiano: Producto farmacológico que tiene capacidad de eliminar el agente etiológico. Coprocultivo: Siembra de un medio de cultivo selectivo de una pequeña cantidad de materia fecal para expresar en él la presencia de gérmenes enteropatógenos. Etiología: Usado con enfermedades para agentes causales incluyendo microorganismos. Incluye factores ambientales y sociales y hábitos personales como factores contribuyentes. Incluye patogénesis. Medios de Cultivo: Cualquier preparación líquida o sólida hecha específicamente para cultivo, almacenamiento o transporte de microorganismos u otros tipos de células. La variedad de los medios que existen permiten el cultivo de microorganismos y tipos de células específicos, como medios diferenciales, medios selectivos, medios de test y medios definidos. Los medios sólidos están constituidos por medios líquidos que han sido solidificados con un agente como el Agar o la Gelatina.

2 Página 2 de 39 Morbilidad: Proporción de pacientes con una enfermedad particular durante un año fijado por una determinada unidad de población. Se realiza a través de encuestas con el fin de conocer la frecuencia de las mismas en la población (encuestas de morbilidad general o encuestas sobre afecciones específicas) Mortalidad: Concepto estadístico para determinar muertes causadas u ocurridas en un evento especifico con enfermedades. Prevalencia: Número de casos de enfermedad o de personas enfermas, o de cualquier otro fenómeno (ej.: accidentes) registrados en una población determinada, sin distinción entre casos nuevos y antiguos. Prevalencia se refiere a todos los casos tanto nuevos como viejos, al paso que, incidencia se refiere solo a nuevos casos. La prevalencia puede referirse a un momento dado (prevalencia momentánea), o a un período determinado (prevalencia durante cierto período) Pruebas bioquímicas: Medios de cultivos líquidos o sólidos que contienen sustancias especiales de enriquecimiento, suplemento, que al ser inoculados permiten la diferenciación de la bacteria. Serotipificación: Proceso de reacción antígeno - anticuerpo que pone en evidencia la presencia de antígenos somáticos. Vigilancia Epidemiológica: Conjunto de actividades que permite reunir la información indispensable para conocer la conducta o la historia natural de las enfermedades, así como detectar o prever alteraciones de sus factores condicionantes, con el fin de recomendar las medidas indicadas y eficientes que conduzcan a la prevención y al control de determinados agravios. 5. CONDICIONES GENERALES Lea muy bien el instructivo antes de iniciar su desarrollo. Tenga presente que la manipulación de Vibrio cholerae, es riesgosa ya que se pueden presentar casos de contaminación en el personal de laboratorio al manipularlo. Siga las reglas de bioseguridad establecidas en su laboratorio. Limpie el lugar de trabajo antes de iniciar y al terminar, mantenga el orden de los materiales y reactivos que utilice. No modifique los pasos de este instructivo y en el caso de duda consulte al personal capacitado o al Grupo de Microbiología SRNL del Instituto Nacional de Salud ( ext 1421,1423 o 1430).

3 Página 3 de 39 Siga las reglas de bioseguridad establecidas para laboratorio y registradas en su respectivo manual de bioseguridad. 6. MATERIALES Y REACTIVOS 6.1. MATERIALES Asas bacteriológicas Cajas de Petri Láminas porta objetos Láminas de vidrio de 20x20 cm Gradillas Puntas plásticas azules y amarillas Pipetas Pasteur de vidrio y plásticas Mecheros Palillos de madera Servilletas de papel Erlenmeyer de 1000 ml Tubos falcón de 50 ml Tubos 13x100 mm limpios, secos y estériles Tubos de Kahn (10x75 mm) limpios, secos y estériles Frascos ámbar Tubos crioviales 2ml Cajas para tubos crioviales Escobillones estériles 6.2. REACTIVOS Medio de transporte Cary- Blair (Ver anexo 1 ) Agua peptonada alcalina (Ver anexo 2) Agar TCBS (Ver anexo 3) Agar BHI (Ver anexo 4 ) Agar nutritivo al 0.5% de NaCl (Ver anexo 5) Gelosa alcalina (Ver anexo 6) Prueba de oxidasa (Ver anexo 7)

4 Página 4 de 39 Prueba de la cuerda (Ver anexo 8) Agar TSI (Ver anexo 9) Caldo Aminoácidos (Ver anexo 10) Prueba de tolerancia de cloruro de sodio (Ver anexo 11) Antisueros diagnósticos O (Ver anexo 12) Medio leche descremada ( Ver anexo 13) Hisopos tratados para coprocultivo (Ver anexo 14) 7. EQUIPOS Incubadora a 35ºC Micropipetas automáticas de 100 a 1000µl y de 2 a 20µl Microscopio Potenciómetro Autoclave Baño serológico a 50ºC Estufa Balanza Vortex Lámpara de cuello flexible para leer aglutinaciones Cabina de flujo laminar o área estéril para servir medios Cuarto frio a 4ºC Congelador a 70 o C o a -20 o C POR EL LABORATÓRIO DE Vibrio cholerae O Toma y envío de las muestras de Materia fecal Muestras adecuadas No contaminada con orina Fresca: menor a 2 horas después de su evacuación. Recolectada por frotis rectal (neonatos), no se recomienda de rutina. Contenido duodenal, de colostomía o ileostomía. Muestras inadecuadas

5 Página 5 de 39 Que no sido preservada en un medio de transporte adecuado y que tiene más de 2 horas de haber sido recolectada. Hisopos secos con muestras de frotis rectal Múltiples muestras recibidas el mismo día. Recolección de la muestra La muestra debe ser recolectada en un recipiente limpio, libre de preservativos y detergentes, seco, de boca ancha con tapa. No es necesario que sea estéril. En algunos casos el frotis rectal es más eficaz que las heces, particularmente en los recién nacidos o en los pacientes adultos severamente debilitados, con relación al volumen, de 1 a 2 gramos de materia fecal son suficientes. Transporte de la muestra de materia fecal: el transporte de la muestra se debe realizar en medio de transporte Cary- Blair a temperatura ambiente y en triple empaque.

6 Página 6 de Envío de los aislamientos al Laboratorio de Referencia. Procedimiento Realice una siembra masiva del aislamiento en un medio no selectivo (Agar BHI o Agar Tripticasa soya) e incúbela de 18 a 24 horas a 37ºC. Recoja con el escobillón que viene en el paquete el crecimiento bacteriano. Inserte el escobillón en el medio y cierre el tubo herméticamente. Rotule el tubo y envíelo al Laboratorio de Referencia junto con el formato de información. Diligencie adecuadamente el formato de envío Epidemiología La enfermedad diarreica aguda causada por el bacilo Vibrio cholerae; ha causado, según cifras de la Organización Mundial de la Salud OMS- entre 3 y 5 millones de casos de cólera y entre 100 y 120 mil defunciones por año. Esto se debe a la ingesta de alimentos o aguas contaminadas que tiene un breve periodo de incubación que varía entre 2 horas a cinco días y sumado a estudios recientes que indican que el calentamiento del planeta crea un ambiente favorable para los bacilos, ocasionando un incremento del riesgo a presentarse brotes epidémicos. La historia nos presenta siete pandemias de cólera documentadas desde 1817 hasta 1991, donde la última afectó a Latino América excepto a Uruguay, ocasionando millones de defunciones. En las Américas los últimos casos reportados por la OPS fueron: Año Canadá Estados Unidos Brasil Ecuador Colombia * * * 7* No se reportaron casos *Casos fueron importados.

7 Página 7 de 39 La epidemia de cólera que azota Haití desde mediados de octubre ha causado la muerte de personas y han sido infectadas, según el Ministerio de Salud Pública y Población (MSPP). La tasa de letalidad en los hospitales es del 2.3%; el 67% de las muertes se han producido en los servicios de salud, y el 33% en la comunidad Generalidades Vibrio cholerae O1 y O139 son los agentes de las epidemias y pandemias de cólera. Las cepas epidémicas de V. cholerae están ampliamente distribuidas en el medio ambiente. Se encuentra en aguas de una gran variedad de salinidad, también se pueden encontrar en aguas dulces y en el contenido intestinal de animales marinos. Se encuentra en áreas tropicales o durante las estaciones templadas; es susceptible a la desecación, ebullición, al cloro y a otros desinfectantes. V. cholerae O1 y O139 son los agentes etiológicos del cólera, enfermedad diarreica aguda que se caracteriza por vómito, diarrea en agua de arroz, causando grados variables de deshidratación, acidosis, colapso circulatorio y si el paciente no es tratado rápidamente, la muerte se produce dentro de las 24 horas de aparición de los síntomas. En la actualidad se conoce que la infección puede ser asintomática (Tabla 1). V. cholerae pertenece a la familia Vibrionaceae a la cual pertenecen los géneros: Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas y Photobacterium. Al género Vibrio pertenecen 30 especies de las cuales sólo 12 se han aislado de muestras clínicas humanas: V. cholerae O1, V. cholerae O139, V. parahemolyticus, V. alginoliticus, V. damsela, V. fluvialis, V. furnissii, V. vulnificus, V. mimicus, V. metchnikovii, V. cincinnatiensis y V. carchariae (Tabla 2y 3).

8 Página 8 de 39 Tabla 1. Asociación de las especies de Vibrio con diferentes síndromes clínicos Especies de vibrios causantes de infeccion en humanos Gastroenteritis Síndromes clínicos Infección de heridas Infección de ojo Septicemia V. cholerae O V. cholerae no O V. mimicus V. fluvialis V. parahaemolyticus V. alginolyticus V. cincinnatiens V. hollisae V. vulnificus V. furnisii V. dansela V. metschnikovii V. carchariae Tomado y adaptado de Manual of Clinical Microbiology. Seven Edition. PR Murray, EJ Baron, MA Pfaller, FCTenoves, RH Yolken (eds). American Society for Microbiology. Washington D.C Diagnóstico bacteriológico V. cholerae es un bacilo Gram negativo, móvil, debido a un flagelo polar recubierto, el cual se forma cuando se cultiva en medios líquidos; anaerobio facultativo, crece a 40ºC, es estimulado por NaCl y tolera hasta un ph.10. Este microorganismo crece fácilmente en medios comunes y fermenta la glucosa con o sin producción de gas. Las colonias sobre McConkey son lactosa negativa y sobre TCBS son sacarosa positiva (amarillas). Posee la enzima citocromo oxidasa, característica que lo diferencia de la familia Enterobacteriaceae. Los aislamientos de V. cholerae, que poseen el antígeno somático O1 aglutinan con el antisuero polivalente O1 y son denominados V. cholerae O1 y los que no poseen este antígeno somático y por lo tanto no aglutinan con el antisuero polivalente O1 se denominan V. cholerae no O1. A todos los aislamientos de V. cholerae no O1 se les debe realizar el estudio bioquímico para la confirmación de especie y la serotipificación con el antisuero O139, para detectar la presencia del antígeno O139.

9 Página 9 de 39 V. cholerae O1 se divide en subtipos basados en determinantes antigénicos específicos los cuales se denominan: Inaba, Ogawa y Hikojima y se puede clasificar en cuatro biotipos denominados Clásica, El Tor, Hibrido y La Variante Tor de acuerdo con su características fenotípicas. Examen directo: No se realiza. Nota. Para las pruebas bioquímicas de cuerda y oxidasa no se deben realizar a partir de medios selectivos (TCBS), se deben hacer a partir de medios no selectivos (Agar BHI o Agar Tripticasa Soya, etc), ver anexos

10 Página 10 de Diagrama de flujo para identificación de Vibrio cholerae a partir de materia fecal Materia fecal directa o desde Cary-Blair Enriquecimiento Directo Agua peptonada Se incuba por 6-8 horas a C. Tomar 3-4 asadas del sobrenadante sembrar en TCBS por horas a C TCBS Incubar por horas a C Observar presencia de colonias sacarosa positiva Agar BHI, TSA, Nutritivo con 0,5% de NaCl, etc (incubar por horas a C Pruebas bioquímicas rápidas para el diagnóstico rápido y presuntivo de Vibrio cholerae Oxidasa: positiva Cuerda: positiva En caso de tener antisuero Vibrio spp. Envíe el aislamiento al laboratorio de referencia en medio de transporte Cary Blair a temperatura ambiente antes de 48 horas y diligencie adecuadamente el formato de envío (REG-R ). Pruebas serológica Antisuero Polivalente O1: positivo Positivo Vibrio cholerae O1 (Confirmación por el laboratorio de referencia)

11 Página 11 de 39 Las siguientes tablas muestran las reacciones bioquímicas que son necesarias para la identificación de Vibrio cholerae, No obstante es obligatorio el uso del antisuero polivalente O1 para confirmar V. cholerae O1 (cólera pandémico). Esta opción de identificación se usa opcionalmente hasta especie y se remite al laboratorio de referencia en caso de no tener los antisueros. Tabla 1. Crecimiento de colonias que usan sacarosa en el agar TCBS Crecimiento en agar TCBS Microorganismos % de aislamientos de la fermentación de sacarosa en TCBS Verde Amarillo Eficiencia de crecimiento en el medio V. cholerae Bueno V. mimicus Bueno V. parahaemolyticus 99 1 Bueno V. alginolyticus Bueno V. fluvialis Bueno V.furnissi Bueno V. hollisae Muy pobre V. harveyi Bueno V. damsela 95 5 reducido a 36 C V. metschnikovii puede ser reducido V. cincinnatiensis muy pobre V. vulnificus Bueno Otros vibrios marinos Aeromonas y enterobacterias Variable Variable Variable No crecen No crecen Muchas especies son totalmente inhibidas Tomado y adaptación de: Manual of clinical microbiology, 8 edition, Murray Patrick et.al, ASM 2003

12 Página 12 de 39 Tabla 2. Pruebas para la diferenciación de Vibrio cholerae con otros géneros PRUEBA Vibrio cholerae Vibrio mimicus vibrios halophilicos Microorganismos Aeromonas Aeromonas hydrophila veronii Plesiomonas shigelloides Enterobacteriaceae KIA K/A K/A V V K/AG K/A V TSI 1% NaCl A/A K/A V V A/AG K/A V Cuerda Oxidasa Gas de glucosa V Sacarosa + - V V + - V Lisina 1% NaCl + + V V + + V Arginina 1% NaCl - - V V Ornitina 1% NaCl + + V V VP 1% NaCl V - V V + - V Crecimiento en 0% de NaCl Crecimiento en 1% de NaCl V: Reacción variable a: V.parahaemolyticus, V.cincinnatiensis, y V.damsei dan reacciones variables b: V.furnissi y V damsei son variables para gas de glucosa c: Base de caldo nutritivo (Difco) Adaptación de: Métodos de laboratorio para el diagnóstico de Vibrio cholerae, CDC/OPS 1999

13 Página 13 de 39 Tabla 3. Diferenciación de las especie del género Vibrio sp. Adaptación de: Métodos de laboratorio para el diagnóstico de Vibrio cholerae, CDC/OPS 1994

14 Página 14 de PRESERVACIÓN DE AISLAMIENTOS BACTERIANOS El objetivo principal de la preservación de las cepas de microorganismos es mantenerlos puros, viables, sin variaciones ni mutaciones, que se asemejen en lo posible a su aislamiento inicial. Muchos métodos han sido usados para preservar las bacterias, pero no todos los géneros se comportan en forma similar cuando son sometidas al mismo proceso, inclusive, en ocasiones, cepas de la misma especie pueden responder en forma diferente. Es importante el uso de una codificación específica y de la documentación de la cepa con sus características fenotípicas, fecha de aislamiento, nombre del paciente, sitio anatómico y la información geográfica. Si el cultivo fue remitido al laboratorio, en la documentación debe incluirse el nombre del microbiólogo o la institución remitente y la fecha de adquisición. Los métodos de preservación más utilizados están divididos en métodos de corta y de larga duración. Cada laboratorio debe establecer la codificación del cepario y la información debe registrarse en una base de datos. Métodos de corta duración Subcultivos: es el método tradicional y consiste en transferir el aislamiento de un medio no selectivo a otro fresco, cada determinado período de tiempo (se determina en cada laboratorio). El intervalo depende del microorganismo y del medio utilizado. Las mayores desventajas son los riesgos de contaminación, cambios en la numeración, selección de variantes y mutantes, pérdida de la cepa y el requerir un espacio grande de almacenamiento. El medio debe ser bajo en nutrientes, para obtener una tasa metabólica baja, lo que prolonga el período de transferencia. Sin embargo algunas bacterias necesitan medios más complejos y por lo tanto el período de transferencia es más corto. El almacenamiento es preferible en refrigerador, pero si hay inconveniente, el almacenamiento puede hacerse a temperatura ambiente (18º-20ºC), los tubos deben estar sellados con cinta especial y colocados en cajas tapadas. Se deben hacer por duplicado. Mantenimiento en medios no selectivos con aceite de inmersión: muchas bacterias pueden ser preservadas por meses cuando al medio de almacenamiento se le adiciona aceite mineral grado medicinal estéril, (el aceite debe esterilizarse en calor seco a 180ºC por dos horas). Procedimiento:

15 Página 15 de 39 El medio no selectivo se sirve en tubos de vidrio estériles de tapa rosca, colocando 5 ml por tubo, se esteriliza a 120 C, 115 libras de presi ón de minutos. Se inocula el medio no selectivo con 3-4 asadas del aislamiento fresco, se incuba horas a C, cuando se observe el crecimiento se ad icionan unas gotas del aceite mineral estéril hasta cubrir la superficie del medio. Se sella la tapa del tubo con cinta de enmarcar o papel parafilm Los tubos se almacenan a temperatura ambiente en un lugar seco, y oscuro Nota. La contaminación de los cultivos, cuando se utiliza este método, es debida a la mala esterilización del aceite. Por esto se recomienda hacer un control de esterilidad al aceite, sembrándolo en agar nutritivo o en agar tripticasa soya. Congelación ordinaria (0ºC a 20ºC): se debe hacer una suspensión gruesa del microorganismo en un caldo nutritivo con glicerol al 20%. Por este método es posible mantener microorganismos no fastidiosos por más de dos meses. Es ideal para los laboratorios clínicos, debido a que se puede utilizar el congelador de la nevera (-10ºC a 20ºC) Congelación baja (-70ºC). Esta congelación consiste en el mantenimiento de la bacteria a -70ºC. Este método involucra la congelación de la bacteria en presencia de un crioprotector tal como el glicerol ó Skim Milk, el uso del crioprotector depende de la especie de la bacteria, por lo tanto debe determinarse su utilidad individualmente. Una vez la bacteria ha crecido en un medio apropiado, debe hacerse una suspensión de ella en un caldo no selectivo estéril que contenga 30 a 50% de glicerol o Skim Milk al 20%, dispensar en viales estériles y congelar a -70 C INSTRUCCIONES PARA ENVIO DE AISLAMIENTOS AL LABORATÓRIO DE REFERENCIA Fundamento El Grupo de Microbiología, RNL del Instituto Nacional de Salud es el Laboratorio de Referencia en la vigilancia de la susceptibilidad antimicrobiana de Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae. Para llevar a cabo la vigilancia es necesario enviar todos los aislamientos en medios y condiciones adecuadas para mantener su viabilidad y de esta forma poder realizar las pruebas bioquímicas y serológicas y adicionalmente la susceptibilidad antimicrobiana.

16 Página 16 de 39 Medios de transporte Utilice como medio de transporte el Cary Blair Procedimiento Realice una siembra masiva del aislamiento en un medio no selectivo e incúbela de 18 a 24 horas a 37ºC. Recoja con un escobillón el crecimiento bacteriano. Inserte el escobillón en el tercio superior del medio. Corte la parte sobresaliente del escobillón y cierre el tubo herméticamente. Rotule el tubo y envíelo al Laboratorio de Referencia junto con el formato de información. Diligencie adecuadamente el formato de envío. 8. Anexos Anexo 1. Medio de transporte Cary y Blair Casas comerciales: BBL - DIFCO - OXOID Fundamento Este medio es utilizado para el transporte de muestras de materia fecal y/o de aislamientos, de microorganismos Gram negativos entéricos. El medio de transporte de Cary - Blair es adecuado para el transporte de este tipo de muestra, debido a sus escasos nutrientes y el ph de 8,4 incrementa la supervivencia de los microorganismos y evita su replicación. Preparación Siga las instrucciones de la casa comercial. Observe que algunas casas no incluyen el CaCl 2, en tal caso debe agregarse 1 g X 100 ml y ajustarse el ph a 8,4 con NaOH 0,1N. Envase en tubos con tapa de rosca 16x150mm un volumen de 7 ml. Esterilice en el baño María a punto de ebullición durante 15 minutos. Conserve a 4ºC por 6 a 8 meses; si hay cambio de color o deshidratación debe descartarse.

17 Página 17 de 39 Inoculación Impregne el escobillón tratado con la materia fecal o con el aislamiento. Introduzca el escobillón hasta el tercio superior del medio Rompa la parte sobresaliente del escobillón y tape el tubo herméticamente. Marque el tubo y envíe al laboratorio lo antes posible a temperatura ambiente con el nombre la edad, género, fecha y hora de la toma de la muestra Control de Calidad Recoja con un el escobillón, un cultivo puro de una cepa conocida, colóquela en el medio de transporte Resiembra a las horas. La cepa debe presentar un buen crecimiento y una morfología típica después de la inoculación en el medio adecuado y de la incubación durante horas. Adicionalmente realice el control de esterilidad siembre el escobillón en un agar nutritivo incúbelo durante horas. No debe presentar crecimiento Registre los resultados en el formato Control de calidad de medios de cultivo. Conservación Almacene entre 5 25 C Deterioro del producto No utilizar si se observa presencia de daño, deshidratación o contaminación.

18 Página 18 de 39 Anexo 2. Caldo de enriquecimiento - agua peptonada alcalina ph 8,4 Fundamento Es un caldo de enriquecimiento e inhibición para las muestras de materia fecal. Es utilizado en el procesamiento de muestras sospechosas de Vibrio cholerae por su ph alcalino que inhibe la flora acompañante favoreciendo su recuperación. Es además útil cuando la cantidad de microorganismos presentes en la muestra es pequeña debido a antibióticoterapia previa o en caso de portadores sanos. Composición Peptona.. 10g Cloruro de sodio 10g Agua destilada ml Preparación Disuelva los ingredientes y ajuste el ph a 8,4 con NaOH 1N. Distribuya el medio en cantidades de 5 ml en tubos tapa de rosca 16x125mm. Esterilice en autoclave a 121ºC por 15 minutos. Inoculación Agite el escobillón con la muestra dentro del caldo e incube a 35ºC por 5-8 horas. Subcultive en un agar TCBS tomando una asada de la superficie. Control de calidad El control de calidad se realiza sembrando en el caldo una cepa de V. cholerae y subcultivando en el medio selectivo (TCBS). Se debe recuperar el microorganismo puro y con las características propias de crecimiento. Si se observa algún cambio en el aspecto del caldo durante su almacenamiento, deberá descartarse. Conservación Almacene a 5 C hasta por dos meses. Deterioro del producto No utilizar si se observa presencia de daño o contaminación.

19 Página 19 de 39 Anexo 3. Agar TCBS Casas comerciales: BBL, DIFCO, MERCK. Fundamento Es un medio altamente selectivo para el aislamiento de V. cholerae. Por su contenido de sales biliares, inhibe el crecimiento de las bacterias Gram positivas y negativas. Además contiene sucrosa (sacarosa) como carbohidrato fermentable porque la mayoría del género Vibrio fermenta este azúcar, No obstante el ph alcalino que ofrece el medio favorece el aislamiento de V.cholerae. El azul de timol y de bromotimol están incluidos como indicadores de ph. Preparación De acuerdo con las instrucciones de la casa comercial. Procedimiento Siembre la muestra directamente del medio de transporte o de agua peptonada alcalina. Rote el escobillón en la parte superior de uno de los cuadrantes del agar. Realice una siembra por agotamiento con el fin de obtener colonias aisladas. Incube a 35 C por horas. Lectura Las especies del género Vibrio que fermentan la sacarosa, crecen en el medio de TCBS formando colonias amarillas. Control de Calidad Cada lote de medio debe contar con las pruebas de control de calidad tanto de crecimiento como de esterilidad Control Positivo: V. cholerae Colonias amarillas sacarosa positiva Control Negativo: E. coli No hay crecimiento Conservación Almacene a 5 C, por un máximo de tres días que es el tiempo de vida útil Deterioro del producto

20 Página 20 de 39 No utilizar si se observa presencia de daño o contaminación.

21 Página 21 de 39 Anexo 4. Agar BHI (Brain Heart Infusion Agar- Agar infusión cerebro corazón) Casas Comerciales: BBL - DIFCO - MERCK OXOID Fundamento Es un medio solido que contiene infusión altamente nutritiva, es un medio enriquecido no selectivo, para el aislamiento de microorganismos pocos exigentes; por no ser selectivo, está libre de inhibidores lo que facilita su uso para pruebas de serotipificación, recolección de cepas, etc. Preparación De acuerdo con las instrucciones de la casa comercial. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión (121ºC). Deje enfriar el medio a una temperatura de 45º a 50ºC en baño maría. Ajuste el ph del medio (7,2 a 7,4) Sirva el volumen necesario para que el medio quede con una profundidad aproximada de 4mm Deje enfriar bien el medio y almacene en el refrigerador (2º a 8ºC) Evite utilizar las cajas cuando la humedad en la superficie del medio sea aparente, si esto sucede déjelo secar en la incubadora a 35ºC Procedimiento Siembre el aislamiento directamente del medio de transporte rotando el escobillón en la parte superior de uno de los cuadrantes del agar; o tomar una colonia aislada del agar selectivo. Realice una siembra por agotamiento con el fin de obtener colonias aisladas. Incube a 35 C por horas. Control de Calidad Cada lote de medio debe contar con las pruebas de control de calidad tanto de crecimiento como de esterilidad Control Positivo: E. coli. hay crecimiento Control Negativo: H. influenzae, no se observa crecimiento Conservación: Almacene a 5 C hasta por dos meses. Observaciones: Si solo tiene el caldo infusión cerebro corazón puede agregar 15 gramos de agar-agar o agar bacteriológico preparación para 1000 ml y seguir las instrucciones de este instructivo.

22 Página 22 de 39 Anexo 5. Agar nutritivo al 0,5% de NaCl Casas Comerciales: BBL - DIFCO - MERCK OXOID Fundamento Es un medio sólido para el cultivo de un gran número de microorganismos no fastidiosos que se usa para el estudio en muestras de aguas, alimentos, aguas residuales, el medio contiene extracto de carne que aporta al medio carbohidratos, vitaminas, compuestos de nitrógeno orgánico y sales, También contiene peptona que es fuente de nitrógeno particularmente aminoácidos y péptidos de cadena larga. La adición de 0.5% de NaCl es necesario en el caso del crecimiento de Vibrio cholerae por su naturaleza halófila. Preparación De acuerdo con las instrucciones de la casa comercial, y agregar 0.5% de NaCl (5g de NaCl en 1000 ml de medio) Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión (121ºC). Deje enfriar el medio a una temperatura de 45º a 50ºC en baño maría. Verificar el ph del medio que debe ser de 8,4 caso contrario ajustarlo con una solución de NaOH al 30%. Sirva el volumen necesario para que el medio quede con una profundidad aproximada de 4mm Deje enfriar bien el medio y almacene en el refrigerador (2º a 8ºC) Evite utilizar las cajas cuando la humedad en la superficie del medio sea aparente, si esto sucede déjelo secar en la incubadora a 35ºC Procedimiento Siembre la colonia sacarosa positiva del TCBS directamente en la placa. Realice una siembra por agotamiento con el fin de obtener colonias aisladas. Incube a 35 C por horas. Control de Calidad Cada lote de medio debe contar con las pruebas de control de calidad tanto de crecimiento como de esterilidad Control Positivo: E. coli, hay crecimiento Control Negativo: H. influenzae, no se observa crecimiento

23 Conservación: Almacene a 5 C hasta por dos meses. Observaciones: Página 23 de 39 Este medio tiene dos usos el primero es tener al aislamiento en un medio no selectivo para realizar las pruebas bioquímicas y de serotipificación para no inhibir las reacciones, y segundo tener un medio para hacer la resiembra del aislamiento de Vibrio cholerae para recogerla y conservarla en cepario. En el caso de no tener el agar nutritivo comercial, puede prepararse de la siguiente manera: Peptona (peptone) 5.0 g Extracto de Carne (Beef extract) 3.0 g Agar-agar g NaCl. 5.0 g Agua destilada 1000 ml Calentar el agua para disolver primero el extracto de carne y después agregar y mezclar todos los componentes hasta hervir y seguir los pasos de este instructivo.

24 Página 24 de 39 Anexo 6. Gelosa Alcalina Fundamento Contiene peptona como fuente de nitrógeno particularmente aminoácidos y péptidos de cadena larga. La adición de 0.5% de NaCl es necesario en el caso del crecimiento de Vibrio cholerae por su naturaleza halófila (CDC. 2010). Preparación La preparación inicial es la siguiente: o 20 g de Peptona o 15 g de Agar-agar o 5 g de Cloruro de Sodio Colocar agua destilada hasta completar 1000 ml Llevar a ebullición hasta asegurar la disolución completa. Verificar el ph del medio que debe ser de 8,4 caso contrario ajustarlo con una solución de NaOH al 30%. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 120 C. Esperar hasta que alcance una temperatura de 60ºC aproximadamente. Distribuir en cajas petri de 10 x 100 mm. Procedimiento Siembre la colonia sacarosa positiva del TCBS directamente en la placa. Realice una siembra por agotamiento con el fin de obtener colonias aisladas. Incube a 35 C por horas. Control de Calidad Cada lote de medio debe contar con las pruebas de control de calidad tanto de crecimiento como de esterilidad Control Positivo: E. coli, hay crecimiento Control Negativo: H. influenzae, Streptococcus pneumoniae no se observa crecimiento Conservación: Almacene a 5 C hasta por dos meses.

25 Página 25 de 39 Anexo 7. Prueba de la oxidasa Fundamento El dehidrocloruro de tetrametil-parafenilendiamina al 1% se emplea para la determinación de la citocromo oxidasa. Este reactivo actúa como aceptor artificial de electrones sustituyendo al oxígeno. En su estado reducido es incoloro pero en la presencia de la citocromo oxidasa del microorganismo y el oxígeno atmosférico se oxida formando el azul de indofenol. Reactivos Tiras comerciales (Merck, Difco). Reactivo: Solución acuosa al 1%, aproximadamente, dehidrocloruro tetrametil-p-fenil diamina Procedimiento Realice la prueba a partir de un cultivo de horas, de un medio que no contenga azúcares. El crecimiento en un medio que se ha acidificado debido a la fermentación de carbohidratos no debe emplearse ya que la acidez inhibe la enzima citocromo oxidasa. Con tiras comerciales: frote una colonia en la superficie impregnada con el reactivo. Con reactivo: prepare una solución acuosa del reactivo, (1mL de agua destilada y lo que toma la punta de un escobillón de madera, agitar y usar inmediatamente) coloque una gota de la solución en un papel filtro, frote un colonia en la superficie del papel impregnada con el reactivo. 1. La fórmula de la oxidasa de Kovac es como sigue: o N, N,N,N -Tetrametil-p-fenilendiamina.0,05g o Agua destilada.. 5,0 ml o Disuelva el reactivo en agua pura. (No caliente para disolver.)

26 Página 26 de 39 Observación: Para prevenir el deterioro del reactivo de oxidasa en polvo es necesario prepararlo de esta forma: 1. Reactivo líquido o Prepare 10 ml de la solución al 1,0% de N, N,N,N -Tetrametil-p-fenilendiamina en agua destilada. o Dispense el reactivo en alícuotas de 1 ml y guárdelos en congelación a 20 C. o Para utilizarlo, descongele un vial de 1 ml y úselo para humedecer el papel de filtro o el hisopo. 2. Tiras secas de papel de filtro. o Se puede tener un stock de tiras secas y se prepara a partir del reactivo líquido o En una superficie no porosa (placas de petri,). Deje secar las tiras al aire o en la incubadora. o Cuando las tiras estén completamente secas, póngalas en un tubo/frasco bien tapado y refrigere a 4 C. Lectura Positivo: desarrollo de un color violeta oscuro Negativo: no hay desarrollo de color Control de calidad La prueba debe realizarse simultáneamente con dos cepas control Control positivo: Vibrio cholerae, Neissseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa Control negativo: Escherichia coli, enterobacterias Conservación A C el polvo en una zona oscura. Guardarl o en un frasco cerrado ajustadamente con un desecador en un área oscura y fría. A -20 C en forma líquida A 4 C en tiras secas Deterioro del producto Sensible a la luz, No utilizar si se observa presencia de daño o contaminación.

27 Anexo 8. Prueba de la cuerda Página 27 de 39 Fundamento: esta prueba se realiza para diferenciar el género Vibrio de los demás géneros pertenecientes a la familia Vibrionaceae como Plesiomonas y Aeromonas. La actividad lítica del ácido desoxicólico sobre la pared de los Vibrios favorece la liberación de ADN que al contacto con el ácido desoxicólico forma una suspensión adherente o mucoide. Procedimiento: Resuspenda la colonia en una gota de desoxicolato de Na al 0,5%. Lectura Positiva: Las células bacterianas se lisan por la acción del desoxicolato y el ADN se libera volviéndose la preparación mucoide; al tocarla con un asa y levantar el asa se formara un hilo. Control de calidad Al realizar la prueba se deben utilizar dos controles, como control positivo una cepa conocida de Vibrio cholerae y como control negativo una cepa de enterobacteria (Salmonella spp., Shigella sp., E. coli). Conservación: almacene a 5 C Deterioro del producto No utilizar si se observa presencia de daño o contaminación. Nota: si encuentra precipitación del reactivo se debe calentar a baño maría hasta ver que el reactivo este nuevamente homogéneo.

28 Página 28 de 39 Anexo 9. Agar triple azúcar hierro (TSI) Casas comerciales: BBL - DIFCO - MERCK - OXOID Fundamento Es un agar diferencial basado en la fermentación de azúcares y la producción de H 2 S y gas. Contiene glucosa, sacarosa y lactosa; la lactosa y sacarosa están presentes en una concentración 10 veces mayor a la glucosa; el indicador de ph es el rojo de fenol, el cual vira a amarillo por la formación de ácido a partir del carbohidrato; el sulfato ferroso es un detector de la producción de H 2 S. Preparación Siga las instrucciones de la casa comercial. Coloque 6 ml en tubos de tapa rosca de 16x100 mm. Esterilice a 121ºC por 15 min. Incline los tubos de tal manera que queden con un fondo y un tendido de 3 cm. Conserve a 4ºC hasta por 1 mes. Si se observa deshidratación o cambios el medio debe descartarse. Inoculación Con el asa recta tome una colonia aislada del microorganismo y puncione el medio por el centro hasta el fondo del tubo y luego haga estrías en la superficie. Incube a 37ºC por 24 a 48 horas con la tapa floja. Lectura Acido tendido/ácido fondo (A/A): fermentación de carbohidratos + Alcalino tendido/alcalino fondo (K/K): fermentación de carbohidratos - Alcalino tendido/ácido fondo (K/A): fermentación de glucosa + y lactosa - Alcalino tendido/ácido y negro fondo (K/A, H 2 S +): fermentación de la glucosa + lactosa - y producción de H 2 S + La producción de gas en el medio, se observa por la formación de burbujas o desplazamiento del medio. Control de calidad (ver control de calidad de los medios)

29 Página 29 de 39 E. coli: Acido/ácido, con producción de gas, H 2 S positivo S. flexneri: Alcalino/ácido, sin producción de gas, H 2 S negativo P. aeruginosa: Alcalino/alcalino, sin producción de gas, H 2 S negativo Registre los resultados en el formulario correspondiente (ver anexo de informes) Conservación Almacene a 5 C hasta por dos meses.

30 Página 30 de 39 Anexo 10 Caldo base decarboxilasa de Moeller Casas Comerciales: BBL - DIFCO - MERCK - OXOID Fundamento El medio es un caldo de glucosa al que se le adiciona un indicador y un aminoácido (lisina, ornitina o arginina), el cual se utiliza para medir la capacidad enzimática de los microorganismo de decarboxilar el aminoácido y formar una amina. El microorganismo fermenta la glucosa, por tanto el ph del medio se acidifica, sí, el microorganismo decarboxila el aminoácido, produce una amina y el ph del medio se alcaliniza nuevamente. Preparación Prepare la base según las indicaciones de la casa comercial. Cuando se preparan aminoácidos para diagnostico en Vibrio cholerae se debe tener presente la adición de cloruro de sodio al 1%. Adicione el aminoácido (lisina, arginina y ornitina) en una concentración del 1%, si el aminoácido está en forma L, o al 2% si está en forma D. En la ornitina ajuste el ph a 6,0 con NaOH 1N, antes de esterilizar el medio debido que es de naturaleza ácida. Sirva 4 ml en tubos con tapa de rosca 13x100. Esterilice en autoclave a 121ºC, por 10 min. Conserve en nevera a 4ºC. Inoculación Siembre una colonia, a partir del crecimiento de un cultivo puro. Inocule un tubo de control (la base sin aminoácido) y cada uno de los tubos con el aminoácido respectivo, lisina, arginina y ornitina. Adicione a los cuatro tubos 1 ml de aceite mineral o parafina estéril, para protegerlos del aire evitando una falsa alcalinización en la superficie del medio. Incube los tubos a 37ºC por horas hasta por 4 días. Lectura El tubo control debe mantener su color amarillo después de horas, lo que indica que únicamente ha sido fermentada la glucosa. Un control de color púrpura, invalida la lectura de los otros tubos. Resultado positivo Color púrpura y turbio

31 Resultado negativo Página 31 de 39 Color amarillo claro Control de calidad (ver control de calidad de los medios de cultivo) Control positivo S. enteritidis Color púrpura y turbidez Control negativo S. sonnei Color amarillo y turbidez Registre los resultados en el formulario correspondiente. Conservación Almacene a 5 C hasta por dos meses.

32 Página 32 de 39 Anexo 11 Caldo nutritivo para la prueba de tolerancia al NaCl 0%, 1%, 3%, 6%, 8% y 10% Casas Comerciales: BBL - DIFCO - MERCK - OXOID COMPOSICIÓN a. Caldo nutritivo 8,0g b. Agua destilada 1.000,0ml c. NaCl Preparación Mezcle los ingredientes a y b y coloque a calor suave hasta que se disuelva completamente Ajuste el ph entre 7,4 a 7,5 Divida el caldo en matraces en cantidades de 200ml Adicione el NaCl de acuerdo con el siguiente esquema cantidad de caldo gramos de NaCl Concentración final 200 ml 0 0% 200 ml 2 1% 200 ml 6 3% 200 ml 12 6% 200 ml 16 8% 200 ml 20 10% Sirva 3ml del caldo en tubos de tapa de rosca de 16 x 100mm Esterilice en autoclave a 121ºC x 10 minutos Procedimiento Haga una suspensión en agua peptonada sin NaCl al 1 de Mcfarland. Suspenda una gota en cada solución Control de calidad Crecimiento en el caldo al 0% de NaCl = Vibrio cholerae Crecimiento en el caldo al 1% de NaCl = Vibrio alginolyticus Conservación

33 Almacene a 5 C hasta por dos meses Página 33 de 39 Anexo 12. Serotipificación de Vibrio cholerae Casas Comerciales: BBL - DIFCO - Fundamento: Esta prueba es una confirmación serológica que se produce mediante la reacción en la que el microorganismo (antígeno) reacciona con el anticuerpo correspondiente. Esta reacción in vitro produce la formación de grumos macroscópicos denominada aglutinación. La reacción homologa deseada es rápida, de unión fuerte (alta afinidad) y no disociativa (alta avidez). Materiales y reactivos Lamina de vidrio Tubos de Kant 13x100 mm Solución salina al 0.85% Pipetas Pasteur Antisuero polivalente Vibrio cholerae Procedimiento: A partir de un cultivo en agar BHI de horas de incubación, transferir un asa llena de crecimiento a 0,5 ml de Solución salina al 0,85% estéril y emulsionar hasta homogenizar. En una lamina de vidrio colocar 10 µl de Antisuero polivalente Vibrio cholerae y una gota de la suspensión bacteriana. Mezclar el antisuero y la suspensión durante 1 minuto y luego observar si se ha producido aglutinación. Para poder realizar correctamente la lectura se debe realizar en la misma lamina un control de aglutinación colocando una gota de la suspensión bacteriana y una gota con solución salina, que al mezclar no debe aglutinar que en caso de que ocurra (autoaglutinación), el cultivo es rugoso y no se podrá analizar. Se debe realizar un subcultivo en agar no selectivo y repetir la prueba. Lectura Positiva: Si ocurre la aglutinación % de aglutinación (fondo transparente a ligeramente turbio) 3+ 75% de aglutinación (fondo ligeramente lechoso) 2+ 50% de aglutinación (fondo moderadamente lechoso) 1+ 25% de aglutinación (fondo lechoso) Negativa: No ocurre la aglutinación

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35 Página 35 de 39 Control de calidad Al realizar la prueba se deben utilizar dos controles, como control positivo una cepa conocida de Vibrio cholerae y como control negativo una cepa de una enterobacteria (Salmonella spp., Shigella sp., E. coli) NOTA: Este procedimiento se puede realizar para los serotipos Inaba y Ogawa. Conservación Almacene a 5 C hasta la fecha de vencimiento.

36 Página 36 de 39 Anexo 13. Medio Leche descremada Casas comerciales: BBL, DIFCO, OXOID Fundamento La leche descremada se usa como un medio completo, o como ingrediente de otro medio especial, para la propagación de microorganismos en productos lácteos. El polvo de leche descremada es un polvo desecado a partir de grandes volúmenes de leche descremada, es soluble y fácil de preparar. La leche descremada al 20% es usada como crioprotector para conservar microorganismos aeróbicos y anaeróbicos a -70 C así como para el proceso de liofilización de la mayoría de los microorganismos incluyendo levaduras y hongos. Composición Skim Milk es un producto estandarizado, recomendado como medio de cultivo que al reconstituir es equivalelente a leche desnatada fresca. Leche desnatada Agua destilada 20 g 100 ml Preparación Disuelva los ingredientes en frascos tapa de rosca de 50, 100 y 250 ml. Esterilice en autoclave a 121ºC por 8 minutos. Tenga cuidado en evitar sobre-calentamiento o que la leche tome un color caramelo ya que de esta manera no conservará los microorganismos. La duración del medio es de 1 meses. El ph del medio debe mantenerse a 6,1 +/ Control de calidad El control de calidad se realiza tomando un poco de la solución, que se debe sembrar en un agar BHI o TSA. No debe haber crecimiento bacteriano. Si se observa algún cambio en el aspecto de la solución durante su almacenamiento, deberá descartarse. Conservación: almacene a 5 C por un mes.

37 Página 37 de 39 Anexo 14. Hisopos tratados para coprocultivo Fundamento El carbón activado inactiva los ácidos grasos presentes en el medio y las sustancias tóxicas de la madera. Reactivos Solución A: Na 2 HPO 4 M/15: disuelva 9,4 gr de la sal anhidra en agua destilada para obtener 1 litro de solución. Solución B: KH 2 PO 4 M/15: disuelva 9,1 gr de sal anhidra en agua destilada hasta obtener 1 litro de solución. Solución amortiguadora ph 7,4: Mezcle 8,0 ml de la solución A y 2,0 ml de la solución B Procedimiento Coloque en un recipiente adecuado aproximadamente 500 escobillones en 100 ml de la solución amortiguadora de fosfatos de Sorensen M/15 ph 7,4 Hierva durante 5 minutos. Retírelos del recipiente y quite el exceso de humedad. Sumérjalos en una solución al 1% de carbón en polvo, (carbón activado, MercK). Los hisopos se humedecen girándolos dentro de la solución; deben quedar negros cuando están húmedos. Retire el exceso de humedad, secándolos en el horno a baja temperatura (40 C-50 C) por corto tiempo. Esterilícelos en autoclave a 121 C durante 15 minu tos.

38 Página 38 de DOCUMENTOS DE REFERENCIA 10. CONTROL DE REGISTROS CONTROL DE REGISTROS IDENTIFICACION ARCHIVO DE GESTION ARCHIVO CENTRAL ARCHIVO HISTÓRI CO COD NOMBRE ORDENACION DOCUMENTAL RESPONS ABLE LUGAR TIEMP O DE RETE NCIO N METO DO UTILIZ ADO RESPONS ABLE TIE MPO METODO UTILIZAD O (INSTRUCCIONES, UNA VEZ DILIGENCIARLAS, FAVOR ELIMINARLAS) IDENTIFICACION COD: son los caracteres (Código) que identifican el registro. Nombre: es el nombre completo del registro. ARCHIVO DE GESTION Ordenación documental: se describe la forma (Cronológica, temática) en que se organizan los registros al interior de cada unidad de conservación (carpeta, archivo electrónico). Responsable: es el cargo del responsable de velar por la integridad y orden en el almacenamiento del registro. Lugar: es el espacio físico donde permanece el registro. Tiempo de retención: es el periodo de permanencia del registro en el archivo de gestión, de acuerdo con la serie, subserie y tipo documental establecida en la Tabla de Retención Documental aprobada por la entidad. ARCHIVO CENTRAL

39 Página 39 de 39 Método utilizado: Es el modo de disposición del registro una vez cumplido su periodo de gestión, puede ser backup (en este caso especificar el lugar donde se almacena), transferencia primaria al archivo central en expedientes dando cumplimiento al procedimiento para las transferencias documentales primarias o destrucción del registro. Responsable: Es el cargo del responsable de controlar y efectuar la disposición inicial. Tiempo: Es el periodo de permanencia del registro en el estado descrito en el método. ARCHIVO HISTÓRICO Método utilizado: Es la disposición aplicable para el registro, puede ser conservación total por transferencia secundaria de un archivo central a un archivo histórico, eliminación o microfilmación. 11. CONTROL DE REVISIONES VERSIO N FECHA APROBACION AA MM DD DESCRIPCIÓN 12. ANEXOS