PROCEDIMIENTO DETECCION Vibrio cholerae EN ALIMENTOS BAM online. PRT Página 1 de 10

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1 PRT Página 1 de OBJETIVO Detectar la presencia de Vibrio cholerae en alimentos. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a muestras de alimentos (incluidos pescados, marisco y vegetales). 3. FUNDAMENTO cholerae presenta rápida generación o desarrollo por lo tanto incubar en un corto período de tiempo en un medio de enriquecimiento selectivo es efectivo para su aislamiento. El agua peptonada alcalina es recomendable sin embargo, la flora acompañante puede crecer demasiado por incubaciones prolongadas. Si el producto ha sido sometido a proceso de calentamiento, congelación, deshidratado o bien baja densidad es esperada, una incubación de 18 a 24 horas es recomendada para resucitar las células dañadas. 4. REFERENCIAS 4.1 Bacteriological Analytical Manual Online, BAM Chapter 9 January Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food, 4 Ed TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Equipos e insumos Bolsas estériles o contenedor estéril para el transporte de las muestras Incubadora a 35 ºC ± 2 ºC Asas Portaobjetos Licuadora Waring Blender Baño de agua regulado a 42 ± 0,1 ºC Incubadora regulada a ºC (opcional)

2 PRT Página 2 de Medios de cultivos y reactivos Agua peptonada Alcalina (APA) Agar TCBS (agar Tiosulfato-Citrato- Sales biliares Sacarosa) Agar CPC modificado (Agar Celobiosa- Polimixina - Colistina modificado) Agar CC (agar Celobiosa Colistina) Agar AGS (agar Arginina- glucosa tentido) Agar triptona o tripticasa con 1% NaCl (T 1 N 1 ) Caldo tripticasa al 0% NaCl (T 1 N 0 ) Caldo tripticasa al 3% NaCl (T 1 N 3 ) Caldo triptona (triptófano) 0%NaCl Agar MIO Agar TSI o KIA Desoxicolato de sodio al 0,5% Antisuero polivalente O Antisuero Inaba, Ogawa (Optativo) Antisuero O139 (Optativo) Agar sangre de cordero (Optativo) 7. DESARROLLO 7.1 PESAJE Y SIEMBRA DE ALIMENTOS EN GENERAL ( pescados y mariscos) Pesar 25 gramos de muestra (en jarra capacidad aproximadamente 500 ml).los productos como mariscos o vegetales pueden ser homogeneizados en licuadora o bien cortados con tijera estéril en pequeñas piezas Añadir 225 ml de agua peptonada alcalina a la jarra. Mezclar muy bien la muestra u homogeneizar en licuadora por 2 minutos a alta velocidad Incubar la muestra con el agua peptonada alcalina a 35 ºC ± 2 ºC por 6 a 8 horas. Reincubar por h si la muestra corresponde a un producto procesado Para el análisis de ostras crudas, incluir un segundo frasco con 25 g del producto más 2475 ml de agua peptonada alcalina. Este frasco debería ser incubado por 18 a 21 h a

3 PRT Página 3 de ± 0,1 ºC en baño de agua. La técnica de enumeración por número más probable (NMP) puede ser desarrollada si lo estima necesario Preparar placas secas de TCBS. Si cuenta con agares CPC modificado o CC, se pueden incluir Transferir de la película superficial del enriquecido de agua peptonada alcalina (de las 6 y 18 horas) con asa de 3 mm a la superficie del agar TCBS (y mcpc o CC) y sembrar de tal manera de obtener colonias aisladas Incubar las placas de TCBS por 18 a 24 h a 35 ± 2 ºC. Las placas de mcpc y CC incubarlas por 18 a 24 h a ºC, si no es posible disponer de una incubadora a esta temperatura, incubar entre 35 a 37 ºC. La selectividad está primariamente determinada por los antibióticos en la formulación del medio más que por la alta temperatura Las colonias típicas de Vibrio cholerae sobre agar TCBS son grandes de 2 a 3 mm, lisas de color amarillo y ligeramente aplanadas con un centro opaco y una zona periférica translúcida Las colonias típicas sobre agar mcpc o CC son pequeñas, lisas, opacas y de un color verde a púrpura, con un fondo púrpura en incubaciones prolongadas Para la identificación bioquímica, las colonias deben ser traspasadas a un agar en placa no selectivo (T 1 N 1, T 1 N 3, o TSA con NaCl al 2%) para obtener colonias puras. Incubar por 18 a 24 h a 35 ± 2 ºC y proceder con la identificación usando una colonia solo aislada Subcultivar 3 o más colonias típicas de cada placa de agar T 1 N 1 a tubo en tendido de agar T 1 N 1 o por picadura en medio para la prueba de movilidad. Incubar por18 a 24 h a 35 ± 2 ºC. 7.2 SCRENNING Y CONFIRMACIÓN Glucosa arginina en tendido (AGS): Incubar colonia sospechosas del tubo de agar T 1 N 1 a agar AGS por siembra en estría en tendido y por picadora en el fondo Incubar el agar AGS con la tapa suelta por 18 a 24 h a 35 ± 2 ºC Los cultivos de cholerae y mimicus resultan alcalino (púrpura) en tendido y como la arginina no se hidroliza resulta ácido (amarillo) en profundidad o picadura. No se produce gas y tampoco H 2 S.

4 PRT Página 4 de Tolerancia a la sal: A partir del agar T 1 N 1 inocular ligeramente un tubo de caldo T 1 N 0 y de caldo T 1 N Incubar por 18 a 24 h a 35 ± 2 ºC Los cultivos de cholerae y mimicus crecen sin NaCl String test: es una prueba presuntiva de utilidad para las cepas de cholerae las que resultan positivas al ensayo A partir del agar T 1 N 1 emulsionar una gran cantidad de cultivo en un apequeña gota de desoxicolato de sodio al 0,5% en agua destilada estéril Dentro de 60 segundos las células y las hebras de ADN se lisan (pérdida de turbidez) cuando el asa se levanta ( 2 a 3 cm) del portaobjeto o lámina Reacción de Oxidasa: Transferir con asa de platino o un aplicador de madera (alambre de nicrón no debe ser usado) del cultivo del agar T 1 N 1 a una cinta de papel filtro saturado con el reactivo de oxidasa (1% N,N,N`,- tetrametil-p-fenilendiamino 2HCl) La formación o desarrollo de un color púrpura oscuro dentro de 10 segundos indica resultado positivo Alternativamente, añadir una gota del reactivo respectivo a un tubo de agar T 1 N 1 o en placa de agar. cholerae y mimicus resultan positivo al ensayo Agar MIO: A partir del agar T 1 N 1 inocular con asa de aguja en picadura un tubo de agar MIO Incubar por 24 h a 35ºC± 2 ºC. cholerae es móvil, indol y ornitina positiva Sembrar en agar TSI o KIA en tendido y profundidad Incubar a 35 ºC por 24 h. cholerae en tendido puede ser alcalino (K) o ácido (A), el fondo del tubo es ácido (A), gas negativo y H 2 S negativo Agar TSI o KIA en tendido y profundidad: A partir del agar T 1 N 1 inocular con asa de aguja en tendido y en picadura en profundidad.

5 PRT Página 5 de Incubar con la tapa ligeramente suelta a 35 ºC por 24 h Las cepas de cholerae en tendido pueden resultar alcalino (K) o ácido (A), el fondo del tubo es ácido (A), gas negativo y H 2 S negativo Agar LIA: A partir del agar T 1 N 1 inocular con asa de aguja en tendido y en profundidad Vibrio cholerae es lisina decarboxilasa positiva, gas negativo y H 2 S negativo Incubar con la tapa ligeramente suelta por 24 h a 35 ºC Indol en caldo triptona al 0% NaCl: A partir del agar T 1 N 1 inocular con asa de 3 mm un tubo con caldo triptona al 0% NaCl Incubar a 35 ºC± 2 ºC por 24 h cholerae presenta desarrollo y resulta positivo al indol al agregar gotas de reactivo de Kovacs. 7.3 CARACTERIZACIÓN SEROLÓGICA El serotipo de las cepas sospechosas de de cholerae string test positivo se realiza utilizando antígenos somáticos O los que otorgan la evidencia de la importancia epidemiológica. La mayoría de los serotipos del serogrupo O1, Ogawa e Inaba y el serogrupo O139 son reconocidos patógenos humanos. Los dos serotipos del serogrupo O1 son observados en ambos biotipos de cholerae: Clásico y el Tor Para cada cultivo a evaluar: Marcar tres secciones con lápiz (de cera) alrededor de 1 x 2 cm sobre el interior de una placa de Petri de vidrio o sobre un porta objeto de 2x3 pulgadas Añadir una gota de solución salina al 0,85% en la parte inferior de cada sección marcada Con un asa o aguja estéril emulsionar del cultivo de agar T 1 N 1 en la solución salina para una sección y repetir para las otras secciones Verificar si ocurre aglutinación.

6 PRT Página 6 de Añadir una gota del antisuero polivalente cholerae O1 a una sección y emulsionar el cultivo con un asa o aguja estéril Añadir una gota del antisuero O139 a una sección separada (tercera sección) Inclinar la mezcla de un lado a otro por un minuto y obsérvela contra un fondo oscuro. Una reacción positiva es indicada por una rápida y fuerte aglutinación en un fondo claro Si resulta positivo para serogrupo O1, probar separadamente con los antisueros Ogawa e Inaba. El serotipo Hikojima reacciona con ambos antisueros Los anticuerpos contra los antígenos Inaba y Ogawa y serogrupo O1 se encuentran disponibles comercialmente. Lo mismo ocurre con el antisuero O Resultados de cultivos no aglutinables deben ser reportados como cholerae no O1 / O ENSAYOS BIOQUÍMICOS La tabla del Anexo Nº 1 presenta el número necesario mínimo de características para identificar cepas de cholerae La capacidad de cholerae para crecer en triptona al 1% sin NaCl lo diferencia de otros vibrios sacarosa positiva El sistema API 20E ha sido usado con éxito para la identificación y confirmación de aislados El sistema de placas de microtitulación para el almacenamiento de aislados sospechosos puede ser usado.

7 PRT Página 7 de DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS BIOTIPOS EL TOR Y CLÁSICO El biotipo Clásico es raramente encontrado, los siguientes ensayos opcionales son para diferenciarlo del biotipo El Tor: Beta- hemólisis: el medio más común de diferenciar los biotipos del cholerae O1 y tal vez la más fácil es determinar la capacidad de producir β- hemólisis sobre placa de agar sangre de cordero Las cepas del biotipo El Tor son β- hemolíticas, mientras que el biotipo Clásico no produce una hemolisina Sembrar el cultivo a ensayar en cuña y superficie en placas de agar sangre de cordero incubar a horas a 35 ºC± 2ºC. La β- hemólisis puede ser determinada por una zona clara alrededor del cultivo Sensibilidad a la Polimixina B: Sembrar profusamente un cultivo sospechoso en una placa seca de agar T 1 N Poner un disco de 50 unidades de polimixina B sobre la superficie Las cepas del biotipo Clásico son sensibles (una zona de >12 mm); las cepas del biotipo El Tor son resitentes. Si el cultivo sospechoso crece sobre agar mcpc, el cual contiene polimixina B, se considera que se trata del biotipo El Tor. 7.6 CONFIRMACIÓN Enviar al Centro de Referencia, las cepas que resulten bioquímicamente compatibles con cholerae y aglutinen con el antisuero polivalente Enviar la cepa en placa o tubo tendido de agar T1N1 debidamente rotulada, la encomienda debe ser en triple embalaje cumpliendo la normativa de transporte de sustancias peligrosas Adjuntar formulario de envío de cepas ambientales.

8 PRT Página 8 de REGISTROS Registro detección Vibrio cholerae en alimentos BAM online 9. ANEXOS 9.1 Anexo Nº 1: Esquema Características bioquímicas mínimas para identificar de cholerae y parahaemolyticus. 9.2 Anexo Nº 2 Esquema Características bioquímicas de Vibriones patógenos comúnmente encontrados em pescados y mariscos.

9 PRT Página 9 de 10 ANEXO Nº 1 Características Bioquímicas de cholerae Número mínimo de características necesarias para identificar cepas cholerae y parahaemolyticus Bacilo Gram-negativo, no esporulado Oxidasa String test L-lisina decarboxilasa L-arginina dehidrolasa L-ornitina decarboxilasa Reacción positiva Porcentaje ± Desarrollo en caldo triptona al 1% a b /0 c a Sin NaCl b cholerae (y mimicus) c parahaemolyticus

10 PRT Página 10 de 10 Anexo Nº 2 Características bioquímicas de Vibrios patógenos comunmente encontrados en pescados y mariscos Biochemical characteristics of human pathogenic Vibrionaceae commonly encountered in seafood* alginolyticus cholerae fluvialis furnissii hollisae metschnikovii mimicus parahaemolyticus vulnificus A. hydrophilia** TCBS agar Y Y Y Y NG Y G G G Y G mcpc agar NG P NG NG NG NG NG NG Y NG NG CC agar NG P NG NG NG NG NG NG Y NG NG AGS KA Ka KK KK Ka KK KA KA KA KK nd Oxidase Arginine dihydrolase Ornithine decarboxylase Lysine decarboxylase V + Growth in (w/v): 0% NaCl % NaCl % NaCl % NaCl + V + V % NaCl + Growth at 42 C + + V nd V V + Acid from: Sensitivity to: Sucrose V D- Cellobiose + V + + Lactose + V Arabinose V D-Mannose V D-Mannitol V + ONPG Voges- Proskauer 10 µg O/ µg O/129 + V + + R S R R nd S S R S R S S S S S nd S S S S R S Gelatinase Urease V * Adapted from Elliot et al. ** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides Abbreviations: TCBS, thiosulfate -citrate -bile salts -sucrose; mcpc, modified cellobiose -polymyxin B-colistin; AGS, arginine-glucose slant; Y = yellow NG = no or poor growth S = susceptible nd = not done G = green V = variable among strains R = resistant P = purple, V = variable KK = Slant alkaline / Butt alkaline KA = Slant alkaline /Butt acidic, Ka = Slant alkaline/ Butt slightly acidic P. shigelloides**