XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto.

Transcripción

1 VIABILIDAD DE CEPAS PROBIÓTICAS EN LECHE FERMENTADA ALMACENADA EN REFRIGERACIÓN. González-Montiel L. a *, Bravo-Delgado C. H. a, Pimentel-González D. J. y Campos-Montiel R. G. b a Universidad de la Cañada. Carr. Teotitlán-San Antonio Nanahuatipán Km. 1.7 s/n. Paraje Titlacuatitla. Teotitlán de Flores Magón, Oax., México. C. P b Centro de Investigación en Ciencias y Tecnología de los Alimentos. Instituto de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Tulancingo, Hgo. México CP luciogonzalez@naxoloxa.unca.edu.mx RESUMEN: Las leches fermentadas deben tener un elevado contenido de microorganismos vivos y activos (10 6 a 10 8 UFC/g) para poder ejercer los beneficios a la salud (Fuller, 1989). En esta investigación se evaluó la viabilidad de los microorganismos probióticos (Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus paracasei subsp paracasei) en leche fermentada con cultivo para yogur (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus), durante 35 días de almacenamiento a temperatura de refrigeración (4-6 C). Cada semana se evalúo el contenido total de Lactobacillus (Agar MRS ph 5.4), Streptococcus (Agar M17) y bacterias probióticas (agar MRS ph % de sales biliares). Los resultados mostraron que a los 35 días la leche fermentada adicionada con Lactobacillus paracasei subsp paracasei afectó el crecimiento de Streptococcus. La leche fermentada con Lactobacillus rhamnosus se mantuvo en conteos superiores a 6.8 Log 10 UFC/g después de 35 días de almacenamiento mientras que la leche fermentada con Lactobacillus paracasei subsp paracasei con 7.6 Log 10 UFC/g. ABSTRACT: Fermented milks must to have high contained of live and active microorganisms (10 6 a 10 8 CFU/g) for provide health benefits (Fuller, 1989). In this research was evaluated the viability of probiotic microorganisms (Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei subsp paracasei) in fermented milk with yogur starter (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus), during 35 storage days with a temperature of 4-6 C. Weekly, was evaluated total contained of Lactobacillus (Agar MRS ph 5.4), Streptococcus (Agar M17) and probiotics bacteria (agar MRS ph % of bile salts). Results showed that after 35 days, fermented milk with Lactobacillus paracasei subsp paracasei affected the growth of Streptococcus. Fermented milk with Lactobacillus rhamnosus was maintained in counts superiors to 6.8 Log 10 CFU/g after 35 days of storage, while milk fermented with Lactobacillus paracasei subsp paracasei had 7.6 Log 10 UFC/g. Palabras clave: Leche fermentada, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei LA81

2 INTRODUCCIÓN A las leches fermentadas, desde hace cientos de años, se les ha atribuido propiedades benéficas a la salud de consumidor, más allá de las aportaciones nutricionales, encontrando referencias al respecto en la Biblia y otros documentos antiguos. Pero no es hasta principios de siglo XIX cuando Metchnikoff les otorga valor científico al sugerir que los microorganismos del yogur podrían contrarrestar los efectos putrefactivos del metabolismo gastrointestinal, postulando la longevidad de poblaciones caucásicas consecuencia del consumo de estos productos en altas cantidades. Aunque los yogures consumidos por estas poblaciones antiguas distaban mucho de los actuales (su composición bacteriana era muy variable y contenía probablemente la mezcla de diferentes especies), a raíz de estos descubrimientos, se ha ido profundizando en el estudio de los posibles efectos de estos alimentos sobre la salud (Tamime, 2002). La Norma del Codex Alimentarius para leches fermentadas, las define como aquellos productos lácteos obtenidos mediante fermentación de la leche, que pueden haber sido elaborados a partir de productos obtenidos de la leche con o sin modificaciones en la composición, por medio de la acción de microorganismos adecuados y teniendo como resultado la reducción del ph con o sin coagulación (precipitación isoeléctrico de las proteínas). Los microorganismos serán viables, activos y abundantes en el producto hasta la fecha de duración mínima salvo si el producto es tratado térmicamente tras la fermentación, en cuyo caso no se aplica el requisito de microorganismos viables (CODEX STAN ). En la actualidad, las leches fermentadas, son productos alimenticios altamente difundidos por varios medios de comunicación. Pues se ha podido comprobar que el consumo cotidiano de este tipo de productos puede favorecer la nutrición, así como, ejercer algunos beneficios a la salud del consumidor. Por lo tanto, existen un gran número de leches fermentadas en el mercado. Las principales diferencias que podemos encontrar en estos productos, son la composición química de la leche (principalmente en materia grasa), tipos (para beber o batido), así como la composición o tipo de microorganismos empleados. Cabe destacar, que generalmente se utilizan los microorganismos para el yogur (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus), esto es, por que proporcionan excelentes características organolépticas (RD 179/2003). Sin embargo, se sabe que estos microorganismos no son considerados como probióticos, ya que no soportan las condiciones del tracto gastrointestinal (Gilliland, 1979, 1989). Es por ello, que se adicionan otros microorganismos, que se ha comprobado que además de soportar las condiciones del tracto intestinal, ejercen un beneficio sobre la salud del consumidor. Los microorganismos, que son adicionados pertenecen a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, principalmente (Requena et al., 2005). LA82

3 Fuller (1989) menciona que sólo podrá considerarse como probióticos, aquellos microorganismos que cumplan las siguientes características: ser una cepa capaz de ejercer un efecto benéfico en el huésped; no debe ser patógeno; no debe ser tóxico; debe estar presente como células viables, preferentemente en grandes cantidades (10 6 a 10 8 ); ser capaz de sobrevivir y realizar su metabolismo en el ambiente intestinal (resistencia a bajo ph, a ácidos orgánicos, y sales biliares); ser estable y capaz de permanecer viable por largos periodos bajo condiciones de almacenamiento. El objetivo del presente estudio es conocer la viabilidad de dos bacterias probióticas (Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus paracasei subsp. paracasei), en leches fermentadas, durante el almacenamiento a 4-6 C, por un periodo de 35 días. METODOLOGÍA Cultivos lácticos Se utilizaron cultivos liofilizados para yogur, constituido por Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus (YO-MIX TM 499, Danisco), y como cepas probióticas; Lactobacillus rhamnosus (HOLBAC LC 81, Danisco) y Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (LBC 81, Danisco), de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Planteamiento del experimento. En la primer etapa, se preparó un cultivo madre o cultivo stock, para el cultivo de yogur (Y), Lactobacillus rhamnosus (LR) y Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (LPC), utilizando leche en polvo estéril reconstituida al 12% de sólidos totales. Se inocularon (de acuerdo a la especificación del proveedor) e incubaron las muestras a 42 C hasta alcanzar un ph 4.6 aproximadamente. Posteriormente se almacenaron las muestras en refrigeración (4 a 6 C), durante 24 horas, y se les determinó ph y acidez final. Para la preparación de las leches se siguió la metodología clásica para la elaboración de un yogur, como se muestra en la siguiente figura (Tamime, 2002). Se formularon tres tratamientos para obtener leches fermentadas: leche 1 (Y 1.5% + LR 1.5%); leche 2 (Y 1.5% + LPC 1.5%) y como control la leche 3 (Y 1.5 %). El proceso de obtención del la leche fermentada se puede apreciar en la figura 1. Posteriormente, las muestras se mantuvieron almacenadas a temperatura de refrigeración (4 a 6 C) durante 35 días, cada 7 días se tomaron muestras para su respectivo análisis. LA83

4 Recepción de leche (Leche semi-descremada (UHT) Reconstitución de sólidos 4% leche descremada en polvo (40 C) 4% azúcar (60 C) Tratamiento térmico (90 C 10 min) Enfriamiento (42 C) Adición de cultivo Leche 1 (Y 1.5% + LR 1.5%), Leche 2 (Y 1.5% + LPC 1.5%), o Leche 3 (Y 1.5 %) Incubación Fin de la fermentación, con enfriamiento (4 6 C) Almacenamiento (4 6 C durante 35 días) Y= cultivo para yogur; LR= Lactobacillus rhamnosus; LPC= Lactobacillus paracasei subsp paracasei Figura 1. Diagrama para la formulación de leches fermentadas (Tamime, 2002). Análisis microbiológicos. Preparación de muestras y diluciones. Para la realización de los análisis microbiológicos se utilizó la metodología propuesta por la NOM-110-SSA Utilizando 10 g de muestra, los cuales fueron diluidos en 90 ml de una solución de agua peptonada al 0.1% estéril (1 g de peptona, con 8.5 g de cloruro de sodio, en un litro de agua destilada), posteriormente se realizaron las diluciones decimales pertinentes, de las cuales se inoculó 1mL, en cajas petri estériles (100 mm x 15 mm). LA84

5 Cuantificación de bacterias ácido lácticas (Lactobacillus). Se utilizó Agar MRS (De Man et al., 1960), el cual se disolvió en agua destilada, ajustando el ph a 5.4, posteriormente se esterilizó a 121 C durante 15 min. A las cajas que contenían la muestra se les adicionó de ml, de medio de cultivo a C, se homogenizaron las muestras, se dejaron solidificar y se aplicó una segunda capa de medio y se incubaron a 37 C + 2 C, durante 72 h, la cuantificación se realizó contando el número de unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g), con la ayuda de un contador de colonias. Cuantificación de Streptococcus. Se utilizó Agar M17, el cual se disolvió en agua destilada, posteriormente se esterilizó a 121 C durante 15 min. A las cajas que contenían la muestra se les adicionó de ml, de medio de cultivo a C, se homogenizan las muestras, se aplicó una segunda capa de medio y se incubaron a 37 C + 2 C, durante 72 h, la cuantificación se realizó contando el número de unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g), con la ayuda de un contador de colonias. Cuantificación de bacterias probióticas. La cuantificación se realizó de acuerdo a la metodología propuesta por Vinderola and Reiheimer (1999, 2000), utilizando Agar MRS (De Man et al., 1960) adicionado con 0.15% de sales biliares, los cuales se disolvieron en agua destilada, ajustando el ph a 5.4, posteriormente se esterilizó a 121 C durante 15 min. A las cajas que contenían la muestra se les adicionó de ml, de medio de cultivo a C, se homogenizaron las muestras, se dejaron solidificar y se aplicó una segunda capa de medio y se incubaron a 37 C + 2 C, durante 72 h, la cuantificación se realizó contando el número de unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g), con la ayuda de un contador de colonias. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la Figura 2, se muestran los resultados obtenidos del conteo de lactobacilos en las tres leches fermentadas. Como se puede observar, después de 35 días de almacenamiento, no se observaron diferencias significativas en las tres diferentes formulaciones. Una característica que deben cumplir las leches fermentadas, es que deben contener microorganismos viables, activos y en una concentración superior a 10 6 UFC/g en el producto hasta la fecha de duración mínima, dicha condición se cumple en todas las muestras, teniendo alrededor de 8 Log 10 de UFC/g (CODEX STAN ). LA85

6 Figura 2. Viabilidad de bacterias ácido lácticas crecidas en agar MRS en tres leches fermentadas: leche 1 ( ), leche 2 ( Ο ) y como control, leche 3 ( ) almacenadas durante 35 días en refrigeración (4-6 C). Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, al igual que muchos otros lactobacilos pueden crecer en agar MRS, por lo tanto puede suponerse que en leches adicionadas con lactobacilos, los conteos totales de lactobacilos se verán incrementados. Sin embargo, Olson and Aryana (2008), prepararon cuatro leches fermentadas tipo yogur, adicionadas con diferentes concentraciones de Lactobacillus acidophilus, los cuales no reportaron diferencias entre las leches adicionadas con la bacteria probiótica y el control. Por su parte, Dave and Shan (1997a, 1997b) reportaron que altos porcentajes del cultivo estárter (inoculo) incrementan los conteos de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, sin embargo después de 15 y 20 días de almacenamiento estos disminuyen considerablemente. Los resultados obtenidos en este trabajo, tienen similitud a los estudios antes mencionados, sin embargo, dichos autores utilizaron en algunos de sus tratamientos porcentajes mayores ya sea de inoculo o de la bacteria probiótica. En la tabla 1, se presentan los resultados de viabilidad de los Streptococcus thermophilus, y se observa que en 35 días de almacenamiento no hubo diferencia significativa entre el inicio y el final del tratamiento en la leche fermentada con cultivo de yogur y L. rhamnosus; en la leche fermentada sólo con cultivo de yogur hubo un incremento significativo en Streptococcus a partir del día 21; por otro lado, en la leche fermentada con cultivo de yogur y Lactobacillus paracasei subsp paracasei, hubo una disminución significativa al día 35 en Streptococcus afectando su crecimiento. LA86

7 Tabla 1. Viabilidad de Streptococcus (Agar M17) en tres leches fermentadas almacenadas en refrigeración (4 a 6 C). Leche 1 (YLR) Leche 2 (YLPC) Leche 3 (Y) Días Log 10 UFC/g a a a a a a a a a a a b a a b a b b Leche 1 (YLR)= Leche con cultivo de yogur + Lactobacillus rhamnosus; Leche 2 (YLPC)= Leche con cultivo de yogur + Lactobacillus paracasei subsp paracasei; Leche 3 (Y)= Yogur Medias + desviación estándar, diferente superíndice significan diferencias significativas (p<0.05) usando la técnica de Tukey. Birollo et al., (2000), reportaron que S. thermophilus crece bien en agar M17, y que las condiciones aerobias o anaerobias no interfieren en su crecimiento, también mencionan que S. thermophilus, en yogur almacenado a 6 C durante 60 días solamente reduce un ciclo logarítmico, en este trabajo se aplicó una doble capa de medio de cultivo, y los resultados son similares. Salvador and Fiszman (2004), reportaron conteos de S. thermophilus similares a los obtenidos en el presente trabajo, en yogur entero y descremado, almacenado a 10 C durante 49 días. Serra et al., (2009), reportaron conteos de S. thermophilus similares a los encontrados en este trabajo, en yogur refrigerado durante 28 días. En la tabla 3, se muestran los resultados de viabilidad de las cepas probióticas en los tres tratamientos fermentados con cultivos de yogur y adicionados con Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus paracasei subsp paracasei, durante 35 días en refrigeración (4 a 6 C). En el tratamiento fermentado únicamente con cultivo de yogur se pudo observar que no creció ningún microorganismo probiótico. Se observó que el tratamiento fermentado con cultivo de yogur adicionado con Lactobacillus paracasei subsp paracasei tuvo una viabilidad significativamente mayor (p<0.05) con respecto al fermentado con cultivo de yogur adicionado con Lactobacillus rhamnosus en los 35 días de almacenamiento. Sin embargo ambos tienen conteos superiores a 6 Log10 UFC/g. LA87

8 Tabla 3. Viabilidad de bacterias probióticas, en leches fermentadas almacenadas en refrigeración (4 a 6 C). Leche 1 (YLR) Leche 2 (YLPC) Leche 3 (Y) Días Log 10 UFC/g a a NC a a NC a a NC a a NC a a NC a a NC Leche 1 (YLR)= Leche con cultivo de yogur + Lactobacillus rhamnosus; Leche 2 (YLPC)= Leche con cultivo de yogur + Lactobacillus paracasei subsp paracasei Medias + desviación estándar, diferente superíndice significan diferencias significativas (p<0.05) usando la técnica de Tukey. NC= No Cuantificadas En la actualidad se utiliza agar MRS para cuantificar microorganismos probióticos en cultivos puros, sin embargo cuando se tienen muestras con más de una cepa, la identificación y cuantificación de estos se vuelve más compleja. Es por ello, que se han diseñado varios medios de cultivo para poder diferenciar los lactobacilos probióticos de otros lactobacilos. Vinderola and Reinheimer (2000), propusieron utilizar agar MRS, como base para formular dos medios de cultivo y así diferenciar lactobacilos probióticos de los cultivos estárter del yogur: el agar MRS-PL (MRS- Propionato de litio (cloruro de litio 0.2 % + Propionate de sodio 0.3%) y agar MRS- SB (MRS-Sales biliares 0.15%), estos dos medios de cultivo no presentan diferencias significativas e inhiben Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus. Fuller (1989) mencionó que sólo podrán considerarse como probióticos, aquellos microorganismos presentes como células viables, preferentemente en grandes cantidades (10 6 a 10 8 ), dicha condición se cumple en estas leches adicionadas con cepas reconocidas como probióticas. Shah et al., (1995), menciona que para los productos comerciales que se consumen regularmente, el nivel mínimo sugerido de células viables de probióticos es de 1 x 10 5 UFC/g. Tejeda-Trujillo et al., (2010), analizaron tres leches fermentadas almacenadas en refrigeración y a 22 C, después de 60 días, las muestras presentaban conteos de 6.5 Log 10 UFC/g, no encontrando diferencia significativa respecto a la temperatura de almacenamiento. LA88

9 CONCLUSIONES Las leches fermentadas con los microorganismos los probióticos Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus paracasei subsp paracasei cuentan con la viabilidad suficiente para obtener un producto probiótico durante 35 días de almacenamiento en refrigeración (4-6 C). A los 35 días, la leche fermentada con Lactobacillus paracasei subsp paracasei afecta la viabilidad de Streptococcus thermophilus. REFERENCIAS Birollo GA. Reinheimer JA. Vinderola CG Viability of lactic acid microflora in different types of yoghurt. Food Research International. 33: CODEX STAN Norma de Codex para leches fermentadas. Dave RI. Shah NP Effect of level of starter culture on viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts. Food Australia. 49: Dave RI. Shah NP Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts made from commercial starter cultures. International Dairy Journal. 7: De Man, J. D. Rogosa, M. Sharpe, M. E A medium for the cultivation of Lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology. 23; Fuller R Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology. 66: Gilliland SE Beneficial interrelationships between certain microorganisms and humans: Candidate microorganism for use as dietary adjuncts. Journal of Food Protection. 42: Gilliland SE Acidophilus milk products: A review of potential benefits to consumers. Journal Dairy Science. 72: [NOM-110-SSA1-1994] Norma Oficial Mexicana. (1994). Bienes y Servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Olson DW. Aryana KJ An excessively high Lactobacillus acidophilus inoculation level in yoghurt lowers product quality during storage. Science Direct. LWT 41: Real Decreto 179/2003. Norma de calidad para el yogur o yoghurt. Requena T, Janer C. Pelaéz C Las leches fermentadas probióticas. AgroCSIC. CT2-CT5 Salvador A. Fiszman S. M Textural and sensory characteristics of whole and skimmed flavored set-type yogurt during long storage. Journal Dairy Science. 87: Serra M. Trujillo A. J. Guamis B. Ferragut V Proteolysis of yogurts made from ultra-high-pressure homogenized milk during cold storage. Journal Dairy Science. 92: LA89

10 Shah NP. Lankapthra WEV. Britz ML, Kyle WSA Survival of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum in commercial yoghurt during refrigerated storage. International Dairy Journal. 5: Tamime AY Fermented milk: a historical food with modern applications-a review. European Journal of Clinical Nutrition. 56 (Suppl 4):S2-S15. Tejada-Trujillo F. Pasindo-Gómez A. López-Álvarez JM. Hernández-Ramos ME Survival of bacteria probiotics in fermented milks stored at two temperatures. 5 International Symposium on Probiotics. 21 al 23 de mayo de Ciudad de México. Vinderola CG. Reinheimer JA Culture media for the enumeration of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus in the presence of yoghurt bacteria. International Dairy Journal. 9(8): Vinderola CG. Reinheimer JA Enumeration of Lactobacillus casei in the presence of L. acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria in fermented dairy products. International Dairy Journal. 10: LA810