Producción n de AcM y su. alérgenos y micotoxinas. Cristina Romero Gonzalo

Transcripción

1 Producción n de AcM y su Aplicación n en los análisis de alérgenos y micotoxinas Cristina Romero Gonzalo

2 INGENASA ACTIVIDADES Investigación de productos biotecnológicos orientados hacia la salud humana, animal y de plantas Desarrollo, producción y comercialización de ensayos para sanidad animal y de diagnóstico alimentario Los productos comerciales están basados en nuestros proyectos de I+D Participación de todos los Departamentos de la empresa: Investigación, Desarrollo, Producción, Ventas, QC

3 INGENASA SANIDAD ANIMAL SEGURIDAD ALIMENTARIA GRAN ANIMAL PEQUEÑO ANIMAL ENSAYOS PROPIOS KITS DE DISTRIBUCIÓN Gluten DIAGNÓSTICO MOLECULAR

4 LÍNEA ALIMENTARIA: Gluten ORIGEN: colaboración con la Unidad de Gluten del Centro Nacional de Biotecnología INGEZIM GLUTEN (ensayo cuantitativo) PRODUCTOS INGEZIM GLUTEN SEMIQ (ensayo Semi-cuantitativo)

5 LÍNEA ALIMENTARIA: Distribución COLABORACIÓN Distribución en España de la Línea de productos Biocontrol Distribución mundial de productos INGENASA para detección de gluten

6 PRODUCTOS DISTRIBUCIÓN MICOTOXINAS ALERGENOS Transia plate Af B1 Crustacean Residue ELISA ANTIBIÓTICOS Transia TICOS plate Af B1 CrustaceanMICROCISTINAS Residue ELISA Transia Transia plate Af M1 Egg Residue ELISA Transia Transia plate plate plate Chloramphenicol Chloramphenicol Af M1 Microcystine ENZYPLUS Microcystine Egg Residue Tube ELISA Kit PESTICIDAS Tube Kit Detección Transia plate DON β-lactoglobuline β-lactoglobuline Residue Residue ELISA Detección Transia de plate de ácidos ácidos DONy y azúcares azúcares Triazinas Microcistine Quantitube kit ELISA PATÓGENOS Triazinas Microcistine Quantitube Metalaxyl O.M.G Metalaxyl kit Transia Transia plate plate Total Total Af Af Peanut Peanut Residue Residue ELISA Transia ELISA Transia Card Card E.Coli E.Coli O157 O157 PARA Acetanilidas Microcystine Microcystine Plate Plate Metopreno kit PARA Acetanilidas HOJAS, HOJAS, SEMILLAS SEMILLAS Y GRANO Metopreno GRANO kit Transia Transia Transia plate plate Fumonisina Plate Fumonisina Salmonella Gold Soy Soy Protein Protein Residue Residue ELISA Transia Plate Salmonella Gold Paraquat Paraquat Cry1Ab/Cry1Ac Isoproturon ELISA Cry1Ab/Cry1Ac Isoproturon Transia Transia Transia Transia plate plate Zearalenona Plate Listeria Monocyt. Zearalenona Plate Listeria Monocyt. Cyanacina Casein Casein Residue Residue ELISA CyanacinaCry2A Cholinesterasa ELISA Transia Transia Plate Plate Listeria Cry2A Cholinesterasa Listeria Ciclodienos Hazelnut Hazelnut Residue Residue Organochlorina ELISA ELISA Transia Transia Plate Plate SET Ciclodienos Cry9C Cry9C Organochlorina SET Imidacloprid Sesame Sesame Seed Seed Residue Residue ELISA Imidacloprid Cry1C ELISA Cry1C Almond Almond Residue Residue ELISA Cry3Bb ELISA Cry3Bb Mustard Mustard Residue Residue ELISA Cry1F ELISA Cry1F Roundup Roundup Ready Ready LibertyLink LibertyLink PAT PAT

7 ELISA : Definición ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ENSAYO BASADO EN EL USO DE ANTICUERPOS CONJUGADOS CON ENZIMAS

8 Anticuerpos Monoclonales (AcM) DEFINICIÓN Anticuerpos producidos por un mismo clon de Linfocito B. Reconocen la misma región (determinante antigénico) de un antígeno en concreto

9 Inmunización de un ratón para inducir la producción de Ac específicos. Disgregación del bazo y obtención de Linfocitos B. Producción de AcM (I) FUSIÓN Proliferación indefinida Crecimiento de células de mieloma en cultivo tisular HIBRIDOMAS

10 Producción de AcM (II) AISLAMIENTO DE HIBRIDOMAS Corta vida media en cultivo Deficientes en HGPRT: sintetiza Purinas a partir de Hipoxantina MEZCLA Cultivo en medio HAT (hipoxantina/ aminopterina/ timidina) HIBRIDOMAS

11 Producción de AcM (III) SELECCIÓN DE HIBRIDOMAS HIBRIDOMAS Diluciones hasta obtener colonias que produzcan un solo tipo de anticuerpo monoclonal Análisis de los Anticuerpos producidos por cada colonia (ELISA) Clonaje de los HIBRIDOMAS productores de anticuerpos

12 Producción de AcM (IV) FASE DE PRODUCCIÓN DE LOS AcM In vivo PURIFICACIÓN HIBRIDOMAS In vitro

13 Ventajas de los de los AcM vs Policlonales Mayor homogeneidad Reproducibilidad de sus efectos, como consecuencia de su homogeneidad Mayor capacidad potencial para seleccionar los de mejor afinidad. Mayor especificidad, puesto que todos reconocen la misma región del antígeno.

14 Aplicaciones de los AcM DIAGNÓSTICO Detección de hormonas, vitaminas y citoquinas. Monitorización de drogas Detección de enfermedades infecciosas Detección de alergenos, marcadores tumorales, etc. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ELISA. Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia BIOSENSORES Detección y cuantificación de moléculas orgánicas o inorgánicas: metales pesados, gases tóxicos, etc. TRATAMIENTO Enfermedades infecciosas Enfermedades autoinmunes Cáncer Transplantes para evitar rechazo

15 Aplicaciones en el análisis de alérgenos Qué se necesita para monitorizar alergenos? Los métodos de detección de los alergenos relevantes tienen que ser SENSIBLES Debes ser capaces de analizar un AMPLIO RANGO DE MATRICES complejas Permitir que la industria lleve a cabo el Control de Calidad de forma interna - Método SENCILLO, RÁPIDO Y ROBUSTO

16 Aplicaciones en el análisis de alergenos PROTEÍNAS DIANA (Características) Alta capacidad alergénica Térmicamente estables Representativas del total de contenido proteico del alimento Se necesitan ensayos sensibles y de alta especificidad: ELISA

17 Especificidad de los ensayos (I) GLUTEN Specificidad: QQPFP (epítopo tóxico) que se encuentra altamente repetido en gliadinas, secalinas y hordeinas.

18 Especificidad de los ensayos (II) LECHE Casein Residue (Alpha S1 y Alpha S2) β-lactoglobulina SOJA Inhibidor de Tripsina de Soja Proteína de harina de Soja HUEVO Ovoalbúmina (presente en un 54%) Ovomucoide (presente en un 11%) CACAHUETE Ara h1 (en cacahuetes no procesados) Ara h2 (muy estable al calor) CRUSTÁCEOS Tropomiosina (representa >20% de las proteínas de los crustáceos ya cocinados)

19 Especificidad de los ensayos (III) AVELLANA Varias proteínas de avellana identificadas por tratamiento a altas Tª ALMENDRA Varias proteínas de almendra identificadas por tratamiento a altas Tª SÉSAMO Albúmina 2S presente en la semilla de sésamo MOSTAZA Proteína de Semilla de Mostaza Blanca y Mostaza Negra

20 Sensibilidad de los ensayos Gluten Crustáceo Huevo Cacahuete Soja Almendra Avellana ALERGENO Leche (β-lactoglobulina) Leche (caseína) Semilla de sésamo Semilla de Mostaza LÍMITE DE DETECCIÓN (ppm) 3.0 (1,5 de gliadinas) (Leche en polvo) ó 0.27 (Caseína)

21 Un caso práctico: el análisis de GLUTEN GLUTEN BASADO EN EL ANTICUERPO MONOCLONAL R5 Isotipo: IgG 2b murino Exigido por la FACE, SMAP y Asociaciones Europeas de Celiacos Método Tipo I: I: por la Comisión del CODEX ALIMENTARIUS.

22 ANÁLISIS: Fundamento Técnico PLACAS TAPIZADAS CON EL AcM R5 AÑADIR CONTROLES Y MUESTRAS INCUBAR 1H A TA LAVAR LA PLACA 5 VECES AÑADIR EL CONJUGADO INCUBAR 1H A TA LAVAR LA PLACA 5 VECES AÑADIR SUBS (10 MIN) Y SOLUCIÓN DE FRENADO NEGATIVO POSITIVO

23 ANÁLISIS: Interpretación de Resultados Curva con 5 puntos (ng/ml) ng/ml y = 15,154x 2-6,4417x + 2,4497 R 2 = 0,9974 1,56 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 25 Abs 450nm Obtención de los resultados en ppm de gluten C : concentración de la muestra (en ng/ml) calculada a partir de la curva de calibración. ppm=(c x D x 2 x 40) / 1000 D : Factor de dilución de la muestra (25,50,100,etc) 2 : Factor aplicado para expresar los resultados en concentración de gluten. 40: Factor de dilución aplicado durante la preparación de la muestra (0.25g en 10 ml de buffer de extracción) : conversión de ng/ml a ppm

24 Reproducibilidad (I) CONTROL DE CALIDAD INTRA LOTE VC (σ/avg) CV INTRAPLACA CV INTERPLACA CV DÍA A DÍA CV PERSONA A PERSONA CV INTRA EXTRACCIÓN CV INTER EXTRACCIÓN 3,4 % 3,8 % 7,1 % 6,9 % 5,5 % 8,1 %

25 Reproducibilidad (II) REPRODUCIBILIDAD INTER LOTE Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Theorics Batch 1 Mean Batch 2 Mean Batch 3 Mean Mean S. DEV V.C. 9,5 8,1 1,6 9,6 7

26 Robustez 100% 80% 60% 40% 20% 0% -20% -11% 16% 11% 1% 1-1,2% 2-2,4% 3 Sample w ith500 ppm Sample w ith 200 ppm MUESTRA +20 min. CONJUGADO +20 min. SUBSTRATO +10 min.

27 Aplicación de AcM en el análisis de Micotoxinas Qué son las Micotoxinas? Metabolitos secundarios (tóxicos) de los hongos Producidos en una gran variedad de productos/mercancías Presentes en todo el mundo

28 Distribución de Micotoxinas a nivel Mundial

29 Tipos de Micotoxinas DON AFLATOXINAS FUMONISINA OCRATOXINA A ZEARALENONA ALIMENTO Grano Pienso, maíz, nueces, frutos secos y leche Maíz Maíz, uvas, café Grano HONGO Varias especies de Fusarium Aspergillus spp Fusarium verticilliodes Pencicillium verrucosum & Aspergillus ochraceous Fusarium graminearum CONDICIONES EN LAS QUE SE GENERA Temperaturas suaves y humedad Calor y ambiente seco Humedad durante la cosecha Clima templado y humedad Temperaturas suaves RIESGOS PARA LA SALUD Inmunosupresivo Desórdenes sanguíneos y de la piel Hemorragias internas Cáncer Daños en hígado y riñón Carcinogénico Daños en hígado, riñón y pulmones Carcinogénico Daños en hígado y riñón Teratogénico Carcinogénico Edema en cerebro y pulmones Daño en hígado, bazo y riñones

30 Dificultades en el análisis de Micotoxinas Muy estables a tratamientos físicos Bajos niveles de contaminación Distintos tipos de micotoxinas Distribución muy heterogénea en la muestra IMPORTANCIA DE UN CORRECTO MUESTREO Y EXTRACCIÓN

31 Análisis de Micotoxinas mediante uso de AcM ELISA DE COMPETICIÓN PLACA TAPIZADA CON AcM ADICIÓN DE MUESTRA Y CONJUGADO INCUBACIÓN LAVADO ADICION DE SUSTRATO Y SOLUCIÓN DE FRENADO NEGATIVO POSITIVO

32 Interpretación de resultados Cálculo del % de Absorbancia Máxima de Estándares y Muestras DO (Estándar/Muestra) % Abs Máx. = x 100 DO (Control Negativo) Representación de la Curva Estándar 100 Fumonisins 75 % Max Conc. (ppm )

33 Regulación por la Unión Europea La Unión Europea tiene actualmente los Límites más estrictos a nivel mundial DON (ppb) AFLA TOT (ppb) AFLA B 1 (ppb) AFLA M 1 (ppb) ZEARAL (ppb) FUMON (ppb) LÍM DETECC. DEL ENSAYO RANGO DE CUANTIFIC REGULACIÓN UE (*) (*) Los Límites varían en función del alimento. El Límite más estricto suele coincidir con el correspondiente al de los alimentos infantiles

34 Conclusión El uso de Anticuerpos (Monoclonales) en el diseño de ensayos ELISA para el análisis de alergenos y micotoxinas les confiere unas propiedades de sensibilidad y especificidad que hace que sean los más utilizados tanto por Laboratorios Especializados como por Empresas Agroalimentarias.

35 GRACIAS POR SU ATENCIÓN