TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO

Transcripción

1 CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO EL SÍNDROME X FRÁGIL CURSO Nº 5

2 I.S.S.N Título: Taller del Laboratorio Clínico Editor: Asociación Española de Biopatología Médica Maquetación: AEBM Fecha de Distribución: Marzo 2008

3 SÍNDROME X FRÁGIL Natalia Casasola Luna. -Química interna residente R4. Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Universitario De La Princesa. Madrid. Concepción Alonso Cerezo.- Facultativo Especialista de Área. Unidad de Genética. Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Universitario De La Princesa. Madrid 1. EL SÍNDROME X FRÁGIL El síndrome del cromosoma X frágil (SXF) [OMIM ] explica aproximadamente la mitad de casos de retraso mental ligado al cromosoma X, siendo la segunda causa de retraso mental tras la trisomía 21 o síndrome de Down. Su prevalencia se estima en uno de cada 4000 varones y una de cada 8000 mujeres. En el caso de mujeres portadoras, se realizó un estudio en Canadá que establecía la prevalencia en una de cada 259 mujeres. Estudios posteriores fijaron que en el caso de hombres portadores la prevalencia era de 1/760. (1,2,3) Se transmite de forma dominante ligado al cromosoma X, con penetrancia incompleta (80% de los varones presentan retraso mental y sólo el 30% de las mujeres) y expresividad variable (diferente expresión clínica). (4) Se caracteriza por retraso mental, macroorquidia postpuberal y características faciales típicas como cara alargada, orejas grandes y mandíbula inferior prominente. Se describe por primera vez en 1943 por Martin y Bell como una alteración mental ligada al sexo (5). La correlación con una alteración citogenética fue descrita en

4 por Lubs, que identificó un cromosoma X marcador en diversos varones afectados, cuyas células había cultivado en un medio pobre en ácido fólico (6). En aquel momento, el marcador se definió como un pequeño satélite separado del final del brazo largo del cromosoma X por una constricción del material genético. En 1977, Sutherland publica que la manifestación del lugar frágil en el cariotipo depende del medio de cultivo. (7) En 1991, varios grupos identificaron el gen responsable. El síndrome X frágil está causado en más del 99% de los casos por expansiones de una secuencia repetida CGG (citosina-guanina-guanina) localizada en la zona no traducida de la región promotora (exón 1) del gen FMR1 (Fragile X Mental Retardation) y que es variable en la población. (8,9) El gen FMR1 codifica la proteína FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein), que se encuentra muy disminuida o ausente en los individuos afectos. La FMRP es una proteína ubicuitaria, intracitoplasmática, que se expresa en diferentes tejidos, pero que es más abundante en las neuronas. Su función es el transporte del ARN y de otras proteínas desde el núcleo de la célula al citoplasma. Su ausencia pueda afectar al funcionamiento de diversas proteínas, lo que se traduce en la variabilidad de las manifestaciones fenotípicas. (10) 2. BASES GENÉTICAS El gen FMR1 está situado en el locus Xq27.3, en la región FRAXA. Ocupa 38 Kb del DNA genómico y está formado por 17 exones y 16 intrones, con una secuencia repetitiva CGG en el extremo 5 del primer exón. (11) 70

5 La secuencia genética relacionada con el síndrome X frágil puede presentarse de cuatro formas o estados principales: normal, zona gris o intermedia, premutación y mutación completa, dependiendo del número de repeticiones CGG que contenga. (Tabla 1) ESTADO Nº REPETICIONES NORMAL 5-40 INTERMEDIA o ZONA GRIS PREMUTACION MUTACION COMPLETA >200 Tabla 1. Categorías de los alelos dependiendo del nº de repeticiones (11,31) La zona de repeticiones de tripletes CGG es polimórfica en la población, distribuyéndose según una curva de Gauss con extremos entre 5 y 40 tripletes, siendo los alelos de 29 y 30 repeticiones los más frecuentes. No existe consenso sobre los límites de la llamada zona gris. Históricamente, el límite superior se fijaba en 54, considerando el intervalo como potenciales premutaciones. Al no existir ningún caso publicado de expansión de tripletes por debajo de 58, parece que podría incluirse este intervalo en la zona intermedia. 71

6 Una expansión del triplete entre 59 y 200 repeticiones implica un estado de premutación. Estos alelos contienen repeticiones relativamente largas que en general se transmiten de forma inestable de padres a hijos. Los individuos con premutación pueden presentar algunos rasgos clínicos. Finalmente, por encima de 200 repeticiones nos encontramos ante una mutación completa. Los individuos con mutación completa presentan la clínica del síndrome X frágil, y suelen tener de varios cientos a varios miles de repeticiones CGG. El tamaño de la expansión no está asociado con la severidad de la clínica. (13) Cuando existe alguna alteración, la secuencia repetitiva CGG es muy inestable y tiende a expandirse de una generación a la siguiente según el fenómeno de anticipación, lo que implica que un individuo con una premutación (portador) puede tener descendencia con la mutación completa. La tendencia de la expansión a aumentar depende de la estabilidad o inestabilidad que presente el fragmento CGG en la segregación de padres a hijos. Así, un fragmento estable será aquel que no aumenta su tamaño al pasar a la generación filial. Por la misma razón, un fragmento inestable será el que varía su número de repeticiones CGG en la transmisión de padres a hijos. La presencia de interrupciones AGG dentro de la secuencia repetida CGG confiere estabilidad al alelo normal. Así, los alelos más estables serán aquellos que presenten interrupciones AGG cada 9-10 repeticiones CGG. Las expansiones del fragmento CGG por encima de las 200 repeticiones producen una metilación de la isla CpG adyacente, con un silenciamiento en la expresión del 72

7 gen y en consecuencia una alteración en el nivel de codificación de la proteína, cuya ausencia se traduce en el fenotipo X frágil. La función de esta proteína no se conoce con exactitud, pero se sabe que tiene dominios muy conservados de unión a RNA y que se expresa en casi todos los tejidos, aunque más abundantemente en el cerebro. La metilación es un factor clave en este síndrome. En las premutaciones, la isla CpG del promotor no se encuentra metilada. No se conoce el mecanismo de la metilación de novo del promotor como consecuencia de la expansión de los tripletes por encima de unos 200, pero se propone que las estructuras en horquilla que forman las secuencias largas de CGG constituyen buenos sustratos para la metilación. También se especula con un mecanismo defensivo para mantener en silencio el DNA repetitivo. (14,15) Menos del 1% de los individuos con síndrome X frágil presentan otras alteraciones del gen FMR1 diferentes a la expansión, que incluyen deleciones y mutaciones puntuales. La existencia de individuos afectos con deleciones del gen FMR1 ha confirmado que la causa del síndrome es la falta de expresión del gen FMR1, y por tanto la ausencia de proteína FMRP. Es importante realizar el diagnóstico diferencial con un segundo locus frágil denominado FRAXE en la región Xq28, en el que existe una expansión de un triplete CGG en el gen FMR2, que da lugar a un retraso mental menos grave que el de la región FRAXA. (16) 73

8 3. CLÍNICA 3.1. Varones con mutación completa El hallazgo fundamental de síndrome de X frágil es el retraso mental, que en los varones afectados es de grado moderado. Las manifestaciones neurológicas son múltiples, incluyendo trastornos del desarrollo, de conducta, en la integración sensorial o del sueño y epilepsia. Los hallazgos clínicos en los varones con mutación completa varían en relación a la edad y al estadio puberal. En los primeros años de la vida se manifiesta por hiperactividad y retraso en la adquisición de las funciones psicomotoras, especialmente el lenguaje, que posteriormente es repetitivo. En edad preescolar pueden no ser evidentes los rasgos físicos que se manifiestan en edades posteriores, como la cara alargada, frente prominente, pabellones auriculares grandes y macrognatia. Los varones prepuberales suelen tener un crecimiento normal, excepto su perímetro cefálico, que está por encima del percentil 50. En varones puberales es característico el macroorquidismo. Con la edad también se hacen evidentes alteraciones oftalmológicas, osteoarticulares, otorrinolaringológicas y cardiológicas, debidas a la displasia del tejido conectivo. 74

9 3.2. Mujeres con mutación completa En cuanto a mujeres portadoras de mutación completa en heterocigosis, existen casos de niñas con fenotipo semejante a los niños, pero son raros. Lo más frecuente es que no haya ningún rasgo físico característico, y que se manifieste sólo un ligero retraso mental, con trastornos de conducta (aislamiento, angustia social, timidez) y con problemas sobre todo en el área del lenguaje y de las matemáticas. (10) 3.3. Hombres con premutación La presencia de la premutación del gen FMR1 en hombres se relaciona con el síndrome de ataxia/temblor asociado a X frágil (Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome, FXTAS), que se caracteriza por su aparición tardía, ataxia cerebelar progresiva y temblor. Otros hallazgos neurológicos son pérdidas de memoria a corto plazo, déficit en la función motora, descenso cognitivo, Parkinson, neuropatía periférica y debilidad muscular. (17) La penetrancia está relacionada con la edad; los síntomas aparecen en el 17% de los varones entre años, en el 38% de varones entre años, en el 47% entre años y en el 75% a partir de los 80 años. (3) 3.4. Mujeres con premutación En mujeres premutadas, la disfunción endocrina es el fallo ovárico prematuro (FOP), con menopausia precoz, antes de los 40 años. (18) 75

10 En la actualidad no existe consenso en la estimación del riesgo absoluto de FOP cuando una mujer es portadora de una premutación. Una revisión del 2005 concluye que el riesgo de FOP es del 21% (estudios previos daban valores entre 15 y 27%) en las mujeres premutadas mientras que se establece un riesgo del 1% para la población general. (1,3) Sin embargo, cuando se estudia a mujeres portadoras de mutación completa, no se observa la relación del FOP con el síndrome X frágil. Por el momento se desconoce la razón de la asociación existente entre la premutación en el gen FMR1 y el fallo ovárico precoz. Se debe informar a toda mujer portadora de la premutación de que tiene una probabilidad superior a la población general de tener menopausia antes de los 40 años, y por lo tanto su edad reproductiva podría finalizar prematuramente y debería programar su descendencia antes de los años. (19) Por otro lado, algunas mujeres con premutación pueden también desarrollar ataxia y temblor, similar a los hombres portadores de premutación. 4. DIAGNÓSTICO El diagnóstico de este síndrome se realiza por la clínica y por métodos citogenéticos y moleculares. (20) El American College of Medical Genetics recomienda realizar un estudio genético del síndrome X frágil en los siguientes casos: (1) 76

11 a) Individuos de ambos sexos con retraso mental, retraso en el desarrollo o autismo, especialmente si tienen (1) cualquier característica física o del comportamiento típica del síndrome X frágil, (2) historia familiar de X frágil, o (3) familiares con retraso mental no diagnosticado. b) Individuos que acuden a consejo genético con una historia familiar de (1) síndrome X frágil o (2) retraso mental no diagnosticado, y que desean tener descendencia. c) Fetos de madres portadoras conocidas. d) Individuos afectos o sus familiares con un estudio citogenético previo con resultado positivo CITOGENÉTICA Consiste en la detección de la fragilidad del cromosoma X en la banda q27.3, empleando cultivos de linfocitos en medios deficientes en ácido fólico. La zona frágil se observa como una zona separada del final del brazo largo del cromosoma X por una constricción del material genético (Figura 1). Figura 1. Presencia del sitio frágil en el cromosoma X. No obstante, la fiabilidad del estudio citogenético se limita a los varones afectos, ya que en el caso de las mujeres existen muchos falsos negativos. 77

12 Actualmente no se acepta como método diagnóstico, si no va acompañado del estudio molecular DIAGNÓSTICO MOLECULAR A partir del descubrimiento del gen FMR1, se emplean métodos directos de diagnóstico molecular como el Southern blotting y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Diagnóstico por la técnica de Southern La técnica de Southern se basa en la digestión del DNA genómico con las enzimas de restricción adecuadas, la separación de los fragmentos por electroforesis en el gel de agarosa, la transferencia a una membrana de nylon y la hibridación con una sonda marcada. Después de hibridar con la sonda se obtiene en los individuos normales un fragmento de 5,2 Kb. En el caso de afectados y portadores la banda tendrá un tamaño superior a 5,2 Kb, pudiéndose determinar el tamaño de la amplificación. Esta técnica es capaz de determinar alelos en todos los rangos de expansión, pero no es posible realizar una medida exacta del tamaño, sino solamente una aproximación del mismo. Por otra parte, es importante conocer el estado de metilación de la isla CpG próxima a FRAXA que va a determinar en gran medida la expresión del gen FMR1 y por lo tanto la manifestación clínica del síndrome. Para conocer el estado de metilación de la isla CpG se hace una doble digestión en la que una de las enzimas de restricción 78

13 es sensible a la metilación. Los patrones obtenidos en cada caso se resumen en latabla 2. Paciente Nº bandas Tamaño Observaciones VARÓN NORMAL 1 2,8 Kb Cromosoma X normal VARÓN PREMUTADO 1 >2,8 Kb El incremento está relacionado con el tamaño de la premutación VARON CON MUTACIÓN 1 >5,2 Kb Cromosoma X con mutación y metilado MUJER NORMAL 2 2,8 Kb Cromosoma X activo (sin metilar) 5,2 Kb Cromosoma X inactivo (metilado) MUJER PREMUTADA Variable El alelo premutado suele repartirse al azar entre el X activo y el inactivo, por lo que suelen aparecer 4 bandas de intensidad variable MUJER CON MUTACIÓN 2 >5,2 Kb Cromosoma X con mutación y metilado 2,8 ó 5,2 Kb Dependiendo si el cromosoma X normal está metilado o no Tabla 2. Bandas obtenidas por Southern para cada tipo de paciente Es importante a la hora de valorar los datos de laboratorio conocer la frecuencia relativamente alta de patrones mosaicos en este síndrome, pudiendo aparecer en un mismo sujeto bandas de diferentes tamaños y estados de metilación. A pesar de ser el método de referencia, el Southern presenta dificultades técnicas que lo hacen muy largo y laborioso, y sus dificultades de interpretación requieren de profesionales expertos en el diagnóstico del síndrome X frágil. 79

14 Diagnóstico por reacción de cadena de la polimerasa (PCR) (21) Utilizando cebadores específicos, la técnica de la PCR permite amplificar la zona de los CGG y conocer con exactitud el número de tripletes, hasta un límite de unas 100 repeticiones. La determinación exacta del tamaño del fragmento amplificado debe realizarse con una electroforesis en gel de poliacrilamida y corriendo en paralelo con un marcador de tamaños o bien una muestra con un número conocido de CGG. Las condiciones de la PCR, la temperatura de cebamiento y el número de ciclos dependen de los cebadores y de la enzima que se vayan a utilizar. La principal limitación de la técnica de la PCR es que los alelos con un elevado número de repeticiones CGG son muy difíciles de amplificar y no lo consigue en aquellos alelos que están por encima de unas 100 o más repeticiones. De este modo, los alelos con la mutación completa podrían aparecer como falsos negativos, por lo que es necesario combinar el estudio de PCR con el análisis de Southern. Por esta razón, se recomienda la combinación de ambas técnicas para un correcto diagnóstico. En el caso de fetos femeninos en los que tanto por Southern como por PCR del triplete CGG presenten una sola banda, es necesario utilizar las técnicas de PCR de microsatélites cercanos. Es una técnica sencilla, sin problemas de amplificación y su visualización es muy clara. Puede diferenciar perfectamente aquellas mujeres heterocigotas cuyos alelos difieren en una sola repetición. Sin embargo, como 80

15 pueden existir recombinaciones, debe considerarse únicamente como una ayuda, y no como una técnica diagnóstica en sí misma Secuenciación Es necesario secuenciar el gen FMR1 en los individuos con síndrome X frágil en los que no se observa una expansión del triplete CGG, para la detección de posibles deleciones o mutaciones puntuales. Estos pacientes suponen menos de 1% del total ANÁLISIS DE LA PROTEÍNA FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) En 1995 se publicó la técnica para determinar la expresión de la proteína FMRP, mediante el análisis inmunohistoquímico en los linfocitos de la sangre periférica. A partir de este trabajo quedan abiertas nuevas vías de diagnóstico, valorando la expresión de la FMRP no sólo en sangre, sino en otros tejidos, y ayudando a un mejor conocimiento de la fisiopatología del síndrome.(22,23) La medida de la expresión de la proteína FMRP puede ser útil en el cribado de pacientes con retraso mental y en la caracterización de la producción celular de FMRP en individuos con fenotipo atípico. Se ha propuesto la utilización de la expresión de la proteína FMRP como potencial factor pronóstico de severidad de la enfermedad debido a la correlación observada entre esta magnitud y el fenotipo X frágil. (3,24) 81

16 5. DIAGNÓSTICO PRENATAL (25,26) El diagnóstico prenatal se realiza en células del líquido amniótico alrededor de la semana 15 de gestación o en las células de las vellosidades coriónicas entre las semanas 10 y 12 del embarazo. Las técnicas moleculares presentan algunas dificultades técnicas en el diagnóstico prenatal, como por ejemplo la frecuente ausencia de metilación en los tejidos extraembrionales, como son las vellosidades coriales. En caso de obtener un resultado ambiguo, habría que recurrir a la realización de la amniocentesis. La determinación previa del tamaño de los alelos de los padres es fundamental para la interpretación de los resultados: En el análisis con PCR de un feto varón, si se observa el alelo materno se predice un sujeto normal para ese locus. En el caso de un feto femenino, si los alelos de los padres tienen diferentes tamaños en los alelos, y ambos se encuentran en la muestra fetal, se corresponderá también con un sujeto normal. Si se observa sólo el cromosoma normal del padre el feto ha heredado el cromosoma X frágil, ya que el alelo materno no aparecería porque tiene un tamaño demasiado grande para ser observado por PCR. Cuando los padres comparten el tamaño del alelo normal, y sólo se observa una banda, ésta puede ser la del padre, y estaríamos ante un feto afecto, o puede deberse a un estado de homocigosis, y que la banda correspondiera tanto al alelo del padre como al de la madre, por lo que no estaría afectado. 82

17 Para analizar la existencia del posible alelo mutado habría que realizar el estudio por Southern. En el análisis molecular prenatal pueden darse dos situaciones comprometidas: cuando en un feto varón se detecta un número de repeticiones correspondientes a un estado de premutación, o en un feto femenino portador de una mutación completa, ya que en estos casos no se puede predecir si presentará o no retraso mental. En la actualidad es posible efectuar el diagnóstico preimplantacional. La técnica se basa en el estudio genético de embriones fecundados in vitro y la elección y transferencia al útero de aquellos que no estén afectados por la mutación ni la premutación. Otra opción es el diagnóstico preconcepcional, técnica diagnóstica basada en el estudio genético del óvulo antes de la fertilización y la posterior fecundación in vitro de los óvulos sanos. (19) 6. CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO La correlación entre el genotipo y el fenotipo se resume en la tabla 3. TIPO DE MUTACIONES DEL GEN FMR1 Tipo de mutación PREMUTACION MUTACION COMPLETA MOSAICISMO MOSAICISMO METILADO MUTACION COMPLETA NO METILADA Nº de (CGG)n >200 Variable >200 >200 Estado de metilación de gen FMR1 No metilado Completamente metilado Parcial Parcial No metilado 83

18 Fenotipo varones Fenotipo mujeres Usualmente no afectados. Riesgo de FXTAS Generalmente no afectadas. Riesgo de FOP y FXTAS 100% afectados 50% afectadas, 50% no afectadas 100% afectados pero con síntomas más leves que mutación completa 100% afectados pero con síntomas más leves que mutación completa Alto % de afectados Muy variable Muy variable Muy variable Tabla 3. Correlación entre genotipo y fenotipo (11,24,31) El término mosaicismo se aplica a la coexistencia de la premutación y la mutación completa en un mismo individuo. Se estima que la frecuencia de estos mosaicismos es del 15-20% de los individuos con mutaciones en FMR1. También hay mosaicos de metilación, en los que pacientes que presentan mutación completa tienen diferentes líneas celulares en las cuales el gen FMR1 está parcialmente metilado o incluso no metilado, y por tanto pueden tener algún grado de expresión de la proteína FMRP. Se ha propuesto que la metilación variable en el locus FRAXA es responsable de la diversidad fenotípica del síndrome. 7. CONSEJO GENÉTICO (3) 7.1. Padres de un paciente afecto - La madre de un individuo con mutación completa del gen FMR1 es portadora de una premutación o mutación completa. - En caso de una mujer con premutación, o bien su padre o bien su madre son portadores de premutación. 84

19 - En caso de un varón con premutación, su madre es portadora de un premutación 7.2. Hermanos de un paciente afecto El riesgo de los hermanos depende de su sexo, del sexo del progenitor portador y del tamaño del alelo expandido en el padre portador Descendencia de un individuo con mutación completa - Los varones con mutación completa tienen retraso mental y generalmente no se reproducen. - Las mujeres con mutación completa tienen aproximadamente un riesgo del 50% de tener retraso mental, dependiendo de la inactivación del cromosoma X. Tanto si presentan manifestaciones fenotípicas como si no, su descendencia tiene un riesgo del 50% de heredar la mutación completa Descendencia de un individuo con premutación - Los hombres portadores de premutación son considerados hombres transmisores. Todas sus hijas heredan la premutación y ninguno de sus hijos. Cuando la premutación es transmitida por el padre, se dan expansiones pequeñas en el número de repeticiones de trinucleótidos y no suelen ser mutaciones completas. - Las mujeres portadoras de premutación tienen un riesgo del 50% de transmitir un alelo anormal (premutación o mutación completa) en cada embarazo. El riesgo de que la premutación de la madre pase a mutación completa en su descendencia está relacionado con el tamaño del número de repeticiones CGG en la premutación y con 85

20 las interrupciones de la expansión de CGG por tripletes AGG ocasionales. Como la presencia de repeticiones AGG no se examina en los laboratorios clínicos, el riesgo se calcula únicamente en base al número de repeticiones CGG en la premutación de la madre. El riesgo oscila desde el 5,3% con repeticiones, el 31.1% con repeticiones, a cercano al 100% a partir de 100 repeticiones Descendencia de un individuo con un alelo en la zona intermedia La descendencia de un individuo de la zona gris puede tener una variación mínima en la zona de repetición (como por ejemplo el cambio de 1 ó 2 tripletes), y tienen un riesgo insignificante de estar afectados. Parece ser que los alelos con 50 a 58 repeticiones pueden ser de alguna forma más inestables que los de menos de 50 tripletes, por lo que teóricamente podrían convertirse en premutaciones en generaciones sucesivas. Por esto se establece un riesgo bajo pero algo mayor que la población general Otros familiares de un individuo afecto Se debe realizar el estudio genético a todas las personas de la familia potencialmente portadores. 8. TRATAMIENTO En la actualidad, el tratamiento médico que puede ofrecerse es sintomático, abordando los diferentes trastornos que presente cada caso. 86

21 La posibilidad de reactivar el gen se intuye como una forma de terapia para este síndrome, siempre que se encuentre el modo de hacerlo sin afectar otros genes inactivos fisiológicamente por metilación. (28) Las líneas de investigación actuales en el campo de la genética se centran en encontrar las vías de reactivación más efectivas así como en el estudio de la acción de la proteína FMRP, en vías de poder desarrollar una terapia génica. 87

22 BIBLIOGRAFÍA (1) Sherman S, Pletcher BA, Driscoll DA. Fragile X syndrome: Diagnostic and carrier testing. Genet Med 2005;7:584-7 (2) Rousseau F, Rouillard P, Morel ML, Khandijian EW, Morgan K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMR1 gene and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. Am J Hum Genet 1995; 57: (3) Robert A S, Jack C T. FMR1-Related Disorders. GeneTests: Medical Genetics Information Resource (database online). Copyright, University of Washington, Seattle Consulta el 15/05/2007. (4) Milá M. Genética del síndrome X frágil. I Jornada sobre el Síndrome X Frágil en la Comunidad de Madrid. Federación Española Síndrome X frágil. Madrid, (5) Martin JP, Bell J. A pedigree of mental defect showing sex-linkage. J Neurol Psychiatr 1943; 6:154-7 (6) Lubs HA. A marker X chromosome. Am J Hum Genet 1969; 21:231-4 (7) Sutherland GR. Fragile sites on human chromosomes. Demonstration of their dependence on the type of tissue culture medium. Science 1977; 265:197 (8) Rousseau F, Heitz D, Biancalana V, Blumenfeld S, et al. Direct diagnosis by DNA analysis of the fragile X syndrome of mental retardation. New Eng J Med 1991; 325: (9) Verkerk AJ, Pieretti M, Sutcliffe JS, Fu YH, Khul DPA, Pizzuti A et al. Identification of a gene (FMR1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell 1991; 65: (10) Tejada Mínguez MI. Genética y epidemiología del síndrome X frágil. I Jornada sobre el Síndrome X Frágil en La Rioja. Federación Española Síndrome X frágil. Logroño, (11) Pintado E, de Diego Y, Hmadcha A, Lucas M. El síndrome del cromosoma X frágil. En: Diagnóstico Molecular en Genética Médica. Comité de publicaciones de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. 1998; (12) Rousseau F, Heitz D, Tarleton J, Macpherson J, Malmgren H, Dahl N, et al. A multicenter study on genotype-phenotype correlations in the fragile X syndrome using direct diagnosis with probe StB12.3: the first 2,253 cases. Am J Hum Genet 1994; 55: (13) Glover G, Bernabé MJ, Carbonell P. Diagnóstico del síndrome X frágil. Rev Neurol 2001; 33(Supl 1):56-9 (14) Pintado E, Morón FJ. Metilación y expresión del gen FMR1. Rev Neurol 2001; 33(Supl 1):S57-S62 (15) Sutcliffe JS, Nelson DL, Zhang F, Pieretti M, Caskey CT, Saxe D, et al. DNA methylation represses FMR1 transcription in fragile X syndrome. Hum Mol Genet 1992; 1:

23 (16) López de Muniain A, Cobo AM, Poza JJ, Saenz A. Enfermedades por inestabilidad del ADN. Neurología 1995; 10(Supl1):12-19 (17) Hagerman PJ, Greco CM, Hagerman RJ. A cerebellar tremor/ataxia syndrome among fragile X premutation carriers. Cytogenet Genome Res. 2003;100: (18) Allingham DJ, Babel-Hirji R, Chitayat D, Holden JJ, Yang K, Lee C, et al. Fragile X premutation is a significant risk factor for premature ovarian failure: the international collaborative POF in fragile X study preliminary data. Am J Med Genet 1999; 83:322-5 (19) Mila M, Mallolas J. Síndrome del cromosoma X frágil: menopausia precoz. Diagnóstico preimplantacional y preconcepcional. Rev Neurol 2001; 33(Supl 1):S20-S23 (20) Oostra BA, Jacky PB, Brown WT, Rousseau F. Guidelines for the diagnosis of fragile X syndrome. National Fragile X Foundation. J Med Genet 1993; 30(5): (21) Durán M, Molina M, Fernández-Toral J, Martínez T, López-Aríztegui MA, Álvarez AI, et al. Diagnóstico molecular por reacción en cadena de la polimerasa del síndrome X frágil: aplicación en el protocolo diagnóstico en 50 familias en el norte de España. An Esp Pediatr 2001; 54:331-9 (22) Willemsem R, Mohkamsing S, De Vries B, Devys D, Van den Ouweland AM, Mandel JL, et al. Rapyd antibody test for fragilex syndrome. Lancet 1995; 345: (23) Ramos Fuentes FJ. Nuevos métodos de diagnóstico del síndrome X frágil: estudio de la FMRP en sangre y pelo. Rev Neurol 2001; 33(Supl 1):S9-S13 (24) Tassone F, Hagerman RJ, Ikle DN, Dyer PN, Lampe M, willemsen R, et al. FMRP expresión as a potencial prognostic indicador in fragile X síndrome. Am J Med Genet 1999; 84: (25) Tejada MI. La prevención del síndrome de X frágil mediante el diagnóstico prenatal genético: ventajas y aspectos controvertidos. Rev Neurol 2001; 33(Supl 1):S14-S19 (26) Sutherland GR, Gedeon A, Kornman L, Donnelly A, Byard RW, Mulley JC, et al. Prenatal diagnosis of fragile X syndrome by direct detection of the unstable DNA sequence. N Eng J Med 1991; 325: (27) Ramos Fuentes FJ. Avances en el síndrome de X frágil y otras enfermedades con anticipación genética. An Esp Pediatr 1994; 61:79-84 (28) Chiurazzi P, Neri G. Investigación terapéutica: reactivación del gen FMR1 causante del síndrome X frágil. Rev Neurol 2001; 33(Supl 1):S62-S65 (29) American College of Medical Genetics. Standards and guidelines for clinical genetics laboratories Edition. (30) Taylor AK. Test del ADN para el síndrome X frágil, guía para médicos y familias. En Ramos Fuentes FJ, ed. El síndrome X frágil. Material Educativo de la Fundación Nacional del X Frágil de Estado Unidos. Madrid. Ed. Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales 1999; p

24 (31) Lao-Villadóniga JI. Acercamiento diagnóstico y asesoramiento diagnóstico en el retraso mental. Rev Neurol 2001; 33(Supl 1):51-6 (32) Ferrando Lucas MT. Aspectos clínicos, diagnósticos y terapéuticos del síndrome X frágil. II Jornada sobre el Síndrome X Frágil en la Comunidad de Madrid. Federación Española Síndrome X frágil. Madrid, (33) Fragile X mental retardation syndrome. OMIM Online Mendelian Inheritance in Man. (34) FMR1 GENE. OMIM Online Mendelian Inheritance in Man. (35) Federación Española de Asociaciones del Síndrome X Frágil. 90

25