Memorias Convención Internacional de Salud Pública. Cuba Salud La Habana 3-7 de diciembre de 2012 ISBN

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1 CENTRO NACIONAL DE GENÉTICA MÉDICA ESTUDIO MOLECULAR DE LA FIBROSIS QUÍSTICA EN CUBA Autores: DraC. Teresa Collazo Mesa, Lic. Ixchel López Reyes, Lic. Laura González Benítez, Mrc. Yulia Clark Feotistova, Mrc. Yaixa Piloto Roque, Téc. Manuel Gómez Martínez, Téc Lidice Reyes Navarro y Dr. Fidel Rodríguez Cala. SÍNTESIS La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva frecuente en Cuba, con una incidencia de aproximadamente de 1 cada 5000 recién nacidos vivos, siendo considerada un problema de salud. Realizamos una investigación descriptiva entre los años 1987 y 2010, a lo largo de la cual aplicamos al diagnóstico molecular los progresos en el conocimiento descritos en este período. La localización del gen afectado en el cromosoma siete, y de los marcadores XV2C y KM19, nos permitieron el diagnóstico prenatal y de portadores en 59 familias afectadas por esta enfermedad, resultando informativas el 49% de ellas. Posteriormente con el descubrimiento del gen CFTR y de sus mutaciones, diseñamos una estrategia teniendo en cuenta el origen étnico de nuestra población; explorando las mutaciones F508del, G542X, R1162X, R553X y R334W, frecuentes en la población española, y la G A, descrita en gran proporción en la africana. Encontramos las siguientes frecuencias de estos cambios genéticos: 37.9 %, 6.9 %, 2.0 %, 2.2%, 5.2 % y 1.3 % respectivamente. La detección de estas mutaciones nos permitió identificar el 55.5 % de los cromosomas fibroquísticos; además de realizar un pesquisaje, utilizando las técnicas de cribaje Polimorfismo Conformacional de Simple Cadena (SSCP) y Electroforesis en gel de Gradiente Desnaturalizante (DGGE), que nos permitió la detección de otras 4 mutaciones, aumentando las posibilidades de diagnóstico prenatal y de portadores en las familias afectadas. INTRODUCCIÓN. La Fibrosis Quística (FQ) o Mucoviscidosis es una enfermedad hereditaria con patrón de herencia autosómico recesivo presenta la mayor prevalencia en caucásicos, aunque también afecta a otros grupos humanos (1). La incidencia en las poblaciones caucásicas es de 1 en 2000 a 3000 nacidos; en los Estados Unidos aparece en alrededor de 1 cada 2400 nacidos vivos de raza blanca y uno cada de raza negra y es rara entre los orientales (1). En Cuba se ha reportado una

2 incidencia de aproximadamente uno por cada 5000 recién nacidos vivos (2), por lo que es un problema de salud que nos afecta. La enfermedad se originó en una población genéticamente diferente a cualquier grupo europeo actual y se expandió por toda Europa en diferentes eventos cronológicos, los cuales son responsables de las diferentes frecuencias de las mutaciones en el viejo continente (3). La FQ fue reportada por primera vez en 1936 por Fanconi y colaboradores (6), en 1938 Anderson hace una descripción patológica y clínica comprensible de la misma (7). En el año 1949 Lowe y colaboradores definieron su modo de herencia, separándola del grupo de síndromes de mala absorción, donde hasta ese entonces se encontraba incluida (8). Se conoce como una enfermedad de las glándulas exocrinas que afecta principalmente los aparatos digestivo y respiratorio; cursa en las formas clínicas típicas con la siguiente tríada: enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia pancreática exocrina y cifras anormalmente altas de electrólitos en sudor. Otras manifestaciones incluyen cirrosis hepática, diabetes mellitus e infertilidad, ésta ultima especialmente en hombres; existen además formas oligosintomáticas con manifestaciones tardías en la adolescencia y la adultez (9). Inicialmente fue considerada como una enfermedad letal ya que la expectativa de vida era de menos de cinco años. El pronóstico ha mejorado considerablemente con una supervivencia media de 28,2 años para el sexo femenino y 30 años para el masculino (9). Tratamientos aun más recientes, que incluyen la utilización de agentes antinflamatorios y fisioterapias, pueden eventualmente, conducir a un mayor grado de longevidad que oscila alrededor de los 40 años de edad (10). El diagnóstico es ofrecido por los rasgos clínicos de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), infecciones pulmonares persistentes, particularmente, después de los primeros años de vida, por Pseudomona aeruginosa, íleo meconial, insuficiencia pancreática con trastornos en el crecimiento y desarrollo o historia familiar positiva. Este diagnóstico se confirma, en más del 99 % de los pacientes, por la medición de la concentración de iones cloruro y sodio en el sudor, que debe tener un valor mayor a 60 meq/l (con una cantidad de sudor de más de 100 mg) o por la presencia de mutaciones patológicas en ambos cromosomas siete, donde se halla el gen Regulador Transmembranal de la Fibrosis Quística (CFTR, del Inglés Cystic Fibrosis Transmembranal Regulator) (9).

3 El descubrimiento de marcadores polimórficos estrechamente ligados a la FQ, constituyó un importante avance que permitió llevar a cabo, de forma indirecta, la detección de portadores y el diagnóstico prenatal, con las limitaciones y riesgos que esta metodología implican. Es a partir del año 1989, tras el clonaje e identificación del gen y de su mutación principal F508del, que fue posible el desarrollo de técnicas de forma directa para detectar ésta y otras mutaciones (11). El gen de la FQ fue ubicado en el cromosoma 7, banda q 31.2, clonado en el año 1989 (11). Dicho gen presenta una longitud de 250 kilobases (kb) y contiene 27 exones, codificando para un ARN mensajero (ARNm) de 6.5 kb. Presenta tres marcadores altamente polimórficos intragénicos, todos tipo STR (del inglés Short Tandem Repeats) con secuencia repetitiva dinucleotídica, uno en el intrón ocho (secuencia GC) y los otros dos en el intrón 17b (secuencias TA y CA, respectivamente) (11). La proteína codificada por el gen CFTR es designada como el regulador de transmembrana de la FQ (CFTR del inglés cystic fibrosis transmembrane conductance regulador) que contiene 1480 aminoácidos con una masa molecular de aproximadamente daltons (Da) (9); y presenta dos dominios repetidos que atraviesan la membrana celular, seis veces cada uno. Parte de la región citoplasmática de CFTR se corresponde a un dominio de unión a ATP, el cual se encuentra también en la P-glicoproteína y en la familia de proteínas de unión a ATP. El tercer dominio (R), está implicado en la regulación de CFTR y tiene varios lugares de fosforilación para proteinkinasa A (PKA) (12). La proteína CFTR funciona como un canal de Cloro regulado por el AMP cíclico (13, 14). La principal mutación FQ es la deleción de tres pares de bases en el codón 508 de CFTR, la cual se denomina F508del y supone la pérdida de la fenilalanina correspondiente al mencionado codón (11). Los pacientes FQ que presentan esta enfermedad sufren limitaciones físicas y psicológicas, el tratamiento es prolongado y costoso ya que necesitan, con frecuencia, el uso de antibióticos e ingresos hospitalarios de larga duración. Por otra parte la familia sufre también, los padres sobre todo por el sentimiento de culpa, y el temor que los invade ante la posibilidad de futuros hijos afectados y porque presienten la muerte del enfermo. Por representar un problema de salud, nos propusimos en este trabajo caracterizar molecularmente la FQ en Cuba y definir la mejor estrategia posible para el diagnóstico a partir de la detección de las mutaciones más frecuentes en nuestra población, teniendo en cuenta el origen étnico de la misma y el estudio de marcadores moleculares que nos

4 permitirán brindarles a estas familias afectadas la posibilidad de diagnóstico prenatal y de portadores cuando lo necesiten. FUNDAMENTOS METODOLÓGICOS. Los pacientes fueron asesorados genéticamente y consintieron en participar en la investigación la cual se llevo a cabo de acuerdo a los principios éticos de la declaración de Helsinki. No implico ningún tipo de riesgo para los pacientes, por el contrario, si beneficios del asesoramiento genético, Se les explico el carácter confidencial del estudio (en caso de ser publicada no se dará a conocer nombres individuales). Fueron seleccionadas 153 muestras, teniendo en cuenta el criterio clínico y la prueba de electrolitos en sudor para el diagnóstico de Fibrosis Quística, estos pacientes fueron avalados por la Comisión Nacional de Fibrosis Quística. La extracción de ADN, se realizó por la técnica de precipitación salina descrito por Miller y colaboradores en 1980 (21). Para la detección de los polimorfismos XV2C y KM19, se realizó la amplificación de los fragmentos y el producto fue digerido con las enzimas de restricción Taq I (XV2C) y Pst I (KM19) y los fragmentos fueron separados en geles de agarosa al 2% y visualizados con bromuro de etidio en luz ultravioleta. Se determinó la informatividad de los marcadores y se construyeron los haplotipos, lo que aumenta la informatividad de los mismos (22). Se realizó la detección de las mutaciones más frecuentes reportadas en la población mundial, utilizando la técnica de amplificación refractaria de mutaciones específicas para las mutaciones (F508del, G542X, R1162X y N1303K) y para las mutaciones G A o 3120G A, R334W y R553X se amplificó la región afectada y se digirió el producto amplificado con las enzimas de restricción Bst NI, Hpa II y Hinc II respectivamente. Para todos los casos los fragmentos fueron separados en geles de agarosa al 2 y 3 % y visualizados con bromuro de etidio en luz ultravioleta (23-26). Por la técnica de Polimorfismo Conformacional de Simple cadena (SSCP) se analizaron los exones: 6a, 7,13a, 17a, 2, 4,6b, 19, 1,16, 22, 24, 13b y10 (32). Se realiza la reacción en cadena de la polimerasa de los exones y la electroforesis se realiza en geles de acrilamida comercial (GeneGel Excel 12.5/24 Kit). La visualización del ADN se realiza con tinción con plata (PlusOne DNA Silver Staining Kit). Utilizando la técnica de Electroforesis en Gel de Gradiente Desnaturalizante (DGGE) se estudiaron los exones: 11, 14b, 17b, 14a, 15, 20, 3, 12, 23, 21, 5, 8 y 18, se realiza la reacción en cadena de la

5 polimerasa (PCR) y la electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante y los fragmentos son visualizados con luz ultravioleta (33). En los exones donde se localizaron cambios, se procedió a la detección de las mutaciones y de los polimorfismos, utilizando la PCR y realizando electroforesis en geles de agarosa y acrilamida y visualizados los fragmentos posteriormente con luz ultravioleta (34-36). RESULTADOS Y DISCUSIÓN. En el caso de la FQ, el descubrimiento de marcadores polimórficos estrechamente ligados al gen de la enfermedad, constituye una importante etapa que permitió llevar a cabo de forma indirecta, la detección de portadores y el diagnóstico prenatal. Dos de estos marcadores XV2C y KM19 pertenecientes al locus D7S23, fueron localizados muy próximos al gen de la FQ y han sido objeto de numerosas investigaciones (37). Con el estudio indirecto de estos marcadores moleculares y realizando la construcción de los haplotipos correspondientes, el 49.15% del total de familias analizadas afectadas con un hijo previo con FQ, resultaron completamente informativas aproximadamente el 50 %, frente a un 10% que fueron no informativas (Tabla 1), lo que nos permite brindarle la posibilidad de diagnóstico prenatal y de portadores a aproximadamente la mitad de las familias afectadas. Tabla 1 Informatividad de los haplotipos (XV2C y KM19). Informatividad Haplotipos (XV2C/KM19) % Completamente informativas Parcialmente informativas No informativas Con el descubrimiento del gen y de las mutaciones más frecuentes, teniendo en cuenta el origen de nuestra población, buscamos en nuestros pacientes las mutaciones más frecuentes en España y Africa, encontrando los resultados que se muestran en la tabla 2. Table 2 Frequencia de las mutaciones de Fibrosis Quística en la población cubana (n =153) Mutation FQ # de alelos

6 % p.f508del a p.g542x a p.r334w b p.r553x c p.r1162x a c G > A d p.n1303k a 0 0 Total Como en la mayoría de las poblaciones estudiadas, la mutación F508del resulta ser la causa predominante hasta el momento que provoca esta enfermedad, la cual en la mayoría de los casos cursa con un cuadro clínico severo. Al igual que en la población española la segunda mutación más frecuente es la G542X, seguida por la mutación R334W con una frecuencia mucho más alta que en otras poblaciones (4,9 %), en la población española la frecuencia reportada es de 1,6 % (38), mientras que la frecuencia reportada en la población mundial es de 0,1 % (16). La mutación R553X cuya frecuencia reportada en el consorcio de Fibrosis Quística es de 1,5%, en la población española es de 0,34 % (29) y en nuestra muestra es de 2,6%, más frecuente que la reportada mundialmente, con excepción de la reportada en Chile, cuya incidencia es de 4,2 %, ellos explican las diferencias encontradas en la población chilena por una posible prevalencia de genes Indios-americanos a la población chilena (39). El estudio de estas 6 mutaciones nos permite caracterizar el 55,5 % de los cromosomas fibroquísticos en nuestra muestra, lo que demuestra la alta heterogeneidad de nuestra población. La población Argentina, al igual que las del sur de Europa, mostró ser altamente heterogénea para las mutaciones del gen CFTR. El estudio de F508del y 9 de las mutaciones reportadas como las más frecuentes, permitió detectar el 67% de los alelos mutado (27), en consecuencia, en sólo el 51% de los pacientes se identificaron ambos alelos mutados (genotipo completo). En resumen, los reportes copilados de diferentes poblaciones demuestran que hay fuertes diferencias en la distribución de las mutaciones CFTR en las diferentes poblaciones, la detección de las 24 mutaciones más comunes varía desde 50 % a 97 % (40). Para identificar las mutaciones en el resto de los cromosomas y ampliar las posibilidades diagnósticas realizamos un cribaje de mutaciones, para no secuenciar todo el gen CFTR, el cual tiene 27 exones, lo que resultaría muy costoso. Por lo que se hizo necesario que las muestras aún no caracterizadas fueron analizadas mediante las técnicas de DGGE y

7 SSCP que nos permitirán localizar las mutaciones en los diferentes exones y posteriormente identificarlas, de lo contrario no podríamos realizarles diagnóstico molecular a estas familias afectadas por FQ en las cuales no se conoce la causa de la enfermedad. Se identificaron dos pacientes portadores de la mutación I507del y tres patrones anómalos correspondientes a una mutación o polimorfismo aún no identificado, por lo que fue necesaria la secuenciación de estas muestras para la identificación del defecto. En el exón 4, fue detectada la mutación Y109C, frecuente en la población Suiza, la cual se encontró en un paciente heterocigótico para F508del, esta mutación no ha sido detectada en la población española (41). En el exón 13a se encontró la mutación 2183AA/G la cual provoca una terminación prematura del codón 38 en el exón 13, ha sido detectada en Canadá, Italia, Grecia, Bulgaria, Francia, Alemania, Turquía y España y se ha encontrado en heterocigosis con las mutaciones F508del, G542X, G1244E y G A y en todos estos casos cursa con un fenotipo severo (30). Otro cambio conformacional correspondió a la mutación A G, localizada en el exón 17b, provocando un RNAm con un nucleótido extra y por consiguiente una terminación prematura del codón de parada. De los 23 casos estudiados, solo en 6 fueron detectadas las dos mutaciones responsables de FQ en cada paciente, lo que no coincide con los resultados que se debían esperar, ya que con las técnicas de DGGE y SSCP esta reportado que son detectadas más del 90% de las mutaciones. El diagnóstico de FQ (42-48) se basa en el cuadro clínico multisistémico compatible con la enfermedad, junto con dos o más determinaciones de electrolitos en sudor, es una enfermedad con gran heterogeneidad clínica, las manifestaciones son múltiples (42, 49, 50), varían de un paciente a otro los síntomas y signos en su intensidad y en su evolución, aún en pacientes con el mismo genotipo y en una misma familia. En muchos casos es un diagnóstico difícil de concluir ya que el cuadro clínico respiratorio es similar al de otras afecciones y en nuestro país las enfermedades respiratorias son muy frecuentes y puede ser equivocado el diagnóstico. Un grupo de investigadores propusieron la necesidad de revisar el criterio diagnóstico para la FQ y el dilema de crear separación entre la FQ y otras enfermedades con mutaciones del gen CFTR (43), que condujo a una nueva clasificación, la cual fue presentada a la asociación internacional de FQ (51). Lo cual dio

8 paso a que la Comisión Nacional de Fibrosis Quística en Cuba realizara una reevaluación de todos los casos estudiados, después de este análisis por los especialistas pudimos constatar que de los 23 casos analizados por SSCP y DGGE, solo resultaron FQ los 6 casos antes mencionados, en los cuales fueron detectadas las dos mutaciones responsables, por lo que podemos decir que el estudio fue efectivo en todos los casos y ayudó a corroborar que había un sobre diagnóstico de FQ en el país. Conclusiones. 1. La FQ en Cuba, al igual que en la mayoría de los países estudiados es molecularmente muy heterogénea. 2. Estos resultados nos permiten confirmar que el estudio de los marcadores moleculares, son de gran importancia para el diagnóstico molecular de la FQ en nuestra población la cual es muy heterogénea y el estudio directo de todas las mutaciones resultaría imposible. 3. Para realizar el diagnóstico de FQ se debe seguir la misma estrategia llevada a cabo en este estudio: Detección de las mutaciones más frecuentes Estudio de los RFLP Pesquisaje utilizando SSCP y DGGE BIBLIOGRAFÍA. 1. Casals T. Epidemiología y patogénesis. En: Sociedad Científica de lucha contra la fibrosis quística, Manual de Fibrosis Quística 2003: Guerra D. Estudio Genético de Fibrosis Quística. Tesis de Doctor en Ciencias Médicas Morral N, Bertranpetit J, Estivill X, Nunes V,Casals T, Giménez J, et al. The origin of the major cystic fibrosis mutation (delta F508) in European populations. Nat Genet 1994; 7: Fanconi G, Uehlinger E, Knauer C. Das coeliakiersyndrom be: Angeborener zystischer páncreas fibromatose und bronkiektasien. Wien Med Wochenschr 1936; 86: Andersen DH. Cystic fibrosis of the pancreas and its relation to celiac disease. A clinical and pathological study. Am J Dis Child 1938; 56: Lowe CU, May CD, Reed SC. Fibrosis of the pancreas in infants and children: a SSCP statistical study of clinical and hereditary features. Am J Dis Child 1949; 78:

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