Caracterización molecular de deleciones y mutaciones de la región en pacientes con cardiopatías congénitas

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1 Caracterización molecular de deleciones y mutaciones de la región en pacientes con cardiopatías congénitas Molecular characterization of deletions and mutations of the 22qll region in patients with congenital heart diseases Torres L., Rosell J., Bernués M., Govea N., Gorreto L., García Algas F., De la Fuente Sánchez M. A., Heine Súñer D. RESUMEN La prevalencia de deleciones de novo en la región 22ql/ se ha estimado en 1/4.000 nacimientos, de los cuales un 75% presentan anomalías congénitas del corazón. La mayoría de los pacientes presentan la misma deleción de unas 3 Mb, pero su grado de afectación es muy variable y puede ir desde una cardiopatía congénita aislada a ndrome de Di George. Se han estudiado por hibridación in.sif~ fluorescente (FISH) un total de 59 pacientes con cardiopatías congénitas, de los cuales nueve presentaron la deleción (15%). A nivel molecular se ha caracterizado la región con 15 marcadores polimórficos con lo que se descartaron nuevas deleciones no detectadas por FISH y se acotaron las ya detectadas, presentando en todos los casos, la deleción mayoritaria en los pacientes de 3 Mb. Por otra parte, no se han encontrado mutaciones en el gen TBXI, que es uno de los candidatos a ser el causante de la cardiopatía congénita asociada a la región Palabras clave: Coniiopcrtícl cor7gér7itr7, delecih 22~111, TBXI. Caracterización molecular de deleclones y mutaciones de la región en pacientes con cardiopatías congénitas Torres L, Rosell J, Bernués M, Govea N, Gorreto L, García Algas F, De la Fuente Sánchez M A, Heine Súñer D Investipciór7 Cn~~lrovrr,sculn~, 2004; 7: HI92 ABSTRACT The prevalence of de novo deletions in the 229l l region has been estimated at l/4,000 births, of which 75% have congenital abnormalities of the heart. Most patients have the same deletion of approximately 3 Mb, but their degree of affectation is highly variable, and may range from isolated congemtal heart disease to Di George syndrome. A total of 59 patients with congenital heart disease, of whom nine had the deletion (15%). have been studied using fluorescent ir7 situ hybridization (FISH). At the molecular level, the region has been characterized using 15 polymorphic markers, as a result of which new deletions not detected by FISH were ruled out, and detected deletions were characterized. The most frequent 3 Mb deletion was found in all cases. On the other hand, no mutations were found in the TBXI gene, one of the candidates to be the cause of congenital heart disease associated to the 2291 I region. Key words: Cor7ger7itol hecrr1 clisec~se, cleletior7, TBXI. Molecular characterization of deletiom and mutatiom of the 229// region in patients with congenital heart diseases Torre\ L, Rosell J, Bernués M, Govea N, Gorreto L. García Algas F, De la Fuente Sánchez M A, Heine Súiier D Inwstigcrcirírl Crr~~liov~~,c~rltrr; 2004: 7: HI92 Correspondencia l correspondence: D. Heine Hospital Universitario Son Dureta Cl Andrea Doria, Palma de Mallorca dheine@hsd.es INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n. 1 81

2 L. Torres, J. Rosell, M. Bernués, eta/. INTRODUCCIÓN INTRODUCTION Las cardiopatías congénitas presentan una incidencia del 1% en recién nacidos y se corresponden con un 40% de todos los defectos congénitos. El 25% de las cardiopatías congénitas afectan al área conotruncal y el 1 l29% de estas, están causadas por deleciones en hemizigosis de la banda ll del brazo largo del cromosoma 22 (22977) (1). Estas cardiopatías congénitas causadas por deleciones en la región cromosómica forman parte de un cuadro sindrómico en que las manifestaciones más frecuentes además de una cardiopatía son: facies anormal, afectación tímica, afectación velofaríngea, hipocalcemia y retraso mental (ndrome depzq71). El fenotipo que presentan los pacientes de122qll es muy variable y abarca un amplio espectro de anomalías que va desde las formas más severas del denominado ndrome de DiGeorge (DGS), hasta cardiopatías congénitas aisladas, pasando por las formas intermedias del llamado ndrome velocardiofacial (VCFS). Un aspecto sorprendente, y aun no resuelto, es que el tamaño de la deleción no está relacionada con esta variación fenotípica, ya que la mayoría de los pacientes independientemente de su grado de afectación tienen la misma deleción de unas 3 Mb (2, 3). Esta ausencia de correlación genotipofenotipo viene remarcada por la observación de diferencias en los grados de afectación entre hermanos gemelos monozigóticos que son portadores de la deleción (4, 5). La prevalencia de deleciones en la región se ha estimado en 1/4.000 nacimientos y de estos un 75% presentan anomalías congénitas de corazón (6). Estas cardiopatías comprenden sobre todo defectos conotruncales y anomalías del arco aórtico como, por ejemplo, truncus arteriosus, tetralogía de Fallot, doble salida del ventrículo derecho, atresia pulmonar, transposición de los grandes vasos, o interrupción del arco aórtico tipo B. Además, se ha visto que una deleción 22qll en algunos casos puede causar cardiopatías congénitas que no son conotruncales ni defectos del arco aórtico, como por ejemplo comunicación interauricular (CIA) o CIV peri membranosa. Aunque la incidencia de deleciones en pacientes diagnosticados por una cardiopatía congénita conotruncal o del arco aórtico es entre el ll y 17%, la incidencia puede ser mucho mayor si atendemos al tipo de anomalía. La deleción está presente en un 50% de pacientes con interrupción del arco aórtico de tipo B, un 42% de pacientes con tetralogía de Fallot y atresia pulmonar, y un 64% de pacientes con tetralo Congenital heart diseases occur in 1% of newborns, and account for 40% of all congenital defects. Twentyfive percent of congenital heart diseases involve the conotruncal area, and 1 l29% of these are caused by deletions in hemizygosis of band ll of the long arm of chromosome 22 (22q Il ) (II. These congenital heart diseases caused by deletions in the chromosomal region 22q ll are patt of a syndrome in which the most common signs, in addition to heart disease, include abnormal facies, thymic involvement, velophatyngeal involvement, hypocalcemia and mental retardation (del22qll syndrome). The phenotype of del22q ll patients is highly variable and comprises a broad spectrum of abnormalities ranging from the more severe forms of the socalled Di George syndrome (DGSI to intermediate forms such as the socalled velocardiofacial syndrome (VCFS), and to isolated congenital heart diseases. A surprising and still unresolved issue is that the size of the deletion is not related to this phenotypic variation, since most patients have the same deletion of aproximately 3 megabases (Mb), regardless of their degree of involvement (2, 3). This lack of correlation between the genotype and phenotype is highlighted by the observation of differences in the degree of involvement between monozygous twins carrying the deletion (4, 5). The prevalence of deletions in the 22q ll region has been estimated at 1/4,000 births, of which 75% have congenital abnormalities of the heatt (6). These heart diseases particularly comprise conotruncal defects and aortic arch abnormalities such as truncus arteriosus, tetralogy of Fallot (TOF), dual right ventricular outlet, pulmonary atresia, transposition of major vessels, or type B interruption of the aortic arch. It has also been noted that a 229 ll deletion may cause ín some cases congenital heart diseases that are neither conotruncal nor aortic arch defects, such as interatrial communication (IAC) or perimembranous interventricular communication WC). Although the incidence of deletions ín patients diagnosed with conotruncal or aottic arch congenital heart disease ranges from ll 17%, the incidence may be much greater when considering the type of abnormality. The deletion is present in 50% of patients with type B interruption of the aortic arch, in 42% of 82 INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n. 1

3 Estudio de la región 22q11 en pacientes con cardiopatías Study of the 22qll region in patients with congenital gía de Fallot con ausencia de válvula pulmonar (2). Todos estos datos hacen que hoy en día sea conveniente una determinación de la posible deleción en la región 22qll en las cardiopatías conotruncales (truncus arteriosus, ventrículo derecho de doble salida, tetralogía de Fallot, agenesia de válvula pulmonar, atresia pulmonar con CIV, CIV conoseptal y transposición de las grandes arterias), en los defectos del arco aórtico (interrupción del istmo aórtico, origen aórtico de la arteria pulmonar derecha o izquierda, arco aórtico derecho aislado, doble arco aórtico y origen anómalo de los vasos del arco aórtico) y cualquier cardiopatía que curse con alguna otra manifestación fenotípica del ndrome de 22qll. Muchos de los tejidos y estructuras afectados en los pacientes con de/zí qll derivan de los arcos y sacos faríngeos del embrión, los cuales junto a células de la cresta neural que migran a su interior, participan en la formación de la región craneofacial, el cuello y la región conotruncal del corazón. Estas observaciones han originado la propuesta de que las anomalías observadas en pacientes con deleción son debidos a una migración anómala de las células de la cresta neural en los primeros estadios del desarrollo embrionario o a un desarrollo anormal de los arcos y sacos faríngeos (3). Estas hipótesis conllevan que en la región se hallen un gen o genes que regulen el desarrollo de estas estructuras embrionarias y de que este gen o genes tienen que ser dosisdependientes, ya que la hemizigosis es suficiente para producir el fenotipo del22qll. En un intento de determinar los genes que causan el ndrome de122qll varios grupos han caracterizado a nivel molecular el tamaño de las deleciones en individuos que presentan dicha patología. Estudios de pacientes con de122qll han determinado que mas del 90% de estos tenían una deleción similar de unas 3 Mb. El resto de pacientes se dividen en dos grupos unos que tienen una deleción menor de 1,5 Mb que solapa completamente con la de 3 Mb y otros que tienen deleciones con un tamaño variable y que puede o no solapar con las de 1,5 y 3 Mb. Se han localizado dentro de la regiones delecionadas más de 30 genes, y aunque todavía no está del todo claro cuáles de estos son los causantes del fenotipo que presenta la patología, la posibilidad de que haya un sólo gen o elemento responsable es remota ya que pacientes con el mismo tamaño de deleción pueden presentar fenotipos muy distintos y pacientes con fenotipos parecidos pueden ser portadores de deleciones que no solapan entre (7, 8) (Figura IL patients with tetralogy of Fallot and pulmonary atresia, and in 64% of patients with tetralogy of Fallot with absence of the pulmonary valve (2). All these data suggest the conveniente to establish if a deletion exists in the 22qll region in conotruncal heart diseases (truncus arteriosus, dual right ventricular outlet, tetralogy of Fallot, pulmonary valve agenesis, pulmonary atresia with WC, conoseptal WC and transposition of major arteries), aortic arch defects (interruption of the aortic isthmus, an aortic origin in the right or left pulmonary artery, isolated right aortic arch, dual aortic arch, and abnormal origin of the aortic arch vesseis), and any heatt disease presenting some other phenotypic manifestation of del22q ll syndrome. Many of the tissues and structures involved in patients with 22qll deletion are derived from the pharyngeal arches and pouches of the embryo, which together with the neural crest cells migrating inside them participate in the formation of the craniofacial region, neck and conotruncal region of the heart. These observations have led to the suggestion that the abnormalíties seen in patíents with 22q Il deletion are due to an abnormal migration of the neural crest cells in the early stages of embtyonic development, or to an abnormal development of the pharyngeal arches and pouches (3). These hypotheses imply that the 229 ll region contains a gene(s) regulating the development of these embryonic structures, and that this gene(s) must be dosedependent, since hemizygos suffices to cause the del22qll phenotype. In an attempt to determine which genes cause the del22qll syndrome, severa/ research groups have characterized at molecular level the size of the deletions found in patients with such pathology. Studies in patients with del22qll have established that over 90% had a similar deletion of approximately 3 Mb. The rest of patients are divided into two groups: one showing a deletion of less than 1.5 Mb and which completely overlaps the 3 Mb deletion, and another group with deletions of a varying size that may or may not overlap with the 1.5 and 3 Mb deletions. More than 30 genes have been located within the deleted regions, and while it is still not fully clear which of them are responsible for the phenotype of this pathology, the possibility of a single culprit gene or element is remote, since patients with the same deletion size can exhibit very different phenotypes, while patients with similar phenotypes may carty deletions that do not mutually overlap (7, 8) (Figure 1). INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; WI. 7, n. 1 83

4 L. Torres, J. Rosell, M. Bernués, et al. Figura 1. Mapa esquemático de la región 22qll en las que se muestran en rojo los LCR22s; en azul los tres genes candidatos; en negro marcadores polimórficos de microsatélite con su posición en el cromosoma indicado en megabases desde el centrómero; las barras horizontales indican las deleciones que han encontrado otros autores (8) en pacientes con el ndrome del22ql1, siendo la de 3 Mb la más frecuente Mb DELEClONES MOST COMMON MAS FRECUENTES DELETIONS DELECIONES ATíPICAS ATYPICAL DELETIONS m Low Copy Repeats (LCRs) / Low Copy Repeats (LCRsj Marcadores de microsatélite / Microsatelite markers Genes candidatos / Candidate genes Figure 1. Schematic map of the 229 ll region showing the LCR22s in red; the three candidate genes appear in blue; microsatellite polymorphic markers are shown in black, with their position in the chromosome indicated in megabases from the centromere; the horizontal bars indicate the deletions found by other authors (8) in patients with de122qll syndrome, the 3 Mb deletion being the most frequent. Recientemente, se han encontrado evidencias de la implicación de algunos de estos genes en el ndrome í í q1 7. Yamagishi y cols. (9) encontraron un paciente que tenía una deleción de 20 kb que únicamente afecta a dos genes: UFDIL y CDC45. Los autores propusieron que el gen UFDIL era un buen candidato ya que se expresa en los tejidos afectados y está regulado por un factor de transcripción implicado en el desarrollo de la cresta neural. La confirmación de que un gen es realmente responsable del fenotipo del ndrome de122qll solamente puede venir de la identificación de mutaciones en pacientes no portadores de la deleción 22qll pero que presentan un fenotipo similar al causado por este ndrome. Sin embargo, varios estudios en los que se han caracterizado un elevado número de pacientes no han encontrado mutación alguna en el gen UFDIL (10, ll 1. Más recientemente se han descrito otros dos buenos candidatos: el gen TBXI y el gen CRKL Evidente has recently been found of the implication of some of these genes in the 22qll syndrome. Yamagishi et al. (9) reported a patient with a 20 kb deletion only involving two genes: UFDl L and CDC45. The authors suggested that the UFDI L gene is a good candidate, since it is expressed in the involved tissues and is regulated by a transcription factor implicated in the development of the neural crest. Confirmation that a gene is actually responsible for the phenotype of del22qll syndrome can only be obtained by identifying mutations ín patients who do not carry the 22qll deletion but who have a phenotype similar to that produced by this syndrome. However, severa/ studies characterizing a large number of patients have found no mutations in the UFDI L gene (10, ll). More recently, two other good candidates have been described: the TBXI gene and the CRKL gene /12 15). It was found that when both these 84 INVESTIGACION CARDIOVASCULAR, 2004, val 7, n. 1

5 Estudio de la región í í q7 7 en pacientes con cardiopatías Study of the 22q ll region in patients with congenital (1215). Se ha visto en ambos que al ser mutados en ratones causan anomalías cardíacas similares a las observadas en pacientes delí Zq ll y que también ambos se expresan en los arcos y sacos faríngeos, aunque solamente el gen TM7 es capaz de causar los defectos observados en hemizigosis. Sin embargo, la confirmación de que estos genes son causantes de cardiopatía congénita está a la espera de la detección de mutaciones en pacientes no portadores de la deleción. genes were mutated in mice, they caused cardiac abnormalities similar to those seen in patients with 22qll deletion, and that both genes are also expressed in the phatyngeal arches and sacs, though only the TBXI gene is able to cause the defects seen under conditions of hemizygosis. However, the confirmation that these genes cause congenital heart disease requires the detection of mutations in patients who do not cany the deletion. Estudio clínico MATERIAL Y MÉTODOS Todos los afectados de cardiopatía congénita fueron remitidos por la Unidad de Cardiología Infantil a la Sección de Genética, donde se les realizó la exploración dismorfológica para obtener todos los datos clínicos de interés de cada paciente: época neonatal (peso, talla, perímetro craneal), somatometría en el momento de la exploración, desarrollo intelectual (trastornos de aprendizaje, de conducta, psiquiátricos), tipo de cardiopatía congénita conotruncal, área otorrinolaringológica (fisura palatina, insuficiencia velofaríngea, hipoacusia), anomalías genitourinarias (malformativa, obstructiva, criptorquidia, hipospadias), función hormonal paratiroidea (calcemia), enfermedades neurológicas (malformativas cerebrales, convulsiones), estado inmunológico (inmunodeficiencia, ausencia de timo), malformaciones esqueléticas (escoliosis, polidactilia, sindactilia, craneosinotosis). Clinical study MATERIAL AND METHODS All patients with congenital heart disease were referred by the Pediatric Cardiology Unit to the Genetics Section, where they underwent a dysmorphologic examination to obtain the clinical data of interest corresponding to each case: neonatal period (weight, height, cranial perimeter), somatometty at the time of examination, intellectual development (learning, behavioral or psychiatric disorders), type of conotruncal congenital heart disease, otolaryngological findings (cleft palate, velophatyngeal insufficiency, h ypoacusial, genitourinary abnormalities (malformations, obstructions, cryptorchidia, h ypospadias), parath yroid hormone function (calcemia), neurological diseases (brain malformations, seizures), immune status fimmune deficiency, th ymus gland agenesl, skeletal malformations (scoliosis, polydactylia, syndaciylia, creaneosynostosis). Estudio citogenético Cytogenetic study Se recogió muestra de sangre periférica de todos los pacientes con cardiopatía congénita remitidos a la Sección de Genética del Hospital Universitario Son Dureta. Estas sangres se sembraron y se realizó un cultivo de 72 horas estimulado con fitohemaglutinina para un posterior estudio citogenético mediante bandas G. La finalidad de este estudio era descartar tanto alteraciones estructurales como translocaciones que afecten a la banda 22qll o a otras regiones y cromosomas. Con la misma muestra obtenida del cultivo citogenético se procedió al estudio de hibridación in situ fluorescente (FISH) con una sonda específica de la zona que solapa con el gen TUPLEI Nysis). A sample of perípheral blood was drawn from all patients with congenital heart disease referred to the Genetics Section of Son Dureta University Hospital (Spain). The samples were seeded and cultured for 72 hours under phytohemagglutinin stimulation for a subsequent cytogenetic study using G bands. The purpose of this study was torule out both structural changes and translocations involving the 22q ll band or other regions and chromosomes. The same sample obtained from the cytogenetic culture was used for the fluorescent in situ hybridization (FISH) study using a specific probe for the 22q ll zone that overlaps with the TUPLEI gene (Vysisl. INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004: val. 7, II. 1 85

6 L. Torres, J. Rosell, M. Bernués, eta/. Estudio molecular para la caracterización y detección de las deleciones A partir de la sangre periférica recogida se procedió a la extracción del ADN genómico. En total, se han recogido ll 4 ADNs que corresponden a 38 familias distintas. Seguidamente, se empezó con la caracterización mediante el tipaje de 15 marcadores polimórficos de microsatélite: D22S420, D22S427, D22S94 1, D22S944, D2ZS264, D22S3 ll, D22S306, D22S 1638, D22S308, D22S 1623, D22S 1709, D22S 1648, D22S446, D22S539 y D22S686situados en la región 22qll. La metodología seguida para este tipaje fue la siguiente: Para cada muestra de ADN se realizó una PCR con cada uno de los primers para los marcadores polimórficos anteriores. Los productos obtenidos se corrieron en geles de acrilamida 6% desnaturalizantes (urea 6M) y seguidamente se procedió al revelado mediante tinción con nitrato de plata (Amersham Biosciences, Uppsala). Análisis molecular de mutaciones del gen TBXI Para el análisis de posibles mutaciones en el gen TBXI, el primer paso fue diseñar y sintetizar los primers para la amplificación por PCR de todos los exones codificantes del gen (exones 29A, 9B, 9C) basándonos en la secuencia del genoma humano que se halla en UCSC Genome Browser ( El análisis de mutaciones se hizo mediante la técnica de SSCP (Single Strand Conformation Polimorphism) para cada exón. Esta técnica consiste en desnaturalizar el producto de PCR (98 C a diez minutos) y correrlo en un gel de acrilamida (15%) no desnaturalizante (Amersham Biosciencesm, Uppsala) utilizando una unidad electroforética (GenePhor) que permite seleccionar las condiciones de temperatura más adecuadas para cada exón. Molecular study for characterization and detection of deletions Genomic DNA was extracted from the peripheral blood collected. A total of 114 DNAs corresponding to 38 different families were collected. Characterization was thenstarted by typing 15 microsatellite polymorphic markers: D22S420, D22S427, D22S941, D22S944, D22S264, D22S311, D22S306, D22S1638, D22S308, D22S1623, D22S1709, D22S1648, D22S446, D22S539 and D22S686 located in the 22qll region. The typing methodology was as follows: For each DNA sample, a polymerase chain reaction (PCRI was performed with each of the primers for the above polymorphic markers. The products obtained were run in denaturing 6% acrylamide gels (urea 6Ml and subsequently developed using silver nitrate staining (Amersham Biosciences, Uppsala). Molecular analysis of TBXI gene mutations For the analysis of potential mutations in the TBXI gene, the first step was to design and synthetize the primers for PCR amplification of all exons encoding for the gene (exons 29A, 9B, 90 based on the human genome sequence found in the UCSC Genome Browser ( Mutations were analyzed using the SSCP (Single Strand Conformation Polymorphísml techníque for each exon. This technique consists of denaturing the PCR product (98 C for ten minutes) and running it in a nondenaturing actylamide gel ( 15%) (Amersham Biosciences, Uppsalal using an electrophoretic unit (GenePhorl that allows selection of the most adequate temperature conditions for each exon. RESULTADOS Caracterización citogenética y molecular Se analizaron mediante hibridación in situ fluorescente un total de 59 pacientes con cardiopatía congénita, detectando la deleción en nueve individuos. De este modo se calcula que un 15% de pacientes con cardiopatías congénitas son portadores de la deleción La caracterización molecular de las deleciones se pudo realizar en 35 pacientes de los 59 estu RESUL TS Cytogenetic and molecular characterization A total of 59 patients with congenital heart disease were analyzed by fluorescent in situ hybridization (FISHI, and the deletion was detected in nine individuals. Therefore, it is estimated that 15% of patients with congenital heatt díscase carry the 22q ll deletion. The molecular characterization of the deletions could be made in 35 of the 59 patients studied by FISH (29 FISHnegative and 86 INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n. 1

7 Estudio de la región 22q77 en pacientes con cardiopatías Study of the 22qll region in patients with congenital diados por FISH (29 FISH negativos + 6 FISH positivos). Este tipaje se realizó con tres objetivos: detectar deleciones atípicas no solapantes con la sonda empleada en la hibridación in situ fluorescente, acotar el tamaño de las deleciones ya encontradas por FISH y averiguar el origen paterno del cromosoma 22 delecionado. Hemos visto que los pacientes estudiados mediante FISH y que son negativos para la deleción no son portadores de una deleción atípica. Además, se ha comprobado que todos los pacientes con deleción que pudimos estudiar eran portadores de la deleción más frecuente (3 Mb) y que en cuatro de ellos la deleción se había originado de novo. En cuanto al origen paterno de la deleción en estos cuatro, tres habían ocurrido en la línea germinal materna y sólo una en la paterna. 6 FISHpositie). This typing was carried out for three purposes: to detect atypical deletions nonoverlapping with the probe used in FISH to determine the size of the deletions already found by FISH, and to ascertain the parental origin of the deleted chromosome 22. We have seen that patients who test negative for the deletion in FISH do not carry an atypical deletion. It was also shown that all patients with the deletion and which we were able to study were carriers of the most frequent deletion (3 Mb), and in four of them the deletion had originated de novo. As to the parental origin of the deletion in these four patients, three had occurred in the maternal germ lite, as compared to only one in the paternal line. Análisis del gen TBX7 Se ha visto que mutaciones en el gen TBXI causan anomalías cardiológicas conotruncales en ratones, por lo que este gen se ha convertido en el principal candidato a ser el causante de la cardiopatía congénita asociada a la región Zí q11(12 14). El estudio de mutaciones en los exones del gen TBX7 en 35 pacientes con cardiopatía congénita y sin la deleción, ha puesto de manifiesto algunos cambios de base, los cuales se resumen en la Tabla 1. Todos ellos son polimorfismos que ya habían sido descritos como tales (161, o bien no provocan ningún cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante. Por lo tanto aparentemente ninguno de estos cambios de base son buenos candidatos a ser la causa de la cardiopatía en los pacientes no delecionados. Analysis of the TBXI gene It has been seen that mutations in the TBXI cause conotruncal cardiological abnormalities in mice, and this gene has therefore become the main candidate to be the cause of congenital heatt disease associated to the 22q ll region (12 14). The study of mutations in exons of the TBXI gene in 35 patients with congenital heatt disease lacking the deletion has demonstrated some base changes, which are summarized in Table 1. They all are polymorphisms already reported as such (16) or that induce no changes in the amino acid sequence of the resulting protein. Thus, none of these base changes appear to be good candidates as the cause of heart disease in patients without the deletion. TABLA 1. Polimorfismos observados en los distintos exones de TBX7 Exón Cambio Cambio de N. de de base aminoácido pacientes E2 G+C (región no traducida) E2 C+T (región no traducida) ll35 E4 TC No cambia E8 A+G No cambia E9Cl A+G No cambia 6135 TABLE 1. Polymorphisms seen in fhe difierent exons of TBXI Exon Base change Amino acid change No. change acid change patients E2 G+C (untranslated region) 79/35 E2 C+T (untranslated region) 7/35 E4 T+C No change 72/35 E8 A+G No change 79/35 E9C7 AG No change 6/35 INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n.o 1 87

8 L. Torres, J. Rosell, M. Bernués, eta/. Fenotipo de los pacientes con deleción Phenotype of patients with deletion Otro de los objetivos de este proyecto era averiguar la correlación fenotipogenotipo. Del análisis de nuestros datos clínicos y moleculares podemos decir que, en todos los pacientes con cardiopatía congénita que presentan la deleción, se observa a la vez alguno de los otros rasgos clínicos típicos de este ndrome, como por ejemplo, facies anormal, afectación tímica, insuficiencia velofaríngea o hipocalcemia, siendo los más frecuentes inmunodeficiencia moderada y anomalías faciales (Tabla II). Another objective of this project was to determine the correlation between phenotype and genotype. The analysis of our clinical and molecular data suggests that all patients with congenital heart disease having the deletion also showed some of the other typical clinical features of the deletion syndrome, such as abnormal facies, thymic involvement, velophatyngeal insufficiency or h ypocalcemia, with moderate immune deficiency and facial abnormalities being the most common (Table Il). TABLA ll. Rasgos clínicos que presentan los pacientes con deleción / TABLE II. Clinícal characteristics of patíents with the deletion Paciente l Patient Defecto cardiaco / Cardiac defact Fisura Hipo Facies Retraso Inmunopalatina / calcemia / anormal / desarrollo / defiencia / Cleft HYPO Abnormal Delayed Inmune palate calcemia facies facies develop. Otros Others def. CIV perimembranosa + CIA / Perimembranous WC + IAC CIA + arco aórtico derecho l IAC + right aortic arch AP+CIVI PA + WC AP+CIV/ PA + WC CIV perimembranosa + IVC / Perimembranous WC + IAC CIV perimembranosa l Perimembranous IVC Salida subclavia izquierda aberrante + CoAo l Aberrant left subclavian outlet + AoCo EAI AS TAI TA * * * Otitis, miopía, hipoacusia l Otitis, m yopia, h ypoacusia Insuficiencia velofaríngea l Velopharyngeal insufficiency Aplàsia tímica l Thymic aplasia CIV: comunicación interventricular; CIA: comunicación interauricular; TF: tetralogía de Fallot) TA: truncus arteriosus; EP: estenosis pulmonar; AP: atresia pulmonar; CoAo: coartación aorta; EA: estenosis aorta. : No presenta; * no determinado. WC: interventricular communication; IAC: interatrial communication; TF: tetralogy of Falot; TA: truncus arteriosus; PS: pulmonary stenosis; PA: pulmonary atresia; AoCo: aortic coarctation; AS: aortic stenosis. : Not present; * not determined. 88 INVESTIGACION CARDIOVASCULAR, 2004; val 7, n 0 1

9 Estudio de la región en pacientes con cardiopatías Study of the 22qll region in patients with congenital Los distintos defectos cardiacos observados en The different cardiac manifestations seen in los pacientes con deleción comparados con el to the patients with deletion compared to all the tal de pacientes estudiados con dicho defecto se patients with the defect studied can be seen in puede observar en la Tabla III. En esta tabla llama Table III. Particular mention should be made to la atención que ningun paciente con tetralogía de he fact that none of the patients with tetralogy of Fallot presente la deleción, ya que como se ha ci Fallot had the deletion, although as noted above, tado anteriormente, está descrito que un elevado a high percentage of patients with tetralogy of porcentaje de pacientes con tetralogia de Fallot Fallot have been reported to have the deletion presentan la deleción (2). También cabe destacar (2). It should also be stressed that four of the que cuatro de los nueve pacientes con deleción nine patients with deletion showed no conotrunno presentan cardiopatia conotruncal ni defectos cal heart disease or aortic arch defects, and were de arco aórtico y fueron remitidos por sus altera referred because of their phenotypical ciones fenotípicas. abnormalities. TABLA 111. Tabla en la que se visualizan los distintos defectos cardiacos en los pacientes con deleción comparado con el total de pacientes con dicho defecto / TABLE III. Table showing the different cardiac defects in patients with the deletion as compared to the totalpatíents wíth the defect Cardiopatías conotruncales y de arco aórtico TF TA CIV + AI DTGA DSVD DSVD + estenosis aorta CIA + arco aórtico derecho Salida subclavia izquierda aberrante + coartación aorta Otras cardiopatías CIV (perimembranosa) CIA CIV + EP CIV + CIA EP CIA + EP DAP + EP Atresia tricúspide + EP Ventrículo único AP Atresia mitroaórtica + CIV Coartación aorta Estenosis aorta Aurícula única Canal AV completo Pacientes / del2zqll+ / Patients del22clll + ll Conotruncal and aortic arch heart diseases TF TA WC + PA DTMV DRVO DRVO + aortic stenosis IAC + right aortic arch Aberrant left subclavian outlet + aortic coarctation Other heart diseases WC (perimembranousl IAC WC + PS WC + IAC PS IAC + PS PDA + PS Tricuspid valve atresia + PS Single ventricle PA Mitroaortic coarctation Aortic coarctation Aottic stenosis Single atrium Complete AV canal CIV: comunicación interventricular; CIA: comunicación interauricular; TF: tetralogía de Fallot; TA: truncus arteriosus; EP: estenosis pulmonar; AP: atresia pulmonar; DTGA: transposición de grandes vasos; DAP: ductus arterioso permeable; DSVD: doble salida ventrículo derecho. WC: interventricular communication; IAC: interatrial communication; TF: tetralogy of Falot; TA: truncus arteriosus; PS: pulmonary stenosis; PA: pulmonary atresia; DTMK transposition of mahor vessels; PDA: patent ductus arteriosus; DRVO: dual right ventricular outlet. INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n. 1 89

10 L. Torres, J. Rosell, M. Bernués, eta/. DISCUSIÓN DISCUSSION Las deleciones en la región 22~~11 están asociadas a un elevado número de defectos congénitos conotruncales del corazón. Es, por lo tanto, de gran interés averiguar ciertos aspectos de esta patología que hoy en día aún no han sido resueltos. Uno de ellos es la correlación fenotipogenotipo. La Tabla IV resume las principales características clínicas que han sido asociadas con el fenotipo de cfe122q 7 1 y su frecuencia en un estudio colaborativo con pacientes europeos portadores de la deleción (17). Aunque en algunos casos se describe que la deleción va asociada con cardiopatías congénitas conotruncales aisladas o defectos del arco aórtico, en nuestro estudio se ha observado que no todos los pacientes que poseen la deleción presentan este tipo de cardiopatías pero, sin embargo, todos los pacientes con deleción presentan algún otro rasgo característico del ndrome de122qi 1. Este es un dato de interés para la orientación clínica ya que demuestra que la cardiopatía congénita conotruncal no es condición necesaria ni suficiente para ser portador de una deleción en la población estudiada. Otro dato que hemos podido constatar es que la técnica de FISH permite la detección de la práctica totalidad de las deleciones 22qll causantes de cardiopatía, ya que en todos los pacientes sometidos al estudio molecular se ha confirmado el resultado obtenido por hibridación in situ. Se puede concluir por lo tanto que la técnica FISH es suficiente como diagnóstico de las deleciones causantes del ndrome del22qli ya que un número muy bajo de estas escaparían a la detección. Deletions in the 22q Il region are associated with a large number of congenital conotruncal cardiac defects. It is therefore of great interest to clarify certain aspects of this pathology that remain unsolved. One such aspect is the phenotypegenotype correlation. Table IV summarizes the main clinical characteristics associated with the del22qll phenotype and its frequency in a collaborative study in European patients carrying the deletion (17). Although the 22q ll deletion has been reported in some cases to be associated with isolated congenital conotruncal heatt diseases or aortic arch defects, in our study not all patients with the deletion showed such defects. However, all patients with the deletion had some other characteristic feature of the del22qll syndrome. This observation is of interest for clinical guidance, since it shows that conotruncal congenital heart disease is neither necessary nor sufficient for the population studied to be carriers of a deletion. Our study also found that FISH allows for detection of virtually all 229 ll deletions causing heart disease, since the result obtained by in situ hydridization was confirmed in all the patients subjected to the molecular study. It can therefore be concluded that FISH suffices for diagnosing the deletions causing the del22qll syndrome, since only vety few cases would escape detection by the technique. Although all the patients cany the same molecular defect fa 3 Mb deletion), we have TABLA IV. Frecuencia de los rasgos clínicos más frecuentes en pacientes con deleción 22qll según un estudio con 558 pacientes de siete países europeos (23) / TABLE IV. Frequency of the most common clinical characterktks in patients with deletion according fo a study involving 558 patients from seven European countries (23) Rasgos típicos de pacientes de/zzql7 Frecuencia (%) / Frequecy 1%) Typical features of patients with del22qll Facies anormal Mayoría / Major@ Abnormal facies Defectos cardiacos congénitos 75 Congenital heart defects Retraso de desarrollo 68 Dela yed development Inmunodeficiencia 67.4 Immune deficiency Hipocalcemia 60 Hypocalcemia Defectos renales 38 Renal defects Defectos audición 33 Hearing defects Insuficiencia velofaríngea 32 Velopharyngeal insufficiency Problemas psiquiátricos 18 Ps ychiatric problems Defectos esqueléticos 17 Skeletal defects Fisura palatina 9 Clefi palate 90 INVESTIGACION CARDIOVASCULAR, 2004, val 7, n. 1

11 Estudio de la región 22q11 en pacientes con cardiopatías Study of the 22qll region in patients with congenital Aunque todos los pacientes son portadores del mismo defecto molecular (una deleción de 3 Mb) hemos visto que presentan grados de afectación muy distintos, lo que ya se había observado en otros estudios (2,3) (ver Tabla II). Asimismo, también está descrito que pacientes portadores de deleciones (catípicas) no solapantes con la zona típicamente delecionada pueden presentar un mismo fenotipo (8). Estos estudios sugirieron la existencia de al menos cinco regiones críticas para el desarrollo del fenotipo DGWCFS y excluyen cualquier correlación entre tamaño de la deleción y severidad clínica del fenotipo. Al día de hoy hay múltiples explicaciones para la observada ausencia de correlación genotipofenotipo, como que haya varios genes que afecten independientemente el desarrollo de las estructuras afectadas (a la vez estos genes podrían hallarse tanto en la región 22q11 como en otras localizaciones del genorna); o que haya factores ambientales que agraven la severidad clínica del fenotipo, entre otras. En DGS/VCFS se han identificado numerosos genes de la región que pueden ser candidatos. Nosotros hemos estudiado el gen TBX1 que es un gen que pertenece a la familia de factores de transcripción con dominio Tbox que desempeñan un papel importante en el desarrollo embrionario y que además recientemente se ha descrito como responsable de defectos cardiovasculares conotruncales en el ratón (1214). En nuestro estudio de 35 pacientes sin la deleción no hemos identificado ninguna mutación que claramente pueda ser la causa de la cardiopatía del paciente, ya que las mutaciones encontradas o bien no producen ningún cambio de aminoácido o de marco de lectura, o bien ya habían sido descritas como polimorfismos frecuentes en la población en un estudio anterior (16). Finalmente, cabe destacar el hecho de que la gran mayoría de deleciones de novo de nuestro estudio han tenido lugar en la línea germinal materna (tres materna, una paterna). Aunque este dato no sea estadísticamente relevante debido al número de sujetos, coincide con otros estudios donde en el 75% de los casos el alelo materno es el afectado (18). De cualquier manera es un tema controvertido ya que otros estudios no detectan esta predominancia materna de las deleciones (17). En conclusión, podemos decir que tras estudiar un total de 59 pacientes con cardiopatías congénitas, la proporción de pacientes en las Baleares con cardiopatías congénitas portadores de la deleción 22qll es de aproximadamente 15%, que es un nivel similar al detectado en otros estudios (2). A nivel molecular se ha caracterizado la región con 15 marcadores polimórficos con lo que se acota seen that the extent of involvement varies greatly, as already noted in previous studies (2, 31 Isee Table ll). Likewise, it has also been reported that patients carrying c(atypicalj) deletions nonoverlapping with the typically deleted area can show the same phenotype (8). These studies suggested that there are at least five critica1 regions for development of the DGS/VCFS phenotype, and exclude any correlation between the size of deletion and the clinical severity of the phenotype. There are currently multiple explanations for the lack of genotypephenotype correlation observed, such as the existence of severa/ genes that independently affect the development of the involved structures (such genes could in turn be located either in the 22qll region or in other locations in the genorne), or the existence of environmental factors that exacerbate the clinical severity of the phenotype. In DGSNCFS, man y genes of the 22q ll region have been identified as potential candidates. We studied the TBXI gene, which belongs to the family of transcription factors with Tbox domain that play a significant role in embryonic development, and have also recently been reported to be responsible for conotruncal cardiovascular defects in mice (1214). In our study of 35 patients without the deletion, no mutation clearly capable of causing the heart disease in the patient was identified, since the mutations found either caused no amino acid or reading frame changes, or had already been reported as common polymorphisms in the population in a previous study (16). Finally, it should be stressed that the vast majority of de novo deletions in our study ocurred in the maternal germ line (three cases, versus only one in the paternal linel. Although this data is not statistically relevant in view of the limited sample size, it agrees wíth other studies where the maternal allele was the one involved in 75% of cases (18). At any rate, this is a controversia1 subject, since other studies did not report such maternal predominance of deletions (171. In conclusion, it can be stated that our study of 59 patients with congenital heart disease shows that the propottion of such patients in the Balearic Islands (Spain) carrying the 229 ll deletion is approximately 15%, which agrees with the figures reported elsewhere 12). At molecular level, the region has been characterized using 75 polymorphic markers to define the deletions, the majority 3 Mb deletion being found in all cases. Moreover, no atypical INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004: val. 7, n. 1 91

12 L. Torres, J. Rosell, M. Bernués, eta/. ron las deleciones, presentando en todos los casos, la deleción mayoritaria de 3 Mb. Además, no se ha encontrado una deleción atípica en los pacientes que en principio se había determinado por FISH que no eran portadores de la de122qll. Por otra parte, no se ha detectado ninguna mutación relevante en el gen TBX?, que en otros estudios se ha propuesto como uno de los candidatos a ser el causante de la cardiopatía congénita asociada a la región 229 ll. Agradecimientos Este trabajo se llevó a cabo gracias a una Ayuda a la Investigación de la Fundación MAPFRE Medicina y del Fondo de Investigación Sanitaria (FIS 00/0779). Asimismo los autores agradecen a la Asociación Balear de Cardiopatías Congénitas su ayuda para la realización de este trabajo. deletions were found in patients initially shown by FISH not to carry the 22qll deletion. On the other hand, no relevant mutations were detected in the TBXI gene, which in other studies have been proposed as one of the candidates for explainíng congenital heart disease associated with the 22q ll region. Acknowledgments This study was suppotted by a research grant from the MAPFRE Medicina Foundation and the Fondo de Investigación Sanitaria (FIS 00/0779). The authors also thank the Asociación Balear de Cardiopatías Congénitas for its help in the conduct of the study. BIBLIOGRAFíA / RfFERENCES 1. MICHELS V V, RICCARDI V M. Congenital heart defects. En: A E H Emery, D L Rimon (eds), Principies and pracrice of medical generics. Edinburgh: Churchill Livingston, 1990; 2. ed, pp LINDSAY E, BALDINI A. Congenital heart defects and 22qll deletions: which genes count? Mo/ Med Today. 1998; LINDSAY E. Chromosomal microdeletions: dissecting del22qll syndrome. Nar Gener Review. 2001; 2: GOODSHIP J, CROSS 1, SCAMBLER P, BURN J. Monozygotic twins with chromosome 22qll deletion and discordant phenotype. J Med Genet 1995; 32: YAMAGISHI H, ISHII C, MAEDA J, KOJIMA Y, MAT SUOKA R, KIMURA M, et al. Phenotypic discordante in monozygotic tvins with 22qll.2 deletion. Am J Med Gener. 1998; 78: TEZENAS D U MONTCEL S, MENDIZABAI H, AYME S, LEW A, PHILIP N. Prevalence of 22qll microdeletion [letterl. J Med Gener. 1996; 33: CARLSON C, SIROTKIN H, PANDITA R, GOLDBERG R, MCKIE J, WADEY R, eral. Molecular definition of 22qll deletions in 151 velocardiofacial syndrome patients. Am J Hum Gener. 1997; 61: AMATI F, CONTI E, NOVELL1 A, BENGALA M, DIGILIO M C, MARINO B, et al. Atypical deletions suggest five 22qll critica1 regions related to the DiGeorge/velocardio facial syndrome. Eur J Hum Gener. 1999; 7: YAMAGISHI H, GARG V, MATSUOKA R, THOMAS T, SRIVASTAVA D. A molecular pathway revealing a genetic basis for human cardiac and craniofacial defects. Science. 1999; 283: 1158I WADEY R, MCKIE J, PAPAPETROU C, SUTHERLAND H, LOHMAN F, OSINGA J, et al. Mutations of UFDIL are not responsible for the majority of cases of DiGeorge Syndrome/Velocardiofacial syndrome without deletions within chromosome 22qll. Am J Hum Gener. 1999; 65: ll. CHUNG M, LU J, WENG Y, HWANG B. Absence of mutations in human ubiquitin fusiondegradation protein gene in tetralogy of Fallot. J Mo/ Med LINDSAY E A, VITELLI F, SU H, MORISHIMA M, HUYNH T, PRAMPARO T, JURECIC V, OGUNRINU G, SUTHERLAND H F, SCAMBLER P J, BRADLEY A, BAL DINI A. Tbxl haploinsufficiency in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Narure. 2001; 410: MERSCHER S, FUNKE B, EPSTEIN J A, HEYER J, PUECH A, MIN LU M, et al. TBXI is responsible for cardiovascular defects in velo cardio facial/digeorge syndrome. Ce//. 2001; 104: JEROME LA, PAPAIOANNOU V E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the Tbox gene Tbxl. Narure Gener. 2001; 27: GURIS D L, FANTES J, TARA D, DRUKER B J, IMA MOTO A. Mice lacking the homologue of the human 22q11.2 gene CRKL phenocopy neurocristopathies of DiGeorge syndrome. Narure Gener. 2001; 27: GONG W, GO TTLIEB S, COLLINS J, BLESCIA A, DIEli! H, GOLDMUNTZ E, et al. Mutation analisis of TBXI in nondeleted patients withfeatures of DGS/VCFS or isolated cardiovascular defects. J Med Genet 2001; 38: e RYAN A K, GOODSHIP J A, WILSON D 1, PHILIP N, LE WA, SEIDEL H, eral. Spectrum of clinical features associated with interstitial chromosome 22qll deletions: a European collaborative study. J Med Genet 1997; 34: DEMCZUK S, LÉW A, AUBRY M, CROQUETrE M F, PHILIP N, PRIEUR M, SAUER U, BOUVAGNET P, ROULEAU G A, THOMAS G. Excess of deletions of maternal origin in the DiGeorge/Velocardiofacial syndromes. A study of 22 new patients and review of the Iiterature. Hum Gener. 1995; 96: INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n. 1