BIBLIOTECA DE PRUEBAS. Servicio De Oncología Molecular. AGC - Laboratorio de Medicina

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1 BIBLIOTECA DE PRUEBAS Servicio De Oncología Molecular AGC - Laboratorio de Medicina Ed.01 Mayo 2013 Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 1 de 127

2 ÍNDICE DETERMINACIONES DE APOYO DIAGNÓSTICO EN ANATOMÍA PATOLÓGICA Y HEMATOLOGÍA REORDENAMIENTO DEL GEN IGH... 4 REORDENAMIENTO DEL GEN TCRG... 7 TRANSLOCACIÓN BCL2/IGH... 9 TRANSLOCACIÓN BCL-1/IGH TRANSLOCACIÓN BCR/ABL P210 Y/O P TRANSLOCACIÓN PML/RARA MUTACIÓN JAK-2 (V617F) MUTACIÓN JAK-2 (EXÓN 12) MUTACIÓN MPL (EXONES 10 Y 11) TRANSLOCACIÓN TEL-AML TRANSLOCACIÓN MLL-AF TRANSLOCACIÓN E2A-PBX TRANSLOCACIÓN CBFB-MYH TRANSLOCACIÓN AML1-ETO TRANSLOCACIÓN SIL-TAL TRANSLOCACIÓN NPM1-ALK TRANSLOCACIÓN FIP1L1-PDGFRA MUTACIONES EN FLT-3 (ITDS Y TK) MUTACIONES EN NPM1 (EXÓN 12) MUTACIONES EN CEBPA DETERMINACIÓN DE ESTADO MUTACIONAL DE IGHV TRANSLOCACIONES EWSR1-FLI1; EWSR1-ERG TRANSLOCACIONES SYT-SSX1; SYT-SSX TRANSLOCACIÓN EWSR1-ATF TRANSLOCACIONES PAX3-FOXO1A; PAX7-FOXO1A TRANSLOCACION EWSR1-WT TRANSLOCACIÓN EWSR1-CHOP; TLS-CHOP TRANSLOCACIÓN FUS-CREB3L2; FUS-CREB3L DETERMINACIONES DE SEGUIMIENTO/ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN HEMATOLOGÍA TRANSLOCACIÓN BCR/ABL P210 Y/O P190 PCR CUANTITATIVA TRANSLOCACIÓN PML/RARA PCR CUANTITATIVA QUIMERISMO POST TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN BCR-ABL FACTORES PRONÓSTICO/TOMA DE DECISIONES TERAPEÚTICAS EN TUMORES SÓLIDOS DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN KRAS DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL DOMINO TK DE EGFR DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN KIT (EXONES 8, 9, 10, 11, 13, 17) DETERMINACIÓN DE MUTACIONES V600E EN EL GEN BRAF DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA DE BRAZOS CROMOSÓMICOS 1P Y 19Q DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN IDH1 (R132) E IDH2 (R172) DETERMINACIÓN DE ESTATUS DE METILACIÓN DEL PROMOTOR DE MGMT ESTUDIO DE GENOTIPADO EN EL GEN UGT1A1 (VARIANTE UGT1A1*28) DETERMINACIONES DE CÁNCER FAMILIAR DETERMINACIÓN DE INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN LOS GENES SDHD Y SDHB Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 2 de 127

3 DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN VHL DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN RET (EXONES 10, 11, 13, 14, 15 Y 16) DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN MYH (Y165C Y G382C) DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN TP DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN BRCA DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN BRCA DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN MLH DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN MSH DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN MSH DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN PMS DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN APC DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN NF DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN NF DETERMINACIÓN DE GRANDES DELECIONES EN BRCA1 Ó BRCA DETERMINACIÓN DE GRANDES DELECIONES EN MLH1, MSH2 Y MSH DETERMINACIÓN DE GRANDES DELECIONES EN APC Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 3 de 127

4 REORDENAMIENTO DEL GEN IGH INFORMACIÓN CLÍNICA Las dificultades para llevar a cabo un diagnóstico preciso en patologías linfoides ocurren en un porcentaje de casos de aproximadamente entre el 5 y el 10%. Cuando los datos de inmunofenotipado no son suficientes, otros métodos adicionales han de ser utilizados, tales como el estudio de monoclonalidad mediante técnicas moleculares. Los genes de las inmunoglobulinas (de la cadena pesada y de las cadenas ligeras, kappa y lambda) se componen de numerosos segmentos codificantes, que se encuentran separados de forma discontinua en las regiones cromosómicas 14, 2 y 22 respectivamente. Durante la maduración de los linfocitos B, estos segmentos génicos se reordenan de forma específica en cada una de las células, de tal forma que cada célula B madura tiene un perfil único de reordenamiento de estos genes. La expansión clonal de cualquier célula B dará lugar a una población de células que tienen un perfil de reordenamiento de IGH idéntico. Las expansiones de células B reactivas son policlonales, conteniendo cada clon un pequeño número de células, y sin ninguno de ellos predominante. Sin embargo, los clones neoplásicos suelen tener mayor número de células, de tal manera que las células clonales serán las células B predominantes en la muestra. En un contexto clínico y patológico adecuado, la detección de un perfil de reordenamiento predominante del gen de las cadenas pesadas de Ig puede ser sugerente de la presencia de un clon neoplásico de células B. UTILIDAD CLÍNICA Es útil para determinar si una población de células B o de células plasmáticas es policlonal o monoclonal. Estos estudios se realizan para confirmar el diagnóstico por ejemplo en: - Cualquier sospecha de proliferación de células B, cuando la morfología y el inmunofenotipado no son concluyentes. - Linfoproliferaciones en pacientes inmunodeficientes, incluyendo pacientes postransplantados. - Evaluación de la relación clonal entre dos patologías linfoides en un paciente, o discriminación entre una recidiva y una segunda patología. - Ocasionalmente, para conocer el estadío de un linfoma. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio. El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-2 (van Dongen et al 2003). Se preparan grupos de PCR multiplex con las mezclas de oligonucleótidos, conteniendo un oligonucleótido fluorescente, diseñadas por BIOMED2 y preparadas de forma manual en el laboratorio. Se realizan las PCRs en las condiciones descritas utilizando entre 100 y 300 ng de ADN por mezcla. Los productos da cada grupo de PCR se analizan mediante electroforesis capilar en un instrumento ABIPrism310 (Applied Byosistems) y se analizan los resultados utilizando el software Genemapper 4.0. Los resultados se interpretan de forma manual. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): 1-4 ml en Tubo de tapón morado Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 4 de 127

5 Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino (entre mg de tejido) Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral. Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos. VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para determinar su significación. La interpretación de la presencia o ausencia de un patrón predominante de reordenamiento de Ig puede ser en ocasiones subjetiva, por lo que se necesita una interpretación en conjunto con el resto de los datos clínicos. La detección de un patrón de reordenamiento monoclonal mediante esta técnica no siempre es sinónimo de la presencia de una neoplasia clonal. El ensayo no es 100% específico ni 100% sensible. Pueden obtenerse resultados falsos negativos si las células a estudiar han pasado ya la fase de hipermutación somática que ocurre en el centro folicular, y por tanto se han introducido ya mutaciones puntuales en el gen IGH y los oligonucleótidos diseñados para la reacción de PCR ya no se unen eficazmente al molde. También pueden ocurrir falsos negativos si las células clonales a estudio aún no han reordenado el gen IGH a estudio, como puede ocurrir en neoplasias de células muy inmaduras, o también si las células clonales están en un porcentaje por debajo del nivel de sensibilidad del ensayo. Se requieren al menos entre un 1-5% de células clonales en la muestra para ser detectado el reordenamiento clonal. Los falsos positivos son raros. Si la cantidad de ADN obtenido a partir de la muestra para realizar el estudio está en el rango de < 15 ng/microlitro, un resultado negativo se considerará no valorable. Este ensayo no da información sobre el grado de diferenciación de la población clonal detectada, ni si un reordenamiento monoclonal detectado es fisiológico o es neoplásico. De acuerdo con Evans et al (2007), en relación con las distintas patologías de células B maduras, se pueden detectar reordenamientos monoclonales de IGH con este método en el 100% de los linfomas del manto, en el 100% de las leucemias linfáticas crónicas, en el 84% de los casos de linfoma de la zona marginal extraganglionar, en el 100% del linfoma de la zona marginal ganglionar, en el 84% de los casos de linfoma folicular y en el 79% del linfoma B difuso de célula grande. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 4 y 20 días laborables. La prueba se realiza una vez a la semana, aproximadamente. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia (2003) 17: Van Krieken et al. Improved reliability of lymphoma diagnostics via PCR-based clonality testing: Report of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia (2007) 21: Langerak et al. Polymerase chain reaction-based clonalitu testing in tissue samples with reactive lymphoproliferations: usefulness and pitfalls. A report of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia (2007) 21: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 5 de 127

6 Evans et al. Significantly improved PCR-based clonality testing in B-cell malignancies by use of multilple immunoglobulin gene targets. Report of the BIOMED-2 Concerted Action. Leukemia (2007) 21: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 6 de 127

7 REORDENAMIENTO DEL GEN TCRG INFORMACIÓN CLÍNICA Los genes que codifican los receptores de células T (TCR alfa, beta, gamma y delta) están compuestos por numerosos segmentos codificantes discontinuos, que se reordenan somáticamente durante la maduración del linfocito T, para producir los receptores T de superficie, que son heterodiméricos (alfa/beta, el 90-95% de las células T; gamma/delta, el 5-10% de las células T). Durante la maduración de los linfocitos T, todos sufren reordenamiento del gen TCRG (gamma) que se mantiene incluso en los linfocitos que finalmente van a expresar los receptores alfa/beta. Por ello, el estudio del reordenamiento del gen TCRG se ha utilizado para la detección de clonalidad linfoide T. UTILIDAD CLÍNICA El gen TCRG está reordenado en más del 90% de las leucemias agudas linfoblásticas T, de los linfocitos grandes granulares T, y de leucemia prolinfocítica T, y en el 50-75% de los casos de linfoma no- Hodgkin T y micosis fungoides pero no en proliferaciones NK. También está reordenado en una parte de las leucemias agudas linfoblásticas B y mucho menos en los linfomas no-hodgkin B. Es útil para determinar si una población de células T es policlonal o monoclonal. Estos estudios se realizan para confirmar el diagnóstico por ejemplo en: - Cualquier sospecha de proliferación de células T, cuando la morfología y el inmunofenotipado no son concluyentes. - Evaluación de la relación clonal entre dos patologías linfoides en un paciente, o discriminación entre una recidiva y una segunda patología. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio. El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-2 (van Dongen et al 2003). Se preparan grupos de PCR multiplex con las mezclas de oligonucleótidos, conteniendo un oligonucleótido fluorescente, diseñadas por BIOMED2 y preparadas de forma manual en el laboratorio. Se realizan las PCRs en las condiciones descritas utilizando entre 100 y 300 ng de ADN por mezcla. Los productos da cada grupo de PCR se analizan mediante electroforesis capilar en un instrumento ABIPrism310 (Applied Byosistems) y se analizan los resultados utilizando el software Genemapper 4.0. Los resultados se interpretan de forma manual. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral. Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos. VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 7 de 127

8 Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para determinar la significación de los mismos. La interpretación de la presencia o ausencia de un patrón predominante de reordenamiento de TCRG puede ser en ocasiones subjetiva, por lo que se necesita una interpretación en conjunto con el resto de los datos clínicos. La detección de un patrón de reordenamiento monoclonal mediante esta técnica no siempre es sinónimo de la presencia de una neoplasia clonal. Se pueden producir falsos positivos en el estudio de reordenamiento del gen TCRG cuando el número total de células T en la muestra es limitado, ya que el repertorio de reordenamientos de los segmentos génicos es bastante reducido y puede estar sesgado hacia unos tipos concretos de reordenamientos en algunas condiciones fisiológicas, como la edad, en situaciones post-trasplante, y en reacciones autoinmunes. Por otra parte, se pueden producir falsos negativos por varias razones, tales como el tipo de muestra con escaso número de linfocitos para estudiar, baja cantidad de ADN obtenida de la muestra, o imposibilidad de detección de una pequeña minoría de reordenamientos génicos no amplificables por los oligonucleótidos utilizados. En algunas ocasiones se detectan resultados difícilmente interpretables, caracterizado por un patrón de reordenamientos anormal (comparado con un típico reordenamiento policlonal T) pero que no llega a ser posible interpretar de forma definitiva como una población monoclonal. En estas situaciones no es fácil distinguir una pequeña subpoblación monoclonal de una población reactiva aumentada. En estos casos el resultado será no concluyente y conviene analizar una nueva muestra pasados unos meses si la clínica lo requiere, para confirmar o descartar la presencia de una población monoclonal. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 4 y 20 días laborables. La prueba se realiza una vez a la semana, aproximadamente. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia (2003) 17: Van Krieken et al. Improved reliability of lymphoma diagnostics via PCR-based clonality testing: Report of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia (2007) 21: Langerak et al. Polymerase chain reaction-based clonalitu testing in tissue samples with reactive lymphoproliferations: usefulness and pitfalls. A report of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia (2007) 21: Bruggemann et al. Powerful strategy for polymerase chain reaction-based clonality assessment in T-cell malignancies. Report of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia (2007) 21: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 8 de 127

9 TRANSLOCACIÓN BCL2/IGH INFORMACIÓN CLÍNICA La translocación t(14;18) es una de las alteraciones citogenéticas recurrentes mejor caracterizada en los procesos linfoproliferativos B. Se detecta aproximadamente en el 90% de los linfomas foliculares y en un 20% de los linfomas B de célula grande. Como consecuencia de esta alteración, el gen BCL2 ubicado en 18q21 queda colocado en el locus de IGH, bajo el control de potentes estimuladores de la transcripción ( enhancers ), lo que da lugar a la desregulación del patrón normal de expresión del gen BCL2. La proteína BCL2 se localiza en la membrana extearn mitocondrial y su función normal es antagonizar el proceso de apoptosis. Por tanto, su sobre-expresión implica un aumento en la inhibición de la apoptosis, lo que podría estar implicado en la patogénesis tumoral. UTILIDAD CLÍNICA Como consecuencia de su posible papel en la patogénesis tumoral, la determinación de la presencia de la translocación t(14;18) es adecuada tanto para apoyo diagnóstico como para monitorizar la presencia de enfermedad mínima residual. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio. El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-2 (van Dongen et al 2003). Se preparan tres grupos de PCR multiplex con las mezclas de oligonucleótidos, conteniendo un oligonucleótido fluorescente, diseñadas por BIOMED2 y preparadas de forma manual en el laboratorio. Se realizan las PCRs en las condiciones descritas utilizando entre 100 y 300 ng de ADN por mezcla. Los productos da cada grupo de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. La presencia de un fragmento amplificado en alguna de las mezclas de PCR dentro de un rango de tamaños posibles es sugerente de la presencia de la translocación. Se verifica mediante secuenciación. El tamaño final del producto positivo se determina mediante electroforesis capilar en un instrumento ABIPrism310 (Applied Byosistems). REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral. Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos. VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La aparición de un fragmento amplificado en una de las mezclas de PCR es sugerente de presencia de translocación. El análisis de secuencia permitirá verificar la presencia de la misma. La mayor parte de los puntos de ruptura en el gen BCL2 ocurren en la zona denominada MBR ( Major breakpoint region ) en unas 150 pb localizadas en la zona 3 no trasladada del exon 3. Existe otro punto de ruptura posible a 4 kb del anterior, denominado 3 MBR y que ocupa unas 3,8 kb. Por último, la región mcr ( minor cluster region ) es una zona de una 500 pb, localizada a 20 kb 3 de MBR. Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 9 de 127

10 Precauciones. A pesar de que la técnica de PCR ofrece resultados rápidos y puede ser utilizada para monitorizar la enfermedad mínima residual, los estudios de detección de esta translocación basados en PCR solo cubren hasta un 60% de las translocaciones posibles, lo cual hace que esta técnica no sea la ideal con fines exclusivamente diagnósticos, ya que hasta un 40% de los casos con translocación podrían no ser detectados. Debería utilizarse como método de diagnóstico la citogenética y la hibridación mediante FISH, que tienen el potencial de detectar un porcentaje más alto de translocaciones. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 4 y 20 días laborables. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia (2003) 17: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 10 de 127

11 TRANSLOCACIÓN BCL-1/IGH INFORMACIÓN CLÍNICA La translocación t(11;14)(q13;q32) es característica del linfoma del manto, ya que se ha observado en el 60-70% de los casos de este tipo de linfoma, y sólo muy esporádicamente en otros tipos de linfomas no- Hodgkin. La región de ruptura en el cromosoma 11 se denominó inicialmente región BCL1. Aproximadamente en el 40% de los casos con translocación, ésta ocurre dentro de una zona de 85 pb en la zona 5 del gen que codifica la ciclina D1 (gen CCND1). La región de ruptura en el cromosoma 14 corresponde en casi todos los casos a una zona del locus IGH yuxtapuesto a una región de potentes estimuladores de la transcripción de IGH ( enhancers ), lo que da lugar a la activación trascripcional del gen que codifica la ciclina D1. La ciclina D1, junto con la proteina CDK4 fosforila e inactiva la proteina RB, permitiendo a las células el paso por la fase G1 del ciclo celular. Puesto que la ciclina D1 no se expresa normalmente en linfocitos B ni en otros linfomas no Hodgkin, excepto el linfoma del manto, se considera que la presencia de ciclina D1 está relacionada con la patogénesis del linfoma del manto. UTILIDAD CLÍNICA La determinación de la presencia de la translocación t(11;14) es adecuada tanto para apoyo diagnóstico como para monitorizar la presencia de enfermedad mínima residual en el linfoma del manto. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio. El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-2 (van Dongen et al 2003). Se realiza una PCR con los oligonucleótidos diseñados por BIOMED2, conteniendo un oligonucleótido fluorescente, preparando al mezcla de forma manual en el laboratorio. Se realiza la PCR en las condiciones descritas utilizando entre 100 y 300 ng de ADN por mezcla. Los productos da cada grupo de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. La presencia de un fragmento amplificado en alguna de las mezclas de PCR dentro de un rango de tamaños posibles es sugerente de la presencia de la translocación. Se verifica mediante secuenciación. El tamaño final del producto positivo se determina mediante electroforesis capilar en un instrumento ABIPrism310 (Applied Byosistems). REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral. Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos. VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La aparición de un fragmento amplificado es sugerente de presencia de translocación. El análisis de secuencia permitirá verificar la presencia de la translocación. En el 40% de los casos, el punto de ruptura se encuentra en una zona de 85 pb denominada región MTC (Major Translocation Cluster), aunque pueden ocurrir rupturas hasta en una zona de 2 kb más delante de esta zona y no se detectarían mediante la técnica utilizada. Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 11 de 127

12 Precauciones. A pesar de que la técnica de PCR ofrece resultados rápidos y puede ser utilizada para monitorizar la enfermedad mínima residual, los estudios de detección de esta translocación basados en PCR solo cubren hasta un 40% de las translocaciones posibles, lo cual hace que esta técnica no sea la ideal con fines exclusivamente diagnósticos, ya que hasta un 60% de los casos con translocación podrían no ser detectados. Debería utilizarse como método de diagnóstico la citogenética y la hibridación mediante FISH, que tienen el potencial de detectar hasta el 100% de las translocaciones. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 4 y 20 días laborables. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia (2003) 17: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 12 de 127

13 TRANSLOCACIÓN BCR/ABL P210 Y/O P190 INFORMACIÓN CLÍNICA La leucemia mieloide crónica (LMC) es una neoplasia de las células madre hematopoyéticas que se incluye dentro del ámbito de las neoplasias mieloproliferativas. La LMC está asociada de manera consistente con la translocación que fusiona el gen BCR en el cromosoma 22q11 con el gen ABL, localizado en 9q23. Esta fusión se conoce como BCR/ABL. El ARNm de BCR/ABL (gen de fusión, producto de la translocación que une el gen BCR en el cromosoma 22q11 con el gen ABL en el cromosoma 9q23) se detecta en casi todos los pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC) y en un subgrupo de aquellos con leucemia linfoblástica aguda (LAL) y leucemia mieloide aguda (LAM). Aunque los puntos de translocación en BCR y ABL pueden ocurrir en varias localizaciones, mediante el proceso de splicing sólo se obtienen 8 variantes (e1/a2, e6/a2, e13/a2, e14/a2, e19/a2, e1/a3, e13/a3, e14/a3) que incorporan la secuencia completa de los exones a ambos lados del punto de fusión. Aunque no descritas, variantes adicionales (e20/a2, e6/a3, e12/a3, e19/a3, e20/a3) podrían, en teoría, resultar en proteínas BCR/ABL patogénicas. Sí se han descrito, aunque en meros casos puntuales, pacientes con puntos de translocación dentro de la secuencia de los exones. En LMC, >95% de los pacientes presentan una translocación de tipo e13/a2 (b2a2) o e14/a2 (b3a2), las cuales dan lugar a una proteina de 210-kDa (p210). Más del 50% de los pacientes con LAL de tipo BCR- ABL-positivo presentan la translocación e1/a2, que genera una proteína de 190-kDa (p190), mientras la mayoría de los pacientes restantes tienen, bien la variante e13/a2 o la e14/a2. El resto de las translocaciones son muy raras en neoplasias que presentan BCR/ABL. Cuando se analiza la presencia de ARNm de BCR/ABL en el momento del diagnóstico es importante utilizar un ensayo que detecte tantos tipos de translocaciones como sea posible y que las identifique. Esto evita falsos positivos al diagnóstico y asegura que el método de seguimiento seleccionado para la monitorización del paciente sea el adecuado para cada paciente. Este ensayo está diseñado para detectar todas las variantes de BCR/ABL. UTILIDAD CLÍNICA Apoyo diagnóstico en pacientes con neoplasias bcr-abl positivas, principalmente leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia aguda linfoblástica (LAL). En la prueba, un resultado positivo viene acompañado de la identificación de la variante de fusión, información imprescindible para un apropiado seguimiento del paciente. Si no estuviera disponible una prueba de monitorización adecuada para una variante rara, este ensayo tendría un cierto valor de monitorización, pudiendo aportar resultados positivos o negativos. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO PCR siguiendo los protocolos recomendados por el consorcio BIOMED-1 (van Dongen et al. Leukemia 1999; 13: ). REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguno en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre (4 ml) o médula ósea (3 ml) anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado VALORES DE REFERENCIA Se obtiene un resultado cualitativo que indica la presencia o ausencia de ARNm BCR/ABL. Cuando es positivo, la variante de fusión también se determina. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 13 de 127

14 Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 3 y 14 días laborables. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Hochhaus A, Reiter A, Skladny H, et al: A novel BCR-ABL fusion gene (e6a2) in a patient with Philadelphia chromosome-negative chronic myelogenous leukemia. Blood 1996 September 15;88(6): van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA et al: Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia Dec;13(12): Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 14 de 127

15 TRANSLOCACIÓN PML/RARA INFORMACIÓN CLÍNICA La leucemia aguda promielocítica (LAP) una entidad claramente diferenciable del resto de leucemias agudas mieloides, especialmente en lo referido a sus requerimientos terapéuticos específicos. Se caracteriza por la presencia de la translocación t(15;17) que produce el gen de fusión PML-RARa y que, además de ser un marcador clínico para el diagnóstico, se utiliza para la monitorización de enfermedad mínima residual. Esta translocación implica la fusión del gen PML en el cromosoma 15 y el gen RARA en el cromosoma 17 con los puntos cromosómicos de ruptura 15q22-q24 y 17q11q21. Según la localización del punto de ruptura se producen los subtipos de transcrito bcr1, bcr2 y bcr3, con una frecuencia aproximada del 55%, 5% y 40% respectivamente. El gen de fusión PML-RARa dispone de una molécula específica, el ácido retinoico todo-trans (ATRA), que actúa sobre la proteína de fusión generada por la translocación. De forma que, aunque los pacientes con LAP tienen un alto riesgo de muerte temprana, la existencia de una terapia específica hace que llegue a la curación un 80% de los pacientes (Lo-Coco et al. 2006). UTILIDAD CLÍNICA La determinación de la presencia de la translocación t(15;17) es adecuada tanto para apoyo diagnóstico como para monitorizar la presencia de enfermedad mínima residual en leucemia aguda promielocítica (LAP). Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la efectividad del tratamiento y prevenir una posible recaída. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se lisan los eritrocitos mediante lisis osmótica. Se prepara ARN y ADN a partir de la muestra y posteriormente se obtiene cadn a partir del ARN. El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1 (van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el protocolo y preparados de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual. En caso de dudas en la interpretación del tamaño del fragmento amplificado, se realiza secuenciación para verificar la presencia de la translocación. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos. Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral. VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 15 de 127

16 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la significación de los mismos. Los resultados se expresan de la siguiente manera: - No se observa amplificación de ninguno de los transcritos anteriormente descritos, o - Se obtuvo amplificación de un fragmento de un tamaño correspondiente al transcrito resultante de la translocación PML-RARa según está descrito. Muestra positiva para la translocación PML-RARa t(15;17). TIEMPO DE RESPUESTA Entre 1 y 5 días laborables. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Lo-Coco et al. The biology of acute promyelocytic leucemia and its impacto n diagnosis treatment. Hematology Am Soc Hematol Educ Program (2006): , 514. Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 16 de 127

17 MUTACIÓN JAK-2 (V617F) INFORMACIÓN CLÍNICA El gen JAK2 (Janus kinase 2) codifica una tirosin kinasa intracelular (JAK2), que se asocia con la parte citoplásmica de varios receptores transmembrana de citokinas y factores de crecimiento. La unión de estos receptores con su ligando extracelular da lugar a la multimerización del receptor y el reclutamiento de JAK2, que los activa por transfosforilación. Esta activación permite la unión de un factor de transcripción STAT5, que estaba en estado latente, y que también es fosforilado por JAK2. STAT5 fosforilado se dimeriza y se transloca hacia el núcleo celular, iniciando la transcripción de genes implicados en el crecimiento celular y la diferenciación. En el año 2005 se identificó la presencia de una mutación puntual (V617F) en el gen JAK2 en células hematopoyéticas de varios síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC), siendo esta mutación más frecuente en policitemia vera (65-97%), en trombocitemia esencial (25-55%) y en mielofibrosis idiomática crónica (35-57%). La mutación da lugar a una activación constitutiva de JAK2, y se piensa que juega un papel importante en el desarrollo de las patologías neoplásicas reseñadas anteriormente. UTILIDAD CLÍNICA La detección la mutación en JAK2 tiene un valor de apoyo diagnóstico en los SMPC. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se obtiene ADN genómico a partir de la sangre periférica o médula ósea tras la lisis de los eritrocitos. Se realiza una amplificación mediante PCR específica de alelos a partir de ADN genómico de la región correspondiente al exon 14 del gen, con los siguientes oligonucleótidos: TGCATCTTTATTATGGCAGAG, TACACTGACACCTAGCTGTG y TTGGTTTTAAA- TTATGGAGTATATT. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Se detecta una banda control en todas las muestras. En las muestras positivas para la presencia de la mutación se detecta una banda adicional de menor tamaño. Se utiliza siempre un control positivo que contiene un 10% de celularidad positiva para la mutación. Línea celular positiva para la presencia de la mutación: HEL Línea celular negativa: HL60 REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre periférica entre 1-4 ml en tubos de EDTA Médula ósea: entre 0,5-2 ml en tubo de EDTA VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados se expresan de la siguiente manera: - La muestra es negativa para la presencia de la mutación V617F en JAK2. - La muestra es positiva para la presencia de la mutación V617F en JAK2. Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 17 de 127

18 La presencia de mutación es altamente sugerente de la presencia de una neoplasia mieloide, pero los datos deben corroborarse con otros aspectos clínicos y patológicos. La ausencia de mutación no excluye la presencia de un síndrome mieloproliferativo crónico u otra neoplasia. La sensibilidad de la técnica está entre 2 y 5%. Precauciones Un resultado positivo no es específico de un diagnóstico en particular y debe de existir una correlación clínico-patológica en todos los casos. Un resultado negativo no excluye la presencia de un síndrome mieloproliferativo crónico u otra neoplasia. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 3 y 20 días laborables. La prueba se realiza una vez a la semana. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Baxter et al. Lancet (2005) 365: James et al. Nature (2005) 434: Kralovics et al N Engl J Med (2005) 352: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 18 de 127

19 MUTACIÓN JAK-2 (EXÓN 12) INFORMACIÓN CLÍNICA El gen JAK2 (Janus kinase 2) codifica una tirosin kinasa intracelular (JAK2), que se asocia con la parte citoplásmica de varios receptores transmembrana de citokinas y factores de crecimiento. La unión de estos receptores con su ligando extracelular da lugar a la multimerización del receptor y el reclutamiento de JAK2, que los activa por transfosforilación. Esta activación permite la unión de un factor de transcripción STAT5, que estaba en estado latente, y que también es fosforilado por JAK2. STAT5 fosforilado se dimeriza y se transloca hacia el núcleo celular, iniciando la transcripción de genes implicados en el crecimiento celular y la diferenciación. En el año 2005 se identificó la presencia de una mutación puntual (V617F) en el gen JAK2 en células hematopoyéticas de varios síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC), siendo esta mutación más frecuente en policitemia vera (65-97%), en trombocitemia esencial (25-55%) y en mielofibrosis idiomática crónica (35-57%). La mutación da lugar a una activación constitutiva de JAK2, y se piensa que juega un papel importante en el desarrollo de las patologías neoplásicas reseñadas anteriormente. En los casos donde no se detecta la mutación V617F, especialmente en sospecha de policitemia vera, podría estar indicado clínicamente un mayor estudio de JAK2. Se han detectado mutaciones que afectan al exón 12 de JAK2, que pueden ser de tipo puntual o pequeñas inserciones o deleciones. La mayoría de estas alteraciones se asocian con policitemia vera (aproximadamente un 4% de los casos de policitemia vera) y en menor frecuencia aún en mielofibrosis idiopática. UTILIDAD CLÍNICA La detección la mutación en JAK2 tiene un valor de apoyo diagnóstico en los SMPC. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se purifican eritrocitos a partir de sangre periférica mediante un gradiente de ficoll. Se obtiene ADN genómico a partir de los eritrocitos o de médula ósea tras la lisis de los eritrocitos. Se realiza una amplificación mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las regiones a estudio. Se utiliza un control negativo en cada estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto de PCR es secuenciado utilizando uno de los oligonucleótidos con los que se amplificó la muestra. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos y manualmente para determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen. El ensayo para detectar mutaciones mediante secuenciación tiene una sensibilidad analítica teórica del 15-20%. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre periférica entre 1-4 ml en tubos de EDTA Médula ósea: entre 0,5-2 ml en tubo de EDTA VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados se expresan de la siguiente manera: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 19 de 127

20 - La muestra es negativa para la presencia de mutación en el exón 12 de JAK2. - La muestra es positiva para la presencia de mutación en el exón 12 de JAK2. Se incluirá una descripción de la mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada. La presencia de mutación es altamente sugerente de la presencia de una neplasia, pero los datos deben corroborarse con otros aspectos clínicos y patológicos. La ausencia de mutación no excluye la presencia de un síndrome mieloproliferativo crónico u otra neoplasia. Precauciones La sensibilidad de este ensayo es menor que la prueba para la detección de JAK-2 (V617F) puesto que se realiza mediante secuenciación (sensibilidad aproximada 20% frente a sensibilidad del 1-5% en la prueba para determinar V617F). La mutación V617F debe realizarse siempre primero ya que la carga mutacional puede ser muy baja en algunos especímenes. Un resultado negativo no excluye la presencia de una mutación, que puede estar presente, pero por debajo de los límites de detección del ensayo. Para aumentar la sensibilidad del estudio, algunos autores sugieren que éste se debería realizar en muestra de médula ósea del paciente. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 7 y 20 días laborables. La prueba se realiza una vez a la semana o cada 10 días, aproximadamente. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Baxter et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders Lancet (2005) 365: James et al. Nature (2005) 434: Kralovics et al N Engl J Med (2005) 352: Scout, LM et al. JAK2 Exon 12 Mutations in Polycythemia Vera and Idiopathic Erythrocytosis. N Engl J Med 2007; 356: Tefferi A and Vainchenker W. Myeloproliferative neoplasms: molecular pathophysiology, essential clinical understanding, and treatment strategies J Clin Oncol (2011)29: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 20 de 127

21 MUTACIÓN MPL (EXONES 10 Y 11) INFORMACIÓN CLÍNICA El gen MPL, localiczado en la región cromosómica 1p34, codifica para el receptor de la trombopoietina. MPL es clave para el crecimiento y la supervivencia de los megacariocitos. Se han descrito mutaciones (tales como la S505N) que implican ganancia de función, asociadas con trombocitosis familiar. También se ha descrito un polimorfismo (K39N), presente en el 89% de la población de raza negra y que está asociado con un recuento de plaquetas alto. Se han descrito asimismo, aunque con una frecuencia muy baja, mutaciones somáticas en el gen MPL, estando limitadas principalmente a pacientes con neoplasias mileoproliferativas, aunque también se han observado en pacientes con leucemia aguda megacariocítica. Las mutaciones somáticas más frecuentemente descritas son mutaciones en los aminoácidos W515 y en S505, en el exón 10 del gen. La mutación W515L fue la primera descrita en 2006, en pacientes con mielofibrosis primaria y con mutación de JAK2 V617F negativa. En modelos animales (ratón), esta mutación induce un síndrome mieloproliferativo con trombocitosis. Posteriormente se describieron las mutaciones W515K, W515S y S505N en pacientes con trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria, con frecuencias aproximadas del 3% en pacientes con trombocitemia esencial y de <10% en los pacientes con mielofibrosis primaria. Las mutaciones en MPL se han asociado con edad avanzada, sexo femenino, bajo nivel de hemoglobina y recuento de plaquetas alto, lo que sugiere que los efectos provocados por esta mutación son diferentes de los que ocurren debido a mutaciones en JAK2. La presencia de mutación en MPL no parece tener efecto sobre la supervivencia, ni en transformación leucémica o a fibrosis. UTILIDAD CLÍNICA Es útil como apoyo diagnóstico en síndromes mieloproliferativos sugerentes de trombocitemia esencial o mielofibrosis primaria, que previamente se han demostrado negativos para la mutación de JAK2 V617F. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se purifican eritrocitos a partir de sangre periférica mediante un gradiente de ficoll. Se obtiene ADN genómico a partir de los eritrocitos o de médula ósea tras la lisis de los eritrocitos. Se realiza una amplificación mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las regiones a estudio (exones 10 y 11 del gen MPL). Se utiliza un control negativo en cada estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto de PCR es secuenciado utilizando uno de los oligonucleótidos con los que se amplificó la muestra. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos y manualmente para determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen. El ensayo para detectar mutaciones mediante secuenciación tiene una sensibilidad analítica teórica del 15-20%. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre periférica entre 1-4 ml en tubos de EDTA Médula ósea: entre 0,5-2 ml en tubo de EDTA VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 21 de 127

22 Los resultados se expresan de la siguiente manera: - La muestra es negativa para la presencia de mutaciones en los exones 10 y 11 del gen MPL. - La muestra es positiva para la presencia de mutación. Se incluirá una descripción de la mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada. La presencia de mutación es altamente sugerente de la presencia de una neplasia, pero los datos deben corroborarse con otros aspectos clínicos y patológicos. La ausencia de mutación no excluye la presencia de un síndrome mieloproliferativo crónico u otra neoplasia. Precauciones La sensibilidad de este ensayo es menor que la prueba para la detección de JAK-2 (V617F) puesto que se realiza mediante secuenciación (sensibilidad aproximada 20% frente a sensibilidad del 1-5% en la prueba para determinar V617F). La mutación V617F debe realizarse siempre primero ya que la carga mutacional puede ser muy baja en algunos especímenes. Un resultado negativo no excluye la presencia de una mutación, que puede estar presente, pero por debajo de los límites de detección del ensayo. Para aumentar la sensibilidad del estudio, algunos autores sugieren que éste se debería realizar en muestra de médula ósea del paciente. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 7 y 30 días laborables. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Ding J, Komatsu H, Wakita A, et al. Familial essential thrombocythemia associated with a dominantpositive activating mutation of the c-mpl gene, which encodes for the receptor for thrombopoietin. Blood. 2004;103: Pikman Y, Lee BH, Mercher T, et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 2006;3: Tefferi A and Vainchenker W. Myeloproliferative neoplasms: molecular pathophysiology, essential clinical understanding, and treatment strategies J Clin Oncol (2011)29: Tefferi A and Vardiman JW Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms Leukemia (2008) 22, Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 22 de 127

23 TRANSLOCACIÓN TEL-AML1 INFORMACIÓN CLÍNICA La leucemia aguda linfoblástica (LAL) es un grupo heterogéneo de enfermedades originadas a partir de células progenitoras B o T, que pueden ser clasificadas en base a criterios inmunológicos y moleculares. La identificación de alteraciones moleculares asociadas a la trasformación leucémica ha aportado, no solo información biológica, sino que también marcadores clínicos relevantes tanto para el pronóstico de subgrupos, como para la monitorización de enfermedad mínima residual. La translocación t(12;21)(p13;q22) es el reordenamiento detectado más comúnmente en niños con leucemia aguda linfoblástica, ocurriendo aproximadamente en un 25% de los casos. Es especialmente frecuentemente entre 2 y 5 años de edad al diagnóstico aunque el rango de edad puede variar entre 1 y 12 años. Por debajo de un año de edad nunca se ha descrito y por encima de los 12 años la frecuencia es menor de un 2%. Esta translocación implica la fusión del gen TEL (ETV6) en el cromosoma 12 con el gen AML1 (CBFA2) en el cromosoma 21. La unión se produce entre el exón 5 de TEL y los exones 2 o 3 de AML1 produciendo dos tipos de transcrito de fusión. Esta tranlocación no puede ser detectada mediante análisis citogenéticos, por lo que su presencia sólo puede determinarse mediante FISH o PCR. UTILIDAD CLÍNICA El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de leucemia aguda linfoblastica infantil al diagnóstico, en el que también se analiza la presencia de las tanslocaciones E2A-PBX1, MLL- AF4 y BCR-ABL. Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa para determinar la efectividad del tratamiento y prevenir una posible recaída. Actualmente la presencia de la translocación TEL-AML1 tiene valor pronóstico favorable en los pacientes con LAL. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se prepara cadn de la muestra a estudio. El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1 (van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el protocolo y preparado de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento amplificado se secuenciará para confirmar el resultado. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la significación de los mismos. Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 23 de 127

24 Los resultados se expresan de la siguiente manera: - La muestra es positiva para la presencia de la translocación t(12;21) (TEL/AML1) - No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada. TIEMPO DE RESPUESTA Entre 7 y 20 días laborables. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible. BIBLIOGRAFÍA Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 24 de 127

25 TRANSLOCACIÓN MLL-AF4 INFORMACIÓN CLÍNICA La leucemia aguda linfoblástica es un grupo heterogéneo de enfermedades originadas a partir de células progenitoras B o T, que pueden ser clasificadas en base a criterios inmunológicos y moleculares. La identificación de alteraciones moleculares asociadas a la trasformación leucémica ha aportado, no solo información biológica, sino que también marcadores clínicos relevantes tanto para el pronóstico de subgrupos, como para la monitorización de enfermedad mínima residual. La translocación t(4;11)(q21;q23) se observa en un 50-70% de LAL infantiles y en aproximadamente un 5% de LAL en adultos y pediátricas. Su presencia se asocia a fenotipo pro-b y coexpresion de antígenos de diferenciación mieloide además del antígeno NG2. Esta translocación implica el gen MLL en el cromosoma 11 y el gen AF4 en el cromosoma 4. Los puntos de ruptura más frecuentes ocurren entre los exones 8 y 12 en MLL y entre los exones 4 y 7 de AF4. En función del la combinación de los puntos de unión entre ambos genes se determina el tipo de transcrito de fusión. El gen MLL está implicado en más de 30 tipos diferentes de translocaciones relacionadas con LAL precursor B, LAM, síndrome mielodisplasico, algunos casos de LAL-T y leucemia secundaria. En algunos casos esta tranlocación no puede ser detectada mediante analisis citogenéticos, por lo que su presencia sólo puede determinarse mediante FISH o PCR. UTILIDAD CLÍNICA El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de leucemia aguda linfoblástica infantil al diagnóstico, en el que también se analiza la presencia de las tanslocaciones TEL-AML1, E2A- PBX1 y BCR-ABL. Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa para determinar la efectividad del tratamiento y prevenir una posible recaída. Actualmente la presencia de la translocación MLL-AF4 tiene valor pronóstico adverso en los pacientes con ALL. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Se prepara cadn de la muestra a estudio. El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1 (van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el protocolo y preparado de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento amplificado se secuenciará para confirmar el resultado. REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE Ninguna en especial REQUISITOS DE LA MUESTRA Sangre, médula ósea anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado VALORES DE REFERENCIA No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01 Página 25 de 127