Módulo 5 Conservación y Control

Transcripción

1 Módulo 5 Conservación y Control Las fermentaciones producidas por las bacterias ácido lácticas se han reconocido desde la antigüedad. Se han utilizado diferentes cultivos en muchas partes del mundo con la finalidad de mejorar características en el almacenamiento, palatabilidad y valores nutrimentales de los alimentos perecederos tales como leche, verduras, carne, pescado, legumbres y cereales. Los microorganismos que producen este tipo de fermentación, las bacterias ácido lácticas, han tenido un importante papel en la conservación de los alimentos, en la prevención de enfermedades a través del consumo de alimentos, e indirectamente, en la alimentación de personas desnutridas en todos los continentes. En los países desarrollados, las bacterias ácido lácticas principalmente se han asociado con los productos lácteos fermentados, tales como queso, mantequilla, y yogurt. La utilización de cultivos iniciadores se ha vuelto toda una industria desde el siglo pasado. Debido a esto, los aspectos tecnológicos de la fermentación ácido láctica se han cubierto tanto en el aspecto de la investigación, como en el de capacitación, en el campo de la ciencia de los alimentos. Desde épocas ancestrales, las bacterias ácido lácticas se han asociado con efectos benéficos para la salud. En la actualidad, un número creciente de alimentos benéficos y los llamados alimentos funcionales, así como preparaciones farmacéuticas promotoras de la salud utilizan las características de ciertas especies de bacterias ácido lácticas. Algunas bacterias lácticas, sobre todo especies de lactobacilos se han identificado como bacterias probióticas, las cuales tienen la capacidad de colonizar el intestino humano, confiriendo protección ante algunos microorganismos patógenos, interactuando con el sistema inmunológico mediante las células dendríticas, provocando la inactivación de actividades de otras especies sobre éstas y favoreciendo la buena digestión de los alimentos, entre otras características. Para que una bacteria sea considerada como probiótica, debe cubrir ciertos requisitos como son: resistir el paso a través del tracto gastrointestinal, y la presencia de fenol, producir sustancias antimicrobianas, ser capaz de crecer en un medio con sales biliares, y no presentar resistencia a antibióticos; entre otras características. Los microorganismos probióticos se pueden encontrar comúnmente en productos fermentados, por ejemplo leche, productos lácteos, yogurt de soya, carne, vino, yuca; con toda seguridad también en el pulque y ciertos quesos. Además, se han aislado a partir de heces de puerco, humanas, de niños y leche bronca de vaca. Existe una amplia evidencia de experimentos realizados en los laboratorios, que comprueban que la ingesta de microorganismos probióticos, especialmente bacterias ácido lácticas y bifidobacterias, alivian o previenen varios desórdenes como la intolerancia a la lactosa y la diarrea por rotavirus, reducen la incidencia de enterocolitis necrosante neonatal, disminuyen la duración de la diarrea gastroentérica, reducen el nivel de colesterol en sangre, tienen un efecto positivo en el sistema inmunológico de niños con VIH y reducen la 111

2 recurrencia de diarrea provocada por Clostridium difficile, entre otros beneficios reportados. La secuenciación genómica de Bifidobacterium longum, Lactobacillus plantarum WCFS1, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus johnsonnii, Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus rhamnosus proveen de información acerca de la actividad potencial como bacterias benéficas para el hospedero. Se define como alimento funcional aquellos que pueden satisfactoriamente demostrar que afectan benéficamente una o más funciones del organismo humano, mas allá de los efectos nutricionales adecuados, en una forma relevante para mejorar el estado de salud y la reducción de enfermedades. De esta manera, los alimentos fermentados que contienen probióticos, prebióticos (ingredientes del alimento que no son digeribles y que tienen un efecto benéfico en la salud del hospedero mediante la estimulación selectiva de crecimiento o actividad de una o algunas bacterias en el colon), o ambos, son considerados alimentos funcionales. En la actualidad, el desarrollo de nuevos productos para la industria alimenticia está enfocado a crear alimentos funcionales que confieran al consumidor una propiedad extra que beneficie su salud. Es necesario realizar correctamente técnicas microbiológicas confiables para enumerar microorganismos viables en estos productos, en los cuales el beneficio adicional, depende precisamente del número de microorganismos viables. Como parte fundamental de un buen control de calidad de los procesos en la industria alimentaria, se requiere de respaldar analíticamente la estimación de de microorganismos presentes en los alimentos funcionales de aquellos considerados como probióticos, ya que la legislación mexicana, así como la internacional, coinciden en que para que dichos microorganismos aporten beneficios al consumidor, es requisito que se encuentren en el alimento funcional en cierto número y no menor. De igual manera, como parte del control de calidad, por ejemplo, en la industria que elabora leches fermentadas, es importante enumerar confiablemente las bacterias lácticas que se han añadido a la leche con la finalidad de obtener productos con características mejoradas en el almacenamiento, palatabilidad y/o valores nutrimentales. Errores en la proporción de los microorganismos iniciadores o bien, la utilización de cepas no adecuadas dará como resultado productos terminados de pobre calidad. Referencias: (2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3 th ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA. Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España. 112

3 Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. 113

4 Objetivos: Determinar microorganismos viables en alimentos inoculados intencionalmente. Aplicar métodos de enumeración para establecer la presencia de microorganismos viables y/o con características probióticas. En el caso de microorganismos probióticos, correlacionar la estimación de la cifra de microorganismos presente obtenida con la calidad del producto para concluir acerca de posibles efectos benéficos para la salud del consumidor. En el caso de microorganismos viables, correlacionar la estimación de la cifra de microorganismos presente obtenidos para concluir acerca de la calidad del producto. Ejercicio: 1. Con base en bibliografía especializada, qué grupo o grupos de microorganismos de control, viables o probióticos, se sugiere analizar para el alimento que se le asignó? 2. Cuáles son los límites o especificaciones microbiológicas recomendadas en bibliografía especializada para que las bacterias viables o probióticas presenten efectos benéficos para la salud del consumidor? 3. A qué nicho de consumidores se recomendaría el consumo del alimento analizado adicionado de microorganismos viables y/o con características probióticas que analizaste y por qué? 114

5 Estimación de la cifra de microorganismos presentes en yogurt OBJETIVOS: Aplicar el método de enumeración de microorganismos característicos en yogurt mediante la técnica de cuenta en placa a 37 ºC. Comprobar que en el yogurt los microorganismos característicos están viables y presentes.. GENERALIDADES La fermentación desde el punto de vista económico, es un método temporal de conservación de los alimentos. De ahí que, desde hace tiempo se utilizan cultivos iniciadores lácticos con fines comerciales para realizar los procesos de fermentación de forma controlada, sobre todo en productos lácteos. Las bacterias ácido lácticas (LAB) constituyen un grupo de bacterias grampositivas que se han unido debido a sus características morfológicas, metabólicas y fisiológicas. La descripción general de las bacterias incluye en este grupo a cocos o bacilos gram-positivo, no esporulados, que produce ácido láctico como producto terminal debido a la fermentación de los carbohidratos. La fermentación del alimento por bacterias ácido lácticas principalmente, aunque también las levaduras y otros microorganismos pueden estar involucrados, depende además, de la concentración de las sales y otros factores en el medio. Existen muchas clases de medios selectivos y diferenciales disponibles para caracterizar las bacterias ácido láctico viable. El agar MRS y M17 son medios de cultivo ampliamente recomendados para estimar el número de bacterias lácticas viables en yogurt, Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus. La mayoría de los biotipos de S. thermophilus no forma colonias viables en el MRS acidificado en diluciones que normalmente se utilizan para la estimación de la cifra de microorganismos presente de bulgaricus, y por otra parte, la mayoría de los L. bulgaricus no forman colonias visibles en placas de agar M17 en las diluciones que normalmente se utilizan para efectuar cómputos de S. thermophilus. El L. bulgaricus es un microorganismo mesofílico de forma lenticular y colonias generalmente en forma puntiaguda, con diámetro de 1-3 mm, en medio MRS acidificado. Su apariencia microscópica corresponde a la de bacilos generalmente largos, no esporulado, gram-positivo, catalasa-negativo. El S. thermophilus es un microorganismo termofílico que forma colonias lenticulares de 1-2 mm en el medio M 17. Su apariencia microscópica corresponde a células ovoides o esférica, µm, en forma de pares o cadenas largas, gran-positivo, catalasa-negativo. 115

6 FUNDAMENTO El principio del método de prueba, consiste en inocular diluciones decimales de la muestra en: 1. agar MRS acidificado, seguido de incubación aneróbica a 37ºC/72 hr, para la estimación de la cifra de microorganismos presente de L. bulgaricus. 2. agar M17, seguido por incubación aeróbica a 37 ºC/48hr para la estimación de la cifra de microorganismos presente de S. thermophilus. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz Erlenmeyer de 250,0 ml con tapa rosca conteniendo 90,0 ml de solución amortiguadora de peptonas a. 6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 ml de solución amortiguador de peptonas a. 1 matraz de 500,0 ml con 250,0 ml de medio MRS acidificado a. 1 matraz de 500, ml con 250,0 ml de medio M17 completo a. SOLUCIONES Y REACTIVOS Colorantes para Tinción de Gram d. MATERIALES Y EQUIPO Incubadora 37 ± 1ºC a. Motor para licuadora estéril o Stomacher a. Agitador de tubos tipo vortex a. Contador de colonias c,d. Baño de agua con control de temperatura de 45 ± 1 ºC a. 6 pipetas graduadas de 1,0 ml a. 1 pipetas graduada de 10,0 ml a. 16 cajas de Petri a. Espátula de metal a Microscopio óptico d. Asa bacteriológica d. Portaobjetos d. NOTAS a b c d Material necesario al inicio de la práctica. Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica. Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica. Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica. 116

7 PROCEDIMIENTO 1. Preparación de la muestra y porción de prueba. NOTAS Antes de abrir el envase del yogurt, limpiar la superficie externa que rodea la parte por la cual la muestra será tomada, con el objeto de retirar cualquier material que pueda contaminar la muestra. Desinfectar el área de trabajo con etanol al 70% (v/v) para prevenir futura contaminación, Abrir el envase asépticamente. En esta etapa es importante obtener no solamente una dilución homogénea, sino poder fragmentar las cadenas de estreptococos y lactobacilos en células individuales o cadenas cortas para que en el resultado sea posible expresar la estimación de la cifra de microorganismos presente de viables por gramo de muestra Yogurt natural. Mezclar el contenido del envase con espátula estéril. Pesar 10,0 a 10,1 g de la muestra en un recipiente adecuado Yogurt con fruta ó cereales Licuar el contenido del yogurt durante un minuto utilizando stomacher. Pesar 10,0 a 10,1 g de la muestra. 2. Preparación de la primera dilución. NOTA Añadir la solución amortiguadora de peptonas a la porción de prueba hasta que la masa de la porción de ensayo y diluyente sea de 50 g, homogeneizar durante un minuto. Llevar a 100,0 g con el mismo diluyente para obtener la dilución 1: Preparación de diluciones decimales. Realizar diluciones seriadas en tubos con 9,0 ml de solución amortiguadora de peptonas añadiendo 1,0 ml de la primera dilución al primer tubo. Repetir esta operación hasta obtener la dilución requerida (10-7 ) utilizando una pipeta diferente para cada dilución. 117

8 4. Inoculación e incubación. El tiempo máximo entre la inoculación de las diluciones y el vertido en cajas petri, no debe exceder de 15 min. Colocar un ml de las cuatro últimas diluciones duplicado en cajas Petri. Para S. thermophilus, verter ml de M17 mantenido a 45 ± 1ºC en un baño de agua. Para L. bulgaricus, verter ml de MRS acidificado mantenido a 45 ± 1ºC en un baño de agua. Mezclar cuidadosamente, y dejar solidificar en una superficie horizontal las cajas Petri en posición invertida. Incubar las placas destinadas para la numeración de L.bulgaricus a 37 ± 1ºC durante 72 h. en jarra de aneorobiosis (atmósfera de 90 % nitrógeno y 10 % CO2). No apilar más de 6 cajas Petri. Incubar las placas destinadas para la enumeración de S. thermophilus 37 ± 1ºC durante 48 h. 5. Cómputo de colonias. Después del periodo de incubación especificado, contar las colonias que muestren las características para cada microorganismo en las placas que tengan de colonias. Evitar contabilizar la materia extraña utilizando un lente de ampliación. 6. Confirmación. Teñir estas colonias utilizando el método de Gram, y confirmar que no son formadoras de esporas. Bacilos Gram-positivo, catalasa-negativo para aquellos que crecen en el medio MRS, y cadenas de cocos o diplococos Gram-positivo, catalasa-negativo en el caso de que crezcan en el medio M17. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS. Utilizar las cuentas de las placas que contengan colonias. El número de microorganismos característicos por gramo es igual a: Σ C / (n1 + 0,1n2) d Donde: C: Es la suma de colonias contadas en las placas n1 y n2. n1: Es el número de placas contadas en la menor dilución. n2: Es el número de placas contadas en la mayor dilución. d: Es la dilución en la cual la primer cuenta se obtuvo. NOTA Si hay más de dos diluciones contables, la fórmula se modifica: Así para tres diluciones: 118

9 Σ EC / (n1 + 0,1n2 + 0,1n3) d Redondear el resultado obtenido en a dos cifras significativas. Para un número de tres dígitos, redondear el tercer dígito al cero más cercano. Si el tercer dígito es cinco redondear el dígito hacia abajo en caso de que los dos primeros dígitos sean número par, y al dígito superior en caso de que los dos primeros dígitos sean número impar, por ejemplo: Para 234 redondear a Si existen solamente cuentas menores de 10, reportar el número de microorganismos por gramo como menor que, siendo el valor correspondiente a la menor dilución. El número total de microorganismos característicos por gramo de yogurt. Nl + Ns Donde: Nl Ns Es el número de L. bulgaricus por gramo. Es el número de S. thermphilus por gramo. Ejemplo: Asumir que la estimación de la cifra de microorganismos presente L. bulgaricus dio los siguientes resultados en dos cajas de Petri por dilución: 10-5, 295 y 245 colonias, 10-6, 33 y 40 colonias, Σ C/(n1 + 0,1n2) d = /(2 + 0,1 x 2) 10-5 = 613 / 2.2 x 10-5 = 278,6 x 10 5 Con el redondeo el número estimado de L. bulgaricus es 2,8 x 10 7 UFC/ g de yogurt. BIBLIOGRAFÍA (2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3 th ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA. Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. De Man. J.C. Rogosa, M & Sharpe, M. E. (1960). J. Applied Bacteriology. 23,

10 International IDF Standard 117 A. Yogurt, enumeration of characteristic microorganisms colony count technique at 37ºC. 120

11 Medios de Cultivo Solución amortiguadora de peptonas (cuentas viables en yogurt) Peptona 1 (digerido tríptico de caseína) 0,5 g Peptona 2 (digerido tríptico de carne) 0,5 g Agua 1,0 L ph final 25 C 7,0 ± 0,2 Disolver las peptonas en agua. Distribuir la solución en porciones de 90,0 o 9,0 ml en recipientes según se requiera. Esterilizar a 121 ºC / 15 min. NOTA La mezcla de peptonas de este tipo (peptona 1 y 2), se consigue en forma comercial con el nombre de polipeptonas. Reactivos para ajustar el ph Hidróxido de sodio (Na OH), aproximadamente 0,1 mol/l de solución. Acido clorhídrico (HCl) aproximadamente 0.1 mol/l de solución. Agar MRS acidificado Peptona de caseína Extracto de malta Extracto de levadura Dextrosa Tween 80 (sorbitán mono-oleato) Fosfato dipótasico (K 2 HPO 4 ) Acetato de sodio trihidratado (CH 3 CO 2 Na) 3. 3 H 2 O Citrato de amonio [C 6 H 6 O 7 ( NH 4 ) 2 ] Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO 4.7H 2 O) Sulfato de manganeso heptahidratado (MnSO 4.7H 2 O) Agar bacteriológico 10,0 g 10,0 g 5,0 g 20,0 g 1,0 ml 2,0 g 2,0 g 2,0 g 0,2 g 0,05 g 15,0 g Reactivos para ajustar el ph Acido acético (CH 3 COOH), 100% glacial. Disolver los componentes en un baño de agua. Enfriar a 50 ºC y añadir ácido acético para ajustar el ph, comprobar por medio de potenciómetro, de tal forma que después de esterilizado llegue a 5,4 a temperatura ambiente. Distribuir en porciones de 500,0 ml. Esterilizar a 121º C durante 15 min. 121

12 Principio de acción La peptona es fuente de carbono y nitrógeno. El extracto de levadura es fuente de elementos traza, vitaminas y amino ácidos. La dextrosa es fuente de carbohidratos que proporciona carbono. El acetato de sodio y citrato de amonio, inhiben los estreptococos, hongos y otros microorganismos. El sulfato de magnesio y sulfato de manganeso son fuente de iones inorgánicos. El tween 80 actúa como surfactante. Medio M17 Medio básico: Peptona 1 (digerido tríptico de caseína) Peptona 2 (digerido péptico de carne) Peptona 3 (digerido papaínico de soya) Extracto de levadura Extracto de carne Sal disódica del β- glicerofosfato (C 3 H 7 O 6 PNa 2 ) Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO 4.7H 2 O) Acido ascórbico Agar bacteriológico Agua 2,50 g 2,50 g 5,00 g 2,50 g 5,00 g 9,00 g 0,25 g 0,50 g 15,0 g 950,0 ml Disolver los componentes en agua hirviendo enfriar a 50ºC y ajustar el ph, utilizando los reactivos para ajustar el ph de tal forma que después de esterilizado llegue a 7,1-7,2 a temperatura ambiente. Transferir el medio en porciones de 95,0 ml en frascos de 150,0 ml de capacidad. Esterilizar a 121ºC/15 min. Solución de lactosa: Lactosa Agua 10,0 g 100,0 ml Disolver la lactosa en agua. Esterilizar a 121ºC/ 15 min. Medio completo: Medio básico Solución de lactosa 950,0 ml 5,0 ml Inmediatamente antes de utilizar, fundir el medio básico en un baño de agua hirviente y enfriar a 48-50ºC. Calentar la solución de lactosa a 48-50ºC. Añadir la solución de lactosa al medio básico y mezclar. Mantener el medio en un baño de agua (48-50ºC) hasta su utilización. Principio de acción. 122

13 El agar M17 contiene peptonas y carne que son fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales. El extracto de levadura proporciona vitaminas del complejo B que estimula al crecimiento bacteriano. La sal disódica del β- glicerofosfato amortigua el ácido que se produce por la fermentación de la lactosa. El ácido ascórbico estimula el crecimiento de estreptococos lácticos. El sulfato de magnesio provee de iones esenciales para el crecimiento. El agar es el agente solidificante. 123

14 Estimación de la cifra presente de Lactobacillus casei o de Lactobacillus acidophilus OBJETIVO Estimar la cifra presente de Lactobacillus casei o de Lactobacillus acidophillus, en asociación o no, con Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, y Bifidobacterium, en productos lácteos. FUNDAMENTO El principio del método de prueba, consiste en inocular diluciones decimales de la muestra en 1. agar MRS acidificado adicionado con clindamicina, seguido de incubación aneróbica a 37ºC/72 h., para la estimación de la cifra de microorganismos presente de L. acidophillus. 2. agar MRS acidificado adicionado con sales biliares, seguido de incubación aneróbica a 37ºC/72 h., para la estimación de la cifra de microorganismos presente de L. casei. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz Erlenmeyer de 250,0 ml con tapa rosca conteniendo 90,0 ml de solución de triptona sal a. 6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 ml de solución de triptona sal a. 1 matraz de 500,0 ml con 250,0 ml de medio MRS + clindamicina acidificado a (para enumeración de L. acidophilus). 1 matraz de 500,0 ml con 250,0 ml de medio MRS + oxgall acidificado a (para enumeración de L. casei). SOLUCIONES Y REACTIVOS Colorantes para Tinción de Gram d. MATERIALES Y EQUIPO Incubadora 37 ± 1ºC a. Motor para licuadora estéril o Stomacher a. Agitador de tubos tipo vortex a. Contador de colonias c,d. Baño de agua con control de temperatura de 45 ± 1 ºC a. 5 pipetas graduadas de 1,0 ml a. 124

15 1 pipetas graduada de 10,0 ml a. 6 cajas de Petri a. Espátula de metal a Microscopio óptico d. Asa bacteriológica d. Portaobjetos d. NOTAS a b c d Material necesario al inicio de la práctica. Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica. Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica. Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica. PROCEDIMIENTO Preparación de la muestra y porción de prueba. NOTAS Para productos con frutas, únicamente tomar la masa sin la fruta, porque la masa sola contiene las bacterias lácticas viables. En el caso de producto sólidos, homogeneizar el producto que se va analizar haciendo 8 (una docena de veces) con ayuda de una pipeta estéril. Eliminar esta pipeta. De ninguna manera utilizar la pipeta para efectuar las demás diluciones porque contiene producto en el interior y exteriormente. En el caso de productos líquidos, homogeneizar agitando en forma de arco durante 1 min. Para la preparación de la muestra, realizar la primera dilución tomando aproximadamente 10,0 ml de producto y trasvasarlo asépticamente en 90,0 ml de diluyente. Enjuagar la pipeta varias veces hasta la completa disolución. Asegurar de no sumergir demasiado la pipeta dentro de la muestra con el fin de evitar agregar producto residual de las paredes externas de la pipeta. Para homogenizar las diluciones seriadas del alimento a analizar, se recomienda una rotación manual y no en vortex debido a que se pueden dañar las bacterias viables. 1. Una vez realizada la primera dilución al 10-1, desechar la pipeta después de su uso. Realizar agitaciones en arco durante 25 veces en cada dilución. 2. Realizar diluciones seriadas con la ayuda de una pipeta nueva estéril, tomar 1,0 ml de la dilución al 10-1 e introducirlo en la pared de un nuevo tubo con 9,0 ml de diluyente sin tocar este diluyente y sin enjuagar. Se obtiene una dilución al 10-2, desechar la pipeta después de utilizarla. Continuar así las diluciones sucesivas hasta Simultáneamente a las diluciones, sembrar por duplicado las 3 ultimas diluciones a razón de 1,0 ml por caja de Petri 125

16 4. Vaciar inmediatamente el medio de cultivo fundido y enfriado y homogenizar por rotación las cajas. Después de solidificar (aprox. 30 min) sobre una superficie horizontal). 5. Después de la solidificación poner las cajas en jarra de anaerobiosis (invertidas). 6. Incubar a 37ºC (+2ºC) durante 72 h. (+ 3 h) bajo atmósfera de CO 2. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS. Utilizar las cuentas de las placas que contengan colonias. Para efectuar los cálculos y expresión de resultados, consultar el protocolo de enumeración de microorganismos viables en yogurt. BIBLIOGRAFÍA (2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3 th ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA. Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. 126

17 Medios de Cultivo Triptona sal, solución de Triptona (peptona de caseína) Cloruro de sodio (NaCl) Agua destilada 1g 8,5 g 1,0 L Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar antes de la esterilización el ph para obtener 7,0 (+ 0,1) a 25º C (+ 2ºC). Repartir para tener 9,0 ml por tubo y después de la esterilización. Esterilizar durante 20 min a 121ºC (+ 2ºC). Utilizar solución de triptona sal, solo si el producto a analizar no contiene Bifidobacterium. MRS + oxgall, medio MRS, agar + 1,5 g/l de Bacto oxgall (sales biliares) Poner en suspensión 70,3 g del polvo MRS en agua destilada, añadir las sales biliares. Disolver la suspensión en baño María hirviente hasta la obtención de un líquido claro. Ajustar el ph antes de la esterilización a 5.65 (+0,1) con ácido acético glacial concentrado (alrededor de 5,0 ml) para que el ph después del autoclave sea 5,4 (+ 0,1) a 25ºC (+ 2ºC). Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121ºC (+ 2ºC). Almacenar hasta por un máximo de un mes a 4 C Principio de acción El principio selectivo de este medio reposa en la resistencia a las sales biliares de L. casei MRS + clindamicina, medio ácido. MRS (polvo comercial listo para su uso) 70,3 g Agua destilada 1,0 L Solución de clindamicina al 0,005% (clindamicina 5,0 mg, agua destilada 100,0 ml), esterilizada por filtración (0,45 µm). Almacenar máximo por un mes a 4 C. Poner en suspensión 70,3 g del polvo MRS en agua destilada. Disolver la suspensión en baño María hirviente hasta la obtención de un líquido claro. Ajustar el ph antes de la esterilización a 5.65 (+ 0,1) con ácido acético glacial concentrado (alrededor de 5,0 ml) para que el ph después del autoclave sea 5,4 (+ 0,1) a 25ºC (+ 2ºC). Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121ºC (+ 127

18 2 ºC). Añadir 0,2% de solución de clindamicina en 100, 0 ml de medio MRS, en condiciones de asepsia. Conservar máximo un mes en oscuridad a una temperatura entre 0 y 5º C. Principio de acción El principio selectivo de este medio reposa en la resistencia a la clindamicina del L. acidophilus. 128

19 Estimación de la cuenta de Bifidobacterium OBJETIVO Estimar el número presente de Bifidobacterium en las leches fermentadas en asociación o no, con Streptococcus thermophilus y Lactococcus lactis,, en productos lácteos. FUNDAMENTO El principio del método de prueba, consiste en inocular diluciones decimales de la muestra, en agar MRS neutro adicionado con dicloxacilina, seguido de incubación anaeróbica a 37ºC/120 h., para la estimación de la cifra de Bifidobacterias presente. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz Erlenmeyer de 250,0 ml con tapa rosca conteniendo 90,0 ml de solución de triptona sal cisteína a. 6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 ml de solución de triptona sal cisteína a. 1 matraz de 500,0 ml con 250,0 ml de medio MRS neutro + dicloxacilina a (para enumeración de Bifidobacterias). SOLUCIONES Y REACTIVOS Colorantes para Tinción de Gram c. MATERIALES Y EQUIPO Incubadora 37 ± 1ºC a. Motor para licuadora estéril o Stomacher a. Agitador de tubos tipo vortex a. Contador de colonias c. Baño de agua con control de temperatura de 45 ± 1 ºC a. 5 pipetas graduadas de 1,0 ml a. 1 pipetas graduada de 10,0 ml a. 6 cajas de Petri a. Espátula de metal a Microscopio óptico d. Asa bacteriológica c. Portaobjetos c. NOTAS 129

20 a b c Material necesario al inicio de la práctica. Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica. Material necesario a las 120 horas de iniciada la práctica. PROCEDIMIENTO Preparación de la muestra y porción de prueba. NOTAS Para productos con frutas, únicamente tomar la masa sin la fruta, porque la masa sola contiene las bacterias lácticas viables. En el caso de producto sólidos, homogeneizar el producto que se va analizar haciendo 8 (una docena de veces) con ayuda de una pipeta estéril. Eliminar esta pipeta. De ninguna manera utilizar la pipeta para efectuar las demás diluciones porque contiene producto en el interior y exteriormente. En el caso de productos líquidos, homogeneizar agitando en forma de arco durante 1 min. Para la preparación de la muestra, realizar la primera dilución tomando aproximadamente 10,0 ml de producto y trasvasarlo asépticamente en 90,0 ml de diluyente. Enjuagar la pipeta varias veces hasta la completa disolución. Asegurar de no sumergir demasiado la pipeta dentro de la muestra con el fin de evitar agregar producto residual de las paredes externas de la pipeta. Para homogenizar las diluciones seriadas del alimento a analizar, se recomienda una rotación manual y no en vortex debido a que se pueden dañar las bacterias viables. 1. Una vez realizada la primera dilución al 10-1, desechar la pipeta después de su uso. Realizar agitaciones en arco durante 25 veces en cada dilución. 2. Realizar diluciones seriadas con la ayuda de una pipeta nueva estéril, tomar 1,0 ml de la dilución al 10-1 e introducirlo en la pared de un nuevo tubo con 9,0 ml de diluyente sin tocar este diluyente y sin enjuagar. Se obtiene una dilución al 10-2, desechar la pipeta después de utilizarla. Continuar así las diluciones sucesivas hasta Simultáneamente a las diluciones, sembrar por duplicado las 3 ultimas diluciones a razón de 1,0 ml por caja de Petri 4. Vaciar inmediatamente el medio de cultivo fundido y enfriado y homogenizar por rotación las cajas. Después de solidificar (aprox. 30 min) sobre una superficie horizontal). 5. Después de la solidificación poner las cajas en jarra de anaerobiosis (invertidas). 6. Incubar a 37ºC (+ 2ºC) durante 120 h. (+ 3 h) bajo atmósfera de CO 2. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS. Utilizar las cuentas de las placas que contengan colonias. 130

21 Para efectuar los cálculos y expresión de resultados, consultar el protocolo de enumeración de microorganismos viables en yogurt. BIBLIOGRAFÍA (2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3 th ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA. Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. 131

22 Medios de Cultivo Triptona sal, solución de, (TSC) Triptona (peptona de caseína) Cloruro de sodio (NaCl) Clorhidrato de L-cisteina Agua destilada 1g 8,5 g 0,30 g 1,0 L Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar antes de la esterilización el ph para obtener 7,0 (+ 0,1) a 25º C (+ 2ºC). Repartir para tener 9,0 ml por tubo después de la evaporación que se presenta durante la esterilización. Esterilizar durante 20 min a 121ºC (+ 2ºC). Es recomendable regenerar los tubos de TSC durante 20+/- 5 min a 100 +/- 2 C en un baño María antes de su uso. MRS neutro + dicloxacilina, medio MRS neutro ph 6,5 + 0,1 después autoclave + 1,0 ml de solución antioxígeno + 1,0 ml de una solución al 1/10 de antibiótico dicloxacilina por cada 100,0 ml de medio de cultivo. Poner en suspensión 15 g de agar bacteriológico en un recipiente con 500,0 ml de agua destilada. Disolver la suspensión en baño María hirviente hasta la obtención de un líquido claro. Poner en suspensión 55g de polvo MRS neutro en otro recipiente con igualmente 500,0 ml de agua destilada (alrededor de 50ºC). Mezclar las dos soluciones agitando bien. Ajustar el ph antes de la esterilización a 6,5 (+ 0,1). Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121ºC (+ 2ºC). Conservar un mes máximo a la oscuridad a una temperatura entre 0 y 5º C. Solución anti oxigeno Hidrocloruro de L-cisteína Agua destilada 3,0 g 100,0 ml 132

23 Después de la disolución, esterilizar por filtración en membrana estéril de 0.45 µm. Conservación 15 días a 4ºC. (Después de este tiempo la solución pierde su efectividad). Solución de antibiótico Dicloxacilina 25,0 mg Agua 50,0 ml Después de la disolución, esterilizar por filtración sobre membrana estéril de 0,45 µm. Conservación 15 días a 4ºC. Repartir a razón de 10,0 ml en tubos estériles. Conservación 15 días a 4ºC. En el momento del empleo, efectuar una dilución al 1/10 de esta solución madre con solución de triptona sal cisteína regenerada. 133