Curso Práctico de Genética

Transcripción

1 Sección Genética Evolutiva Departamento de Biología Animal Instituto de Biología Facultad de Ciencias Curso Práctico de Genética 2010 Coordinadores Ruben Pérez y Adriana Parodi Esta guía fue elaborada por los docentes de la Sección Genética Evolutiva.

2 ANÁLISIS INFORMÁTICO DE SECUENCIAS DE ADN El objetivo de este práctico es introducir al estudiante al análisis de secuencias de ADN mediante la utilización de programas informáticos. Para esto utilizaremos bases de datos de secuencias y programas. Lea la información detalladamente y conteste a las preguntas propuestas. Las bases de datos contienen las secuencias que obtienen los investigadores de todas partes del mundo. Estas bases de datos son accesibles a todo el mundo y contienen información sobre secuencias de ácidos nucleicos o secuencias proteicas. Las secuencias de ácidos nucleicos se mantienen en tres grandes bases de datos que sirven a la comunidad científica: EMBL (European Molecular Biology Laboratory), GeneBank (the NIH genetic sequence database) y DDBJ (DNA Database of Japan). Cuando un laboratorio envía una secuencia, se crea una ficha con datos específicos que facilitan su organización. Un investigador puede comparar las secuencias que ha obtenido para establecer si existe similaridad con alguna secuencia ya existente en la base de datos. Ejercicio 1. De una biblioteca genómica humana se obtuvo la siguiente secuencia (Secuencia 1). a) Analice esta secuencia para encontrar homología con alguna secuencia ya descrita utilizando la base de datos del GeneBank: Seleccione la opción BLAST, luego Nucleotide blast e introduzca la secuencia 1 (utilice cortar y pegar). Seleccione la base de datos (database): Others Nucleotide collection (nr etc.). Puede limitar su búsqueda a humanos en la opción: Organism. SECUENCIA 1 AGGCCGCGCCCCGGGCTCCGCGCCAGCCAATGAGCGCCGCCCGGCCGGGCGTGCCCCCGCGCCCCAAGCATAAAC CCTGGCGCGCTCGCGGCCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGGTGCTGTCTCCTG CCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGG AGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCC TGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGA CCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAAGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGC TGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGC TTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCT TCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCGCGGCTTGGGCCGCACTGAC CCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCC TGCGGTGCACGCTTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAAGCTGG AGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCT GGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAGCCTGTGTGTGCCTGGGTTCTCTCTGTCCCGGAATGTGCCAACAA TGGAGGTGTTTACCTGTCTCAGACCAAGGACCTCTCTGCAGCTGCATGGGGCTGGGGAGGGAGAACTGCAGGGAG TATGGGAGGGGAAGCTGAGGTGGGCCTGCTCAAGAGAAGGTGCTGAACCATCCCCTGTCCTGAGAGGTGCCAGCC TGCAGGCAGTGGC

3 b) Obtenga información adicional sobre esta secuencia utilizando el link de Gene info (G). Realice un pequeño resumen de la información obtenida indicando en qué cromosoma se encuentra el gen y cómo está organizado el cluster que lo contiene. c) Analice esta secuencia utilizando la herramienta BLAST como procedió en a) SECUENCIA 2 ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGC CGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGATGTTCCTGTCCTTCCC CACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGT GGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCA CGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCA CCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGAC CTCCAAATACCGTTAAGCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCC CTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC d) Compare (alinear) ambas secuencias utilizando la opción Align two sequences using BLAST (bl2seq) ( localizada en la página del Blast/ Specialized BLAST. Qué conclusiones puede obtener de su análisis? Realice un esquema comparando ambas secuencias e) Indique los sitios de inicio y finalización de la traducción. Para esto establezca el marco abierto de lectura del gen a partir de la secuencia 2. Utilice la herramienta ORF finder ( Puede acceder a partir página principal del NCBI: Sequence análisis/tools/open Reading Frame Finder (ORF Finder). Indique el tamaño (en aminoácidos) de la proteína codificada. Ejercicio 2 Analice la siguiente secuencia aminoacídica y establezca que dominio conservado presenta. Para hacerlo seleccione la opción Protein blast del BLAST ( La primera ventana que aparece presenta el dominio y su localización en forma gráfica. Haga clic en el recuadro rojo que representa el dominio para obtener información adicional. MTDFFQISQKKCFRLKNPLKHQTQRANTRFRRSHPSSIDTFSNCSDFKSKFYYASMKFQSFLSNRTFSLKVNNTI SPLKHPIPSGVPQGTVSGPLLFILFINDVLLKIPPSVQVSCYADDIKIYGPSASDLQSTIDQIATWSKRNHLPLA PAKTSLLHLGPLNKLHSFTVDNIPVLPSSSVRDLGLLTDDKLTFKSHINRISSLALLRSKQILKSFSSTSPEFYV NLYKLYVSPILEYCSVVFSPPPNSKLAKTLESPLQYYSKRALQRCNIKYNSKSTVNNTSNYSQSYLNRIQILNIQ TARSLRLKAQLLLLYNILTGTAYFPDINDFVVFVSSNRRPMLLINRHPKVRNFFSQVVPIWNSIVHNSPEFLPPS SFSLLIESNICKF Obtenga información sobre las secuencias que presentan este dominio utilizando la base de datos del pubmed: Escriba en español el título o tema de dos trabajos encontrados en la base de datos acerca de este tema.

4 Ejercicio 3 La siguiente secuencia corresponde a una retrotranscriptasa de Mepraia spinolai (Hemiptera-Reduviddae). Realice un BLAST con ella y observe las similitudes que presenta con otras secuencias. Utilice primero la opción nucleotide blast y luego la opción blastx. Por qué existen diferencias en los resultados obtenidos? AGCATATCGTCGACGTAGTGGTTTGAGTTTCCTGTGATTTTTCGTTTCTAAGATATTTTGTACACACA CACATTTATATTTTGCGGTAATTTAGAATCTCAAGAAACCCTTTTAATTTATAATTGTATCACTAACT ACAATGCAGTACCGTACCAGTAACGTGTCAATACAGTCTGTAGAGCTCATATCCCATGCGACTGGAAG AAGTCAGAAATCGCTCCCATACTGAAGAAAGATAAATCCTCAAATATTCCGGAGAGTTATCGACCTAT AGCTCCTACAAGCATGTTCTCTAAGCTTTACGAGAGAATGCTCCTTGATCGCCTTCAGATATACTTAG ACAAAATGGATCTGATTTCAAACAAGCAAGCTGGTTTCAGAAAACACAGAAATACAGTTGAGCAGGCC GCCTTCCTGTCACAGGAAATAAGGAACGGTTTCAATAGGAAGCAAAGTACCCTTGCCGTCTTTATAGA TTTAAAGGCTGCGTTAGACAGAGTTTGGAGGGAGAGGCTGCTGGAAATATAGGCATCATACGTAACTT GTaCAAAAGCATGAACTCGCTCCTAGCGCTAACACTCATCAGAGTAAAGTaCAACAATGTGTTCTCCC CGTGCAAAAAAGCTGTA OTRAS UTILIDADES DE LA BASE DE DATOS DEL NCBI.- Buscador taxonómico Esta utilidad permite establecer las secuencias existentes para determinada especie. Diríjase a la página taxonómica del NCBI ( Utilice la utilidad para establecer la clasificación correcta de los siguientes organismos y obtener información sobre las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas disponibles. a) Caenorhabditis elegans, b) Arabidopsis thaliana, c) Schizosaccharomyces pombe Cuantas secuencias nucleotídicas de Arabidopsis thaliana existen en el GeneBank? VecScreen La secuencia que obtenemos puede presentar contaminación del vector en la que fue clonada. Esta utilidad (special/vecscreen) permite identificar y eliminar secuencias del vector para obtener la secuencia de interés totalmente limpia. Puede ingresar a esta utilidad desde la página central del NCBI o utilizando este link: Establezca la presencia de secuencias del vector en la siguiente secuencia. Realice un esquema indicando el tamaño de las regiones de esta secuencia que pertenecen al vector. GTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT TGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA GCGGATGTCAGGGCGGGGGAAGGGAGGCAAGGGATTGGGAAAGGGAGGCGCCAAGCGTCACCGTAAGG TGCTTCGCGATAACATTCAGGGTATCACAAAGCCAGCAATCCGGCGTTTGGCTCGTAGAGGTGGAGTC AAGCGTATCAGTGGCTTGATCTACGAGGAGACACGTGGCGTCCTGAAGATATTCTTGGAGAACGTCAT CCGTGACGCCGTGACCTACACTGAGCACGCCAGGAGAAAGACCGTGACCGCGATGGACGTCGTTTACG CTCTCAAGAGGCAGGGCAGGACTCTTTATGGATTTGGGGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACG GTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGA ACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGC

5 ALGUNAS HERRAMIENTAS PARA EL ANÁLISIS DEL ADN TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE Enzimas de restricción Las enzimas o endonucleasas de restricción son proteínas que reconocen secuencias particulares del ADN, uniéndose a ellas y cortando en sitios específicos. A partir de su descubrimiento este grupo de enzimas es empleado en el laboratorio para cortar moléculas de ADN. Las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción son generalmente de cuatro o seis pares de bases y palindrómicas, es decir que la secuencia de bases leída de 5 a 3 en ambas hebras es la misma (fig.1). Las enzimas de restricción de tipo II cortan en una posición específica del ADN dentro de su secuencia de reconocimiento, denominada sitio de restricción. EcoRI 5 GAATTC 3 HindIII 5 AAGCTT 3 3 CTTAAG 5 3 TTCGAA 5 BamHI 5 GGATCC 3 SmaI 5 CCCGGG 3 3 CCTAGG5 3 GGGCCC 5 Figura 1. Algunos ejemplos de enzimas de restricción empleadas en el laboratorio. Las flechas indican los sitios de corte. Algunas enzimas de restricción cortan cada cadena del ADN en diferente sitio, dando lugar a extremos pegajosos, mientras otras cortan en el mismo sitio ambas cadenas, dando lugar a extremos romos (fig.1). Cada enzima trabaja bajo condiciones apropiadas de concentración salina, ph y temperatura. Una molécula de ADN cortada por una determinada enzima de restricción originará una serie de fragmentos cuyo número y tamaño dependerá de la cantidad y la localización de los sitios de reconocimiento que existan para esa enzima en esa molécula de ADN. Los fragmentos generados por la digestión con enzimas de restricción pueden unirse por la acción de una enzima, denominada ADN ligasa, que forma enlaces fosfodiester entre extremos 5 y 3 de los nucleótidos. De esta forma, los extremos romos pueden unirse independientemente de la secuencia que contengan, mientras que los extremos pegajosos sólo se unirán si existe complementariedad entre las porciones de simple cadena. Las enzimas de restricción y las ADN ligasas son herramientas claves para la clonación de ADN. Esto significa que cualquier fragmento de ADN (por ejemplo un gen que codifica para una proteína) puede obtenerse tras digestión con enzimas de restricción y agregarse a un plásmido o cualquier otro vector. Este vector es introducido en una célula huésped y dentro de ésta, la molécula de ADN recombinante puede replicarse y expresarse.

6 Mapas de restricción Los fragmentos de ADN, resultantes de una digestión con enzimas de restricción, pueden ser separados por electroforesis en geles de agarosa. Este método consiste en aplicar una corriente eléctrica a través del gel, de modo que el ADN que tiene carga negativa migre hacia el electrodo positivo. La velocidad de migración dependerá del tamaño de cada fragmento. Para un fragmento lineal, esta será inversamente proporcional al log 10 de su peso molecular (fig.2). Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa. El gel se coloca en una cuba de electroforesis sumergido en el buffer de corrida. Las muestras que contienen el ADN son colocadas en pocillos en uno de los extremos del gel. Al aplicarse una corriente eléctrica, las moléculas de ADN migrarán a través del gel en función de su tamaño, desde el polo negativo al polo positivo. Un factor importante en la electroforesis es la concentración de la agarosa en el gel. Cuanto mayor es la concentración más retrasa el movimiento de todos los fragmentos. Así, se recomiendan concentraciones altas de agarosa para ver y separar fragmentos pequeños de ADN, mientras que será mejor emplear concentraciones bajas de agarosa cuando se trate de separar fragmentos grandes (tabla 1). Tabla 1 % de agarosa en el gel Rango de separación eficiente de moléculas de ADN lineal (kb) 0, , ,9 7-0,5 1,5 4-0,2 2,0 3-0,1 Tras la corrida electroforética, los distintos fragmentos de ADN así separados son visualizados por tinción. Uno de los métodos de tinción más empleados es el bromuro de etidio el cual se intercala entre las bases del ADN y fluoresce bajo la luz ultravioleta. La combinación de digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel se llama análisis de restricción. La representación de una molécula de ADN, ya sea circular o lineal, donde se indiquen los sitios de restricción que poseen, se denomina mapa de restricción (fig. 3).

7 EcoRI 1/5.541 HindIII 32 PvuII EagI 942 YIP PvuII SmaI ApaI Figura 3. Mapa de restricción del plásmido YIP5 de pb. Los números indicados después de cada enzima de restricción indican las posiciones de los sitios de corte. Ejercicio 1 Indica los tamaños de los fragmentos que obtendrías tras la digestión del plásmido YIP5 con EcoRI, con EcoRI y EagI, con HindIII y ApaI, con HindIII, ApaI y PvuII. Análisis por hibridación Para conocer si está presente una determinada secuencia de ADN (por ejemplo la correspondiente a un determinado gen) en una muestra se realiza un análisis por hibridación. Este implica separar (desnaturalizar) las moléculas de ADN de la muestra a analizar y mezclarlas con moléculas de ADN (o ARN) de cadena simple con homología con toda o parte de la secuencia que queremos buscar. Esta molécula se denomina sonda y se marca con isótopos radiactivos u otro tipo de marcaje para poder ser detectada. En condiciones apropiadas la sonda formará puentes de hidrógeno (hibridizará) con una secuencia complementaria a ella si se encuentra presente en la muestra, formando una molécula de doble cadena. Si la secuencia complementaria no se encuentra en dicha muestra, la sonda no hibridizará. Tras el período de hibridización, la muestra se lava para remover la sonda no hibridada, y la presencia de la secuencia de interés se pone de manifiesto gracias a la sonda hibridada. La desnaturalización de una molécula de ADN se lleva a cabo por métodos físicos, como el calor, o por métodos químicos, como el tratamiento con una base. Las condiciones dependerán del tamaño y de la composición de bases del ADN. La temperatura necesaria para desnaturalizar en un 50 % una molécula determinada de ADN se denomina temperatura de desnaturalización o melting. Si una muestra de ADN se hierve se desnaturalizará, es decir, sus cadenas se separarán. Si la muestra se enfría las cadenas volverán a hibridizar. Las moléculas complementarias cortas tenderán a hibridizar más rápido que las moléculas largas. Las sondas empleadas en experimentos de hibridación son de largo variable, desde cortos oligonucleótidos de 15 a 30 bases de largo, hasta cadenas de miles de bases. Las sondas se marcan por varios métodos. Algunos consisten en sintetizar la sonda en presencia de un nucleótido radiactivo. También existen métodos de marcaje no radiactivos que consisten en nucleótidos con modificaciones químicas que resultan en un producto coloreado o luminiscente luego de una reacción de detección.

8 Southern blotting Para hacer más facil la hibridización y posterior detección de la sonda, el ADN a ser analizado se transfiere a una membrana mediante un método llamado Southern blotting. Este método, junto con el análisis por hibridización, permite detectar los fragmentos de restricción que contienen una determinada secuencia de ADN. Primero la muestra de ADN a analizar se digiere con enzimas de restricción y los productos se separan por electroforesis en gel de agarosa. Una vez separados estos fragmentos son transferidos a membranas de nylon o nitrocelulosa. Para ello el gel se sumerge en una base para desnaturalizar los fragmentos de ADN y luego se coloca sobre una pieza de papel cuyos extremos se suspenden en un reservorio con una solución salina. La membrana se coloca encima del gel y encima de esta se colocan servilletas absorbentes (fig.4). Se crea así un fluido por acción capilar desde el reservorio y que atraviesa el gel arrastrando los fragmentos de ADN que entonces son transferidos a la membrana. La membrana entonces contiene el patrón de fragmentos exacto que se encontraba en el gel. Una vez transferido el ADN a la membrana, éste se fija a la membrana por calor o por exposición a UV. La membrana así preparada está pronta para someterla a hibridación con una sonda. Figura 4. Southern blotting. El ADN es cortado con enzimas de restricción y los fragmentos se separan por electroforesis en gel de agarosa. Tras la corrida, los fragmentos de ADN son transferidos a una membrana de nylon o nitrocelulosa, mediante el proceso denominado Southern blotting. La membrana resultante puede hibridarse con sondas radiactivas específicas para reconocer un ADN homólogo presente en dicha membrana que será revelado posteriormente por autorradiografía (ver más adelante). Ejercicio 2 Se muestran los mapas de restricción para las enzimas EcoRI y BamHI del ADN de un virus X. Los tamaños de los fragmentos están en kilobases (kb). Mapa EcoRI 9 5, Mapa BamHI 3 7,5 10,5 5,5

9 Imagina que has digerido este ADN con estas dos enzimas de restricción por separado y con ambas al mismo tiempo. Realiza el análisis de los productos de digestión tras una corrida de electroforesis y tinción del gel con bromuro de etidio. En el esquema del gel mostrado a continuación (a la izquierda), indica en cada carril las bandas que esperas obtener para cada muestra. Gel de electroforesis teñido Membrana de hibridación kb EcoRI BamHI EcoRI/BamHI EcoRI BamHI EcoRI/BamHI Dicho gel fue posteriormente transferido a una membrana de nylon y el ADN fue fijado. Esta membrana fue hibridada con una sonda específica que reconoce el ADN. El esquema de la derecha representa el resultado de la hibridación donde se muestran las bandas que son reconocidas por la sonda. A partir de este resultado determina la posición que ocupa el segmento empleado como sonda en los mapas de restricción. Ejercicio 3 Aquí se representan los mapas de restricción del ADN del bacteriófago lambda para tres enzimas. Dibuja las bandas que se obtendrían tras digerir con las enzimas BamHI y HindIII dicho ADN y las bandas que se visualizarían tras la hibridación con la sonda que está señalada en el mapa para EcoRI. Mapa BamHI 5,5 16,8 5,6 6,5 7,2 6,7 Mapa HindIII 23,1 2 2,3 9,4 0,6 0,1 6,5 4,4 Mapa EcoRI Sonda 21,2 4,9 5,6 7,4 5,8 3,5

10 Gel teñido Membrana hibridada kb BamHI HindIII BamHI HindIII CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS Vectores y Clonación Los plásmidos son capaces de albergar trozos extras de ADN, por lo que se abre la posibilidad de poner una secuencia de ADN determinada (por ejemplo, un gen) en un plásmido circular, generando un ADN recombinante. En estas circunstancias el plásmido está funcionando como un vector : es capaz de llevar el trozo de ADN (que denominamos inserto) manteniéndolo mediante la replicación, ya que posee un origen de replicación. Los plásmidos contienen además genes para la resistencia a antibióticos (fig. 5). Por lo tanto bacterias que contengan un plásmido que confiere resistencia a un determinado antibiótico, serán ellas también resistentes a dicho antibiótico. Esta característica es utilizada para seleccionar bacterias que contengan plásmidos frente a otras que no los contengan. Los plásmidos no son los únicos vectores empleados en clonación. A menudo se requiere clonar trozos de ADN mayores a los soportados por los plásmidos. Así, se emplean también los bacteriófagos (virus que infectan bacterias) y también se han desarrollado otros vectores que son combinaciones de plásmido, de bacteriófago, de cromosoma de levadura, etc. Así surgieron por ejemplo los BACs ( bacterial artificial chromosome ).

11 Figura 5. Clonación de ADN. Se pueden transformar bacterias con plásmidos que llevan un determinado inserto (señalado en rojo). Una vez dentro de la bacteria, el plásmido se replica con ella. Así se consigue que el trozo de ADN además de estar aislado, sea amplificado y se obtienen rápidamente muchas copias idénticas. Las bacterias que contienen el plásmido son seleccionadas por crecer en presencia de un antibiótico, ya que el plásmido lleva un gen que codifica para un producto que confiere resistencia a ese antibiótico (señalado en negro). Ejercicio 4 Cuáles vectores pueden llevar el inserto más grande? Qué ventajas tienen los YACs con respecto a los otros tres? a. Fagos b. Plásmidos c. Cósmidos d. YACs Ejercicio 5 Un fragmento de ADN de 1, 5 kb es clonado en el sitio EcoRI de un vector plasmídico de 5,5 kb de tamaño. Dicho vector es luego usado para transformar bacterias competentes. El ADN plasmídico extraído de una única colonia bacteriana, es digerido con la enzima de restricción EcoRI. a) Qué productos de digestión se producirán si el plásmido contiene el inserto? b) Y si no lo contiene? Construcción y rastreo de librerías Cuando el genoma entero de un organismo es cortado en trozos y clonado en un determinado vector se construye una genoteca o una biblioteca o librería genómica. Esto es posible por ejemplo si se corta dicho genoma con una enzima de restricción y todos los fragmentos resultantes se insertan en plásmidos que han sido previamente digeridos con esta misma enzima de restricción. Como resultado se obtienen una serie de plásmidos que contienen distintos trozos de ADN correspondientes a ese genoma. Esta es una librería genómica (fig. 6). También existen bibliotecas de ADN complementario o copia (ADNc), las cuales son construidas a partir de la población total de ARNm de un organismo, de un tejido o tipo celular particular o de una etapa del desarrollo particular. Representa en este caso al conjunto de genes que están siendo expresados por esas células o por ese estadío. Para construir una librería de ADNc, es necesario extraer el conjunto de ARNm y sintetizar moléculas de ADN complementarias a esos ARNm. Esto se realiza gracias a la acción de una enzima denominada transcriptasa inversa. Una vez sintetizada la cadena de ADN, la molécula híbrida ADN-ARN es tratada con RNasa para degradar las moléculas de ARN y las cadenas simples de ADN son utilizadas como molde para la síntesis de ADN de doble cadena por una polimerasa. Las secuencias resultantes son entonces insertadas en un vector para generar la librería de ADNc.

12 Figura 6. Esquema de la construcción de una librería genómica humana en un vector plasmídico. El ADN genómico humano es digerido con enzima de restricción y los fragmentos resultantes son clonados en un vector plasmídico. Los plásmidos recombinantes son luego introducidos en una bacteria huésped mediante transformación. La librería genómica se puede guardar como un stock bacteriano y plaquearse en medio sólido o crecer en medio líquido cuando va a ser utilizada. Si utilizamos plásmidos que contienen una librería para transformar bacterias, como Escherichia coli, y plaqueamos los transformantes sobre un medio sólido que contenga un antibiótico de selección, obtendremos colonias individuales donde cada una contiene un plásmido recombinante en particular. Las placas conteniendo estas colonias pueden ser transferidas a membranas. Una vez transferidas, las bacterias son lisadas para exponer su ADN y el ADN se desnaturaliza. Tras fijar el ADN a la membrana por calor o por exposición a UV, estas membranas pueden ser hibridizadas con una sonda específica. Si se coloca encima de ellas un film fotográfico que luego es revelado, la colonia que contiene un plásmido con una secuencia de ADN complementaria a la sonda, se evidenciará como una mancha negra en el film. Este proceso de exposición se denomina autorradiografía (fig. 7). El autorradiograma resultante puede ser comparado con la placa de agar que contiene las colonias bacterianas, para localizar la colonia que contiene el plásmido con la secuencia de interés. Esta colonia luego es sometida a un proceso de verificación, es decir se aísla, se replaquea y se vuelve a hibridar con la sonda y/o se secuencia para confirmar la presencia del gen de interés. Transferencia Hibridización, lavado y autorradiografía Colonias sobre una placa de agar Membrana Autorradiograma Figura 7. Rastreo de una librería genómica construida en plásmidos. Para garantizar que la sonda encuentre su secuencia complementaria, es necesario plaquear la librería de manera que resulte un número suficiente de colonias individuales, tomando en cuenta que existirán colonias repetidas.

13 Ejercicio 6 El plásmido puc18 lleva el gen que confiere resistencia a ampicilina y lleva un fragmento del gen lacz que confiere la capacidad de convertir el compuesto X-gal sin color a un compuesto de color azul. Si un fragmento de ADN es clonado interrumpiendo esta última región, a) De qué color serán las colonias que lleven plásmidos con el inserto de ADN si dichas colonias son plaqueadas en un medio conteniendo ampicilina y X-gal? b) De qué color serán las colonias plaqueadas en el mismo medio si contienen plásmidos que no llevan inserto de ADN? c) Por qué es necesario que el medio de cultivo contenga ampicilina? Qué colonias espera que crezcan en ausencia de este antibiótico? Ejercicio 7 Un plásmido resistente a ampicilina y a tetraciclina pbr322, se corta con la enzima de restricción PstI que corta dentro del gen de resistencia a ampicilina. El plásmido cortado se liga con un DNA de Drosophila digerido con PstI para preparar una biblioteca genómica y la mezcla se utiliza para transformar E. coli K12. a) Qué antibióticos deben añadirse al medio de cultivo para obtener colonias con plásmidos que contengan insertos de Drosophila? b) Cómo se puede explicar la presencia de colonias que sean resistentes a ambos antibióticos? Secuenciación del ADN Los métodos más comunes para secuenciar el ADN utilizan compuestos llamados terminadores de cadena (método de Sanger). Se trata de dideoxinucleótidos (ddntps) que al incorporarse a una cadena que se está sintetizando, son capaces de detener la elongación llevada a cabo por la ADN polimerasa. Los ddntps son moléculas parecidas a los nucleótidos normales excepto que carecen del grupo 3 hidroxilo (OH). La ADN polimerasa agrega este nucleótido a una cadena de ADN en crecimiento mediante la formación de un enlace entre el grupo 5 fosfato del nuevo nucleótido y el grupo 3 OH del nucleótido previo. Seguidamente la enzima no podrá agregar más nucleótidos debido a la ausencia del grupo 3 OH. Para una reacción de secuenciación se debe mezclar la molécula de ADN molde con cebadores o primers requeridos por la ADN polimerasa para iniciar la síntesis y deoxinucleótidos (dntps) normales. Esta mezcla es dividida en cuatro tubos y a cada tubo se le agrega un ddntps (ddatp, ddttp, ddgtp, ddctp) diferente. Por último se agrega la ADN polimerasa que comienza la reacción de síntesis. Durante la reacción de polimerización, la incorporación al azar de un ddntp en competición con el dntp normal correspondiente, llevará a la formación de una mezcla de cadenas de distintas longitudes, todas ellas empezando en el extremo 5 y terminando en todas las diferentes posiciones posibles donde un ddntp puede incorporarse en lugar de un dntp. Completada la reacción, en el tubo que contiene por ejemplo dda, las nuevas moléculas sintetizadas contendrán dda en cada sitio correspondiente a T en el molde. Como resultado se han generado una serie de moléculas que terminan en las distintas T del molde. La sustitución de uno de los dntps por el mismo nucleótido marcado permite la visualización posterior. Esta se hacía clásicamente por electroforesis en geles de poliacrilamida. cargadas en distintos pocillos del gel de Las moléculas sintetizadas se separarán de acuerdo a su tamaño y podrán visualizarse por exposición del gel a un film fotográfico y posterior revelado (fig. 8).

14 Figura 8. Autorradiografía obtenida a partir de un gel de secuencia desnaturalizante de acrilamida-bisacrilamida. Tras la corrida electroforética, los fragmentos de ADN de simple cadena que difieren en un nucleótido de longitud, se separan en el gel. Dichos fragmentos son visualizados luego de secar el gel y exponerlo sobre un film de autorradiografía ya que uno de los dntps utilizados en la reacción de secuenciación es radiactivo. G A T C Ejercicio 8 Puedes leer la secuencia de la figura? Al final de la década de 1980 aparecen equipos de secuenciación automática los cuales, basados en el mismo principio de terminación de cadena, emplean dideoxinucleótidos modificados que llevan un grupo fluorescente (distinto para cada ddntp) o bien a cada una de las cuatro reacciones se le añade el cebador marcado en 5 con una sonda fluorescente distinta. Los productos de reacción se detectan directamente durante la electroforesis al pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida (fig. 9). Con estos instrumentos las lecturas de secuencia se transforman en cromatogramas de picos de cuatro colores. Figura 9. Secuenciación automática utilizando terminadores fluorescentes. La reacción se lleva a cabo en un solo tubo. Cada terminador fluorescente emite a una determinada longitud de onda generando un electroferograma. Existen instrumentos de electroforesis capilar como alternativa al sistema basado en geles de poliacrilamida, donde se utiliza un polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la mezcla de secuenciación y que va resolviendo los fragmentos de ADN que se diferencian en una única base (fig. 10). Estos instrumentos permiten la total automatización del proceso así como una mayor rapidez. Con estos métodos ha sido posible encarar estrategias de secuenciación de gran escala como han sido los proyectos de secuenciación de genomas completos de organismos. En muchas enfermedades genéticas humanas, una copia cromosómica contiene una o una bases cambiadas en determinada posición dentro del gen. Cuando se obtienen los datos de la secuencia de ese ADN se observan dos bases diferentes en la misma posición. En el contexto de la secuenciación automática se detectan dos picos superpuestos en la misma posición.

15 Figura 10. Secuenciación automática capilar. El equipo funciona de forma automática inyectando las muestras en un capilar previamente cargado con un polímero que funciona como matriz como lo hace la matriz de acrilamidabisacrilamida-urea de los geles de secuencia. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra, el capilar se vacía rellenándose nuevamente con polímero fresco y se inyecta una segunda muestra. Ejercicio 9 Escribe la secuencia correspondiente al siguiente cromatograma. El código de colores es: G, negro C, azul T, rojo A, verde A pesar de que el método automático de Sanger fue el método de secuenciación dominante durante casi 2 décadas, en los últimos 4 años las estrategias de secuenciación cambiaron drásticamente, dando lugar a nuevos y revolucionarios métodos referidos como next generation methods (NGS). Estos métodos tienen la capacidad de producir un enorme volumen de datos de secuencias. Estas nuevas tecnologías permiten una secuenciación más barata y eficiente, a pesar de obtener fragmentos (reads) de menor tamaño. Las secuencias aisladas obtenidas requieren el empleo de potentes herramientas informáticas para su ensamblaje. Distintas empresas han desarrollado distintos métodos tales como son el método 454 de Roche, Solexa de Illumina y SOLiD de Applied Biosystems. Aunque entre ellos difieren en la forma de preparación del ADN molde a secuenciar, todos se basan en la inmovilización del molde a una superficie sólida o soporte. La mayoría de los métodos utilizan un paso con clonación in vitro para generar muchas copias de cada molécula individual, ya que los métodos de detección molecular frecuentemente no son lo suficientemente sensibles para la secuenciación de una sola molécula. Uno de los métodos es la PCR de emulsión, en la que se aíslan las moléculas individuales de ADN junto con microesferas. Luego, mediante una reacción de PCR se recubre cada microesfera con copias clonales de la biblioteca de moléculas aisladas y seguidamente se inmovilizan ocupando cada microesfera una localización fija para ser más tarde secuenciadas. En algunos de los métodos, la secuenciación de estas moléculas molde se basa en la incorporación, gracias a la ADN polimerasa de nucleótidos fluorescentes, y en la lectura basada en la microscopía de fluorescencia. Durante la polimerización del ADN se incorpora un nucleótido marcado con fluorescencia y que está protegido en la cadena naciente por lo que impide que ésta siga creciendo. Tras detectar la señal fluorescente, se elimina el grupo

16 fluorescente protector, regenerando un extremo 3 OH libre, y se puede incorporar otro nucleótido marcado, con lo que se empieza nuevamente el ciclo. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Es una técnica muy rápida que permite, a partir de una sola copia de una molécula de ADN, obtener muchas copias de dicho ADN. Por lo tanto resulta ser una técnica muy útil en estrategias de clonación y también de detección, cuando la cantidad de material es limitante, como en el área forense y de identificación humana, así como en genética de poblaciones. Esta técnica aprovecha las características de la replicación del ADN, es decir que a partir de un pequeño cebador la polimerasa puede proseguir la síntesis de una cadena. Se debe contar con dos cebadores adecuados, uno para cada cadena (fig.11). Por la posición de estos cebadores, al cabo de una serie de rondas de replicación, se obtiene la amplificación de una molécula de ADN correspondiente al tramo que va desde uno de los cebadores al otro. Por lo tanto, se obtienen muchas moléculas idénticas. Los cebadores suelen ser cortos de bases y en la reacción se mezclan con la muestra de ADN a ser amplificada. Al comenzar la reacción, la muestra de ADN de doble cadena debe ser desnaturalizada calentándola a 95ºC y luego enfriada para permitir la hibridación con los cebadores. La siguiente etapa consiste en la síntesis a partir de los cebadores de cada una de las cadenas de ADN por la polimerasa utilizando nucleótidos agregados a la mezcla de reacción. Este ciclo de desnaturalización, hibridización y síntesis o extensión se repite muchas veces y por tanto se amplifica, puesto que en cada nuevo ciclo se dispone de más cantidad de ADN molde. Como el ADN tiene que ser desnaturalizado por calor para iniciar cada nuevo ciclo, se emplea una polimerasa que resiste el calor (denominada Taq polimerasa, aislada de la bacteria de aguas termales Thermus aquaticus). La reacción de PCR se lleva a cabo en un aparato denominado termociclador, capaz de realizar cambios muy rápidos de temperatura. Así, la mezcla de reacción es colocada en el termociclador estableciéndose las condiciones de incubación. En primer lugar se establece el número de ciclos, que puede variar, oscilando generalmente alrededor de los 30 ciclos. Posteriormente se determinan las condiciones de cada ciclo. Este último se divide en una etapa de desnaturalización, que se lleva a cabo a 95ºC durante segundos, una etapa de hibridización de segundos a una temperatura que dependerá de la temperatura de desnaturalización de los oligonucleótidos utilizados como cebadores, y por ultimo una etapa de extensión que se realiza también durante un tiempo variable, generalmente a 72ºC o a la temperatura que sea óptima para la polimerasa que se emplea. Figura 11. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta reacción se realiza en un aparato denominado termociclador. Con dicho aparato es posible programar la cantidad de ciclos así como las temperaturas y tiempos deseados para cada etapa

17 Gran parte del éxito de una reacción de PCR depende de la correcta elección de los cebadores que aseguran la amplificación adecuada y al mismo tiempo la especificidad de la reacción. Por esta razón tanto si se diseñan manualmente como con la ayuda de programas adecuados, deben tratar de considerarse varios factores. 1) Los cebadores deben elegirse abarcando el tramo que se desea amplificar 2) Cada uno de ellos deberá unirse a una de las dos hebras de una secuencia de ADN desnaturalizada. Por lo tanto si estamos trabajando sobre una secuencia que representa una de las dos hebras, uno de los cebadores será igual a un tramo de esta secuencia, y el otro será complementario. 3) Se intentará que estos cebadores cumplan con la mayor parte de los siguientes requisitos: a) Longitud: entre 18 y 25 pares de bases b) Contenido en GC. Un porcentaje en el entorno de 50%. Pues esta composición está en relación con la temperatura de hibridación de estos oligonucleótidos con el ADN molde como se observa en la gráfica. c) En relación con lo anterior, debe intentarse que los cebadores tengan una temperatura de desnaturalización (Tm) relativamente alta para asegurar la especificidad de la amplificación, y que las Tms de ambos cebadores del par sean similares, para así definir la temperatura de hibridización que se usará en la reacción. d) Consideraciones sobre las bases en determinadas posiciones, como por ejemplo evitar que el extremo 3 sea A o T, evitar tramos de más de tres bases iguales, etc. e) Evitar que los cebadores diseñados formen estructuras secundarias, homodímeros o heterodímeros, o que éstos, de existir sean lo menos estables posibles. Esto implica por ejemplo que no existan tramos con complementariedad entre dos regiones de un cebador o con el otro o estructuras palindrómicas

18 Ejercicio 10 Dispones del ADN correspondiente a la secuencia que se anota a continuación. Quieres realizar una reacción de amplificación por PCR de una porción de dicho ADN. a) Diseña los cebadores necesarios para dicha reacción. Ten en cuenta que su longitud debe ser de nucleótidos. b) Calcula las temperaturas de desnaturalización (Tm) de estos cebadores tomando en cuenta la siguiente fórmula (para oligonucleótidos de hasta 18 nt): (A + T) x 2º + (G + C) x 4º c) Establece las condiciones de amplificación. ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCACC TGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAG TTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGCTGTTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTG AGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTC ATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGG GCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACT TCAGGGTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCC ACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCC CTAAGTCCA Ejercicio 11 Te propones obtener la secuencia del gen que codifica para la proteína HP1 de un insecto cuyo genoma no es conocido. a) Cómo procederías si cuentas con una biblioteca de ADNc de ese insecto construida en un vector plasmídico y con un plámido que contiene el gen que codifica para la proteína HP1 de Drosophila? b) Podrías obtenerlo sin tener una biblioteca de ADNc? Qué estrategia emplearías? c) Una vez completada la obtención de este ADNc se establece que consta de 1650 pares de bases. Cómo puedes obtener la secuencia genómica correspondiente? Cómo explicas que una vez obtenida, la misma tenga pares de bases?

19 IDENTIFICACIÓN CROMOSÓMICA I. INTRODUCCIÓN I.1. GENERALIDADES DEL CROMOSOMA EUCARIOTA Los cromosomas son estructuras discretas que se encuentran en las células ecuariotas, encargadas del almacenamiento y transmisión de la información hereditaria. El término CROMOSOMA se refiere a cromosomas metafásicos en mitosis, cuando la cromatina alcanza su máximo grado de condensación. Cada cromosoma está formado por dos CROMÁTIDAS hermanas, cada una de ellas constituida por una única molécula de ADN. El cromosoma eucariota requiere de ciertas estructuras para llevar a cabo su función: dos telómeros, un centrómero y varios orígenes de replicación por cromátida. Los extremos de las cromátidas se denominan TELÓMEROS y confieren estabilidad a cada unidad hereditaria. La CONSTRICCIÓN PRIMARIA o CENTRÓMERO es el sitio de ensamblaje de una estructura proteica llamada CINETOCORO, a la cual se asocian los microtúbulos del huso metafásico. Según la posición que ocupe el centrómero podemos clasificar a los cromosomas como metacéntricos, submetacéntricos y telocéntricos (algunos autores agregan una cuarta categoría denominada acrocéntricos o subtelocéntricos). En algunos cromosomas aparece otra constricción llamada CONSTRICCIÓN SECUNDARIA. Algunos segmentos cromosómicos localizados entre la constricción secundaria y el telómero se llaman SATÉLITES. Aunque muchas veces el significado funcional de las constricciones secundarias permanece incierto, en algunas de ellas se localiza el cluster 45S de genes ribosomales, a partir del cual se organiza el nucleolo. Por esta razón se denomina REGIÓN ORGANIZADORA DEL NUCLEOLO (NOR), y puede visualizarse al microscopio óptico mediante técnicas de impregnación con plata. Clasificación de los cromosomas según la posición del centrómero; Metacéntrico: Cromosoma cuyo centrómero se encuentra en la mitad del cromosoma, dando lugar a dos brazos de igual longitud (p y q). Submetacéntricos: Cromosoma en el cual el centrómero se ubica de tal manera que un brazo es ligeramente más corto que el otro. Telocéntrico: Cromosoma en el cual el centrómero está localizado en un extremo del mismo (telómero), por lo que el cromosoma posee sólo un brazo. Acrocéntrico o Subtelocéntrico: Cromosoma en el cual el centrómero se encuentra más cercano a uno de los telómeros, dando como resultado un brazo muy corto (p) y el otro largo (q).

20 I.2. CROMOSOMAS POLITÉNICOS DE LAS GLÁNDULAS SALIVALES Las glándulas salivales y otros tejidos blandos de los Dípteros tienen núcleos en interfase permanente. Durante el crecimiento y desarrollo de las larvas, la división celular se suspende en ciertos tejidos pero las células continúan su crecimiento por incremento de tamaño. Este proceso ocurre en los tubos de Malpighi, las células del cuerpo graso, las células nutricias de los ovarios, el epitelio intestinal y en las células de las glándulas salivales. En estos tejidos, los cromosomas sufren rondas de duplicaciones repetidas pero sin separarse, proceso conocido como endomitosis. Esto lleva a la producción de un haz cromatínico de varios cientos o miles de hebras. Durante este proceso de politenización o politenia, los cromosomas incrementan su largo y su diámetro. El número de réplicas de ADN sin separación de los cromosomas hijos es de 10, de lo que resultan 1024 (2 10 ) hebras cromatínicas alineadas lado a lado. Además los cromosomas politénicos presentan los cromosomas homólogos asociados a lo largo de toda su longitud. Esta condición es un ejemplo extremo de un fenómeno más general denominado apareamiento somático el cual ocurre en el ciclo mitótico de la mayoría de los Dípteros. A su vez, los cromosomas muestran un patrón peculiar de bandeo transversal que consiste en zonas cromáticas oscuras (llamadas bandas), y zonas acromáticas claras (interbandas), visibles al microscopio óptico (ver figuras). Este bandeo es reproducible de núcleo a núcleo, formando un patrón específico para cada especie, de tal manera que los cromosomas pueden ser identificados y mapeados en todo su largo, constituyendo un mapa citológico. Hay aproximadamente 5000 bandas y 5000 interbandas en total en el genoma de Drosophila melanogaster. Debido a que el patrón de bandeo que presentan los cromosomas politénicos es un reflejo constante de las secuencias de ADN, las bandas sirven como marcadores para localizar varias características genéticas (áreas con gran concentración de genes, o cambios en el genoma debido a reordenamientos cromosómicos, por ejemplo deleciones, duplicaciones, translocaciones, etc.). En D. melanogaster el patrón de bandeo no está presente en las regiones heterocromáticas centroméricas de todos los cromosomas. Las regiones heterocromáticas están asociadas formando un cromocentro. FIGURAS: Cromosomas politénicos teñidos con orceína (izquierda) y Giemsa (derecha). La imagen ampliada (b) muestra las bandas y las interbandas con mayor detalle..

21 I.3. CARIOTIPO: CONCEPTO Y REPRESENTACIÓN El conjunto ordenado de todos los cromosomas de una especie es conocido como CARIOTIPO. El análisis del cariotipo es de fundamental importancia para comparar especies o para estudiar la variación dentro de una misma especie. En el hombre además se ha utilizado para correlacionar determinadas patologías con alteraciones del cariotipo normal. Los parámetros utilizados para la elaboración del cariotipo de una especie son: tamaño de los cromosomas; posición del centrómero; patrón de bandas (C, G, Q, T, etc.); posición de las constricciones secundarias u otros marcadores. Izquierda: Metafase mitótica humana (Tinción standard con Giemsa) Derecha: Cariotipo humano. Los cromosomas se ordenan por tamaño y posición del centrómero. I.4. BANDEOS CROMOSÓMICOS A pesar de la aparente homogeneidad estructural de los brazos cromosómicos observable en las preparaciones convencionales, existen técnicas que revelan bandas o regiones con tinción diferencial a lo largo de los brazos cromosómicos. Estas bandas ponen de manifiesto la diferenciación longitudinal de los cromosomas, la cual representa diferencias en su compleja organización a nivel molecular. Una de las aplicaciones más importantes de las técnicas de bandeo es la identificación inequívoca de los cromosomas de un cariotipo. El poder de resolución de estas técnicas permite no sólo la identificación de cromosomas enteros sino también el estudio detallado de reordenamientos cromosómicos. Las técnicas de bandeo cromosómico pueden agruparse en técnicas de bandeo morfológico y de bandeo dinámico. Bandeos morfológicos Los bandeos morfológicos son inherentes a la heterogeneidad de la cromatina, relacionados a proteínas e interacciones ADN-proteínas y a la composición de bases del ADN. Pueden clasificarse, a su vez, en: a. técnicas de tinción diferencial, como las bandas G (Giemsa) y las bandas R (Reverse). Este tipo de bandeo revela un patrón de bandas longitudinales pero sólo en los cromosomas de aves y mamíferos. b. métodos de tinción selectiva, como las bandas C (tiñen la heterocromatina constitutiva), bandas NOR (tiñen los organizadores nucleolares) y bandas T (tiñen los telómeros). c. coloraciones con fluorocromos específicos aislados o combinados con colorantes no fluorescentes (DAPI, Cromomicina A3, etc). Estos fluorocromos pueden teñir regiones ricas en pares de bases AT o CG.

22 d. bandeos con endonucleasas de restricción. Bandeos dinámicos Determinadas regiones cromosómicas inician y terminan la duplicación del ADN durante una pequeña fracción de la fase S constituyendo por lo tanto una unidad de replicación. Los bandeos de replicación involucran la incorporación selectiva de análogos de bases, como por ejemplo la 5- bromodeoxiuridina (BrdUrd). El tránsito de la célula a través de la fase S puede ser detenido mediante el empleo de altas concentraciones del mencionado análogo de base. Esto permite identificar las regiones que se replican sincrónicamente en los distintos momentos de la fase S. Metafase mitótica con la técnica de Bandeo G. Esta técnica implica el tratamiento de los cromosomas con una enzima proteolítica (tripsina) y su posterior tinción con el colorante Giemsa. Metafase mitótica humana con técnica de Bandeo C. Está técnica implica el tratamiento con diferentes sustancias y su posterior tinción con el colorante Giemsa.

23 II. OBJETIVOS II.1. Introducir al estudiante en la variabilidad y diversidad cromosómica de los seres vivos mediante la observación de preparaciones de células CHO, Homo sapiens y cromosomas politénicos en D. melanogaster. II. 2. Familiarizar al estudiante con el área de la citogenética mediante la observación al microscopio de preparaciones citológicas con técnicas de tinción clásicas y de bandeo cromosómico. III. ACTIVIDADES III.1. Observación al microscopio de preparaciones citológicas de: células CHO (línea celular de hámster chino). cromosomas politénicos de Drosophila Homo sapiens a. Qué técnica de tinción cree que se utilizó en cada una de las preparaciones que observó y porqué? b. Qué morfología cromosómica puede distinguir en las preparaciones de células CHO? c. Realice un dibujo de lo que observa en las preparaciones de cromosomas politénicos. Cómo explicaría la presencia de 5 brazos emanado del cromocentro? Recuerde que D. melanogaster presenta un 2n= 8 con dos pares cromosómicos metacéntricos (II y III) y dos pares acrocéntricos (X o I y IV) y un cromosoma submetacéntrico (Y) en el caso de los machos. El par cromosómico IV es muy pequeño y totalmente heterocromático. d. Qué diferencias encuentra entre estos cromosomas y los de CHO u Homo sapiens? A qué cree que son debidas? III.2. Observación de láminas Lámina A a. Indiqué número cromosómico de la especie (2n), número de moléculas de ADN y número de cromátidas. b. Se trata de una célula animal masculina o femenina? Justifique. Lámina B Qué particularidad observa en la estructura cromosómica (compare con la lámina B) y que técnica de bandeo se aplicó? III. 3. Observación al microscopio de preparaciones de H. sapiens con distintas técnicas de bandeo. Qué técnicas de bandeo observó y qué parámetros lo llevaron a identificarlas?

24 CICLO CELULAR MITÓTICO I. INTRODUCCIÓN El ciclo celular es el período comprendido entre la formación de una célula, por división de otra precedente, y el momento en que ella misma se divide para originar dos células hijas. Durante el ciclo toda la célula eucariota (núcleo y citoplasma) está sometida a una gran reestructuración. El ciclo celular se puede dividir en dos grandes períodos: interfase y mitosis, cada uno de los cuales se subdivide en varias fases o etapas. La interfase se encuentra subdividida en 3 etapas: a) Período G1: comienza la síntesis de ARN y proteínas, las cuales perduran durante toda la interfase. b) Período S: ocurre la duplicación del ADN dando lugar a la formación de las cromátidas hermanas. c) Período G2: fase post-sintética que va desde el final de S hasta el comienzo de la mitosis o división celular. En la mitosis ocurren 2 procesos altamente sincronizados: la cariocinesis (división del núcleo) y la citocinesis (división del citoplasma). En la cariocinesis se reconocen distintas fases: profase, metafase, anafase y telofase. Algunos autores reconocen a la prometafase como un estadio entre profase y metafase. La mitosis finaliza con la citocinesis, la cual es diferente en células animales y vegetales. (A) INTERFASE: Núcleos en interfase. La cromatina aparece bastante homogénea, a excepción de zonas más claras que corresponden a los nucleolos. (B) PROFASE: La cromatina comienza a condensarse. A medida que avanza este estadio desaparece el nucleolo. Los cromosomas aparecen como filamentos delgados. (C) METAFASE: Cada cromosoma, integrado por dos cromátidas hermanas, se dispone con su centrómero en el plano ecuatorial. (D-E) ANAFASE: Las cromátidas hermanas se separan y comienzan a migrar hacia los polos opuestos de la célula. Ahora los cromosomas se observan formados por una sola cromátida, con los centrómeros dispuestos hacia los polos y los telómeros hacia el centro de la célula. (F) TELOFASE: No es posible individualizar los cromosomas. La cromatina comienza a descondensarse en ambos núcleos hijos.