Detección molecular del virus del papiloma humano (HPV) en muestras de epitelio y biopsias de cérvix

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1 Detección molecular del virus del papiloma humano (HPV) en muestras de epitelio y biopsias de cérvix Juan Antonio Zapata Aguilar Marisa Hernández Barrales Adrián López Saucedo Jorge Luis Ayala Luján Laboratorio de Patología y Diagnóstico Molecular Jaime Burciaga Campos Clínica de Colposcopía, Hospital General Fresnillo Palabras clave: HPV, cáncer, diagnóstico molecular. Introducción A nivel mundial, después del cáncer de mama, el cáncer cervicouterino es el más común en la mujer. La prevalencia de este tipo de cáncer se estima en 1.4 millones de casos en el mundo (1), provoca alrededor de 290,000 muertes y 500,000 nuevos casos por año (2), de los cuales el 80% corresponden a mujeres que viven en países en vías de desarrollo (3). El cáncer cervicouterino es originado, entre otros factores, por algunos serotipos oncogénicos del Virus de Papiloma Humano (HPV, por sus siglas en inglés), encontrándose en más del 90% de los casos, por lo que se le ha considerado como una causa necesaria. (4) En México, el cáncer cervicouterino es el más común en la mujer y ocupa el primer lugar entre los tumores malignos de la población femenina; es causante de 5,777 defunciones por año, con una tasa de mortalidad de 18.3 por cien mil mujeres de veinticinco años o más, y un índice de 12,516 nuevos casos por año. (5) Con respecto a Zacatecas, este tipo de cáncer también constituye un grave problema de salud, al ocupar uno de los primeros lugares en mortalidad. Las estadísticas muestran que existe un desproporcionado aumento del cáncer cervicouterino en mujeres jóvenes, por lo que un buen diagnóstico temprano es indispensable para el seguimiento y posterior tratamiento de la enfermedad. Además del diagnóstico clínico llevado a cabo por citología de Papanicolaou y colposcopía, la biología molecular permite hacer 1

2 diagnósticos a nivel molecular para detectar el DNA viral del HPV. En la actualidad, técnicas basadas en la amplificación del DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) contribuyen con la citología y la colposcopía para tener un diagnóstico más completo y certero, que tiene la ventaja de identificar los distintos tipos de virus de papiloma de bajo y alto riesgo oncogénico, (6) a fin de evitar el riesgo de que desarrollen cáncer. (4) HPV y cáncer cervicouterino Las evidencias epidemiológicas indican que algunos tipos de HPV son la causa principal de cáncer invasor y de Displasia o Neoplasia Intraepitelial Cervical (lesión precursora de cáncer cervicouterino). El DNA del virus ha sido detectado en un 99.7% de tejido cervical cancerígeno y se sabe que para que el cáncer se desarrolle, la presencia del virus HPV es clave. (7) De los casi doscientos tipos de HPV identificados, se ha demostrado que alrededor de cuarenta tienen la capacidad de infectar el tracto genital. (8) La presencia y persistencia en la infección se debe a serotipos oncogénicos denominados de alto riesgo de los cuales, entre quince y veinte de los HPV mucosos son considerados como de alto riesgo para el desarrollo y progresión hacia la metástasis. En el 50% de los casos de cáncer cervicouterino se ha identificado al tipo 16, mientras que los tipos 18, 31, y 45, en un 30%. (8,9) Infección por HPV La infección por HPV es más común en mujeres jóvenes sexualmente activas, de entre dieciocho y treinta años, y disminuye después de los 30 años. El virus infecta las células basales del epitelio escamoso estratificado y las células metaplásicas en la zona de transformación de la unión escamocolumnar cervical. Dependiendo del tipo de HPV la infección puede ser asintomática, o puede presentar manifestaciones clínicas de verrugas genitales externas, o 2

3 cambios por displasia cervical tempranos. La mayoría de las infecciones son inadvertidas y se concretan dos años después del contacto directo. (5,8) Pruebas diagnósticas en cáncer cervical Las cifras de mortalidad por cáncer cervicouterino en México fueron un hecho fundamental para la realización de campañas de pruebas de tamizaje mediante papanicolaou (Pap), sin embargo, los especialistas consideran que esta prueba carece de la sufuciente sensibilidad para clasificar de manera correcta los tejidos precancerosos. (6) Estudios recientes indican que la citología de papanicolaou no es un método adecuado para detectar el HPV, ya que los coilocitos y los disqueratocitos observados son marcadores específicos de las infecciones floridas, por lo que esta técnica no logra detectar la mayoría de las infecciones por HPV. La exactitud de la prueba de papanicolaou está limitada por falsos negativos, donde el 60% se debe a una muestra insuficiente, y un 40% al realizar la lectura, logrando una precisión de apenas 15% en la detección de infección por HPV. (10) Por su parte, el examen colposcópico tiene una alta sensibilidad pero una baja especificidad, además de que lleva a la toma de biopsias innecesarias. El estándar ideal para un diagnóstico definitivo de cáncer es la biopsia seguida de histología, no obstante, tiene la desventaja de que requiere de un experto que interprete la información microscópica histopatológica obtenida, y esto conlleva un margen de error humano. (6) La respuesta inmune a la infección por HPV se da por inmunidad humoral contra la proteína de la cápside viral. Los anticuerpos que combaten contra el virus permanecen perceptibles durante muchos años, pero la serología no permite distinguir infecciones presentes o pasadas por HPV, de modo que no constituye un método de diagnóstico eficiente. (10) 3

4 Detección Molecular de HPV Los métodos moleculares que detectan la presencia de HPV, consisten en la amplificación específica del DNA viral. La prueba de captura de Híbridos Hybrid Capture II (HC II), (11) aprobada por la FDA, es un método semicuantitativo no radiactivo, basado en la hibridación del DNA de HPV con sondas de RNA, y en el que se usan anticuerpos monoclonales específicos que luego se revelan por quimioluminiscencia. A través de este método se detectaron cinco genotipos de bajo riesgo (6,11,42,43,44) y trece de alto riesgo (13,16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 y 68), lo que significa que tiene una gran sensibilidad y su adopción se debe a su reproducibilidad en ensayos clínicos a nivel mundial. (11,12) Otro método amplifica el DNA viral por PCR, el cual utiliza oligonucleótidos consenso y también detecta el DNA de los diferentes tipos de HPV y los tipifica. (8) Una variante metodológica más es la PCR en tiempo real, empleada recientemente para detectar DNA de HPV, mediante oligonucleótidos específicos que se combinan con marcadores fluorescentes. Puesto que los diferentes tipos de HPV tienen alta heterogeneidad, la PCR en tiempo real requiere de una mezcla de sondas y características de hibridación diferentes, lo que dificulta su estandarización. (8,11) Las distintas técnicas mencionadas, basadas en estrategias moleculares, monitorean la presencia del DNA de HPV. Justificación Estar a la vanguardia en métodos diagnósticos es un requisito indispensable para hacer frente a la lucha contra el cáncer cervicouterino y para disponer de herramientas adecuadas para tratar a las mujeres. Su diagnóstico temprano y el control de la infección por HPV se han convertido en una necesidad apremiante, sobre todo en países en vías de desarrollo, donde causan mayor número de muertes. (4) En este sentido, el diagnóstico molecular 4

5 del DNA viral complementa los métodos de tamizaje, como el papanicolau y la colposcopía. Objetivo Se planteó estandarizar la extracción de DNA y detección del virus de HPV mediante PCR en una serie de muestras de epitelio y biopsias de cérvix en pacientes, para poder llevar a cabo un estudio prospectivo y retrospectivo de la incidencia de HPV en mujeres del estado de Zacatecas. Material y Métodos La fuente de tejido biológico consiste en cortes de biopsias incluidas en parafina y células obtenidas de citología líquida (citobrush), tomadas en el Departamento de Patología del Hospital General Fresnillo. La recopilación de biopsias se hizo en base a la selección por presunta alteración celular por HPV, diagnosticada por clínica y por patología. Estas muestras se fijaron previamente en formaldehido y se incluyeron en parafina, obteniéndose cortes de cuatro micras. Uno de los pasos fundamentales y críticos para el desarrollo del presente trabajo fue la disponibilidad de DNA que permitiera llevar a cabo la detección de ADN de HPV, por lo que se utilizaron diferentes estrategias para la extracción. Se requirió de líneas celulares control HeLa y Caski, y de muestras provenientes de citología líquida para realizar la extracción de DNA mediante el método de DNAzol. En este último caso se hacen ciertas modificaciones al método, usando las células remanentes en los cepillos (citobrush), utilizados en la prueba de papanicolaou, y que se conservaron en formalina o en solución RNA later. (15) Para las muestras incluidas en parafina se siguió una modificación del método reportado por Banerjee y colaboradores, basado en la extracción con microondas. (13,14) Otro grupo de muestras fueron procesadas para la extracción de DNA con algunas modificaciones al 5

6 método de fenol/cloroformo, basado en la técnica descrita por Mahony y colaboradores (16) Para analizar la presencia así como la integridad del DNA obtenido por los diferentes métodos de extracción, se llevó a cabo un electroforesis en geles de agarosa al 0.8%, teñidos con bromuro de etidio y analizados en un fotodocumentador. Y para verificar la calidad del DNA extraído, se realizaron mediciones espectrofotométricas, obteniéndose la relación 260/280. Para iniciar la estandarización de las reacciones de PCR, se utilizó DNA genómico de las líneas celulares Hela y Caski, mismas que tienen integrado el DNA de HPV. Primero se realizó un PCR en gradiente para amplificar el gen constitutivo β Globina, el cual también es utilizado como control interno de amplificación en cada ensayo de las diferentes muestras. Para detectar el HPV por medio de PCR se requirió de un par de oligos consenso con amplificación L1 de todos los genotipos, y se utilizó un programa en gradiente para obtener las mejores condiciones de reacción. Resultados Se han recopilado muestras obtenidas en el Departamento de Displasias del Hospital General Fresnillo y se continuará la recopilación en otras instituciones del sector salud. Del conjunto de muestras procesadas para la extracción de DNA genómico, consiguieron mejores resultados de las de citología líquida por citobrush y conservadas en el reactivo RNA later. La calidad del DNA obtenido fue buena y se verificó por espectrofotometría y se constató mediante la amplificación eficiente del gen β Globina. Por otro lado, las muestras conservadas en formalina fueron menos eficientes en rendimiento y en la amplificación del gen constitutivo. Respecto a los métodos de extracción de DNA por microondas y con fenol/cloroformo, mostraron bajo rendimiento así como degradación parcial, lo cual influyó para los resultados poco favorables al amplificar el gen β Globina. Cabe mencionar que las muestras procesadas mediante estas metodologías 6

7 corresponden al tejido fijado en formaldehido e incluido en parafina. También se logró un gran rendimiento de DNA genómico de las líneas celulares HeLa y Caski. Para lograr las condiciones óptimas de amplificación para el gen β Globina y L1 de HPV, variaron las cantidades de DNA de las líneas celulares. Una vez que se cuente con las condiciones de extracción de DNA, amplificación para el gen constitutivo β Globina, así como para el gen que codifica para la capside viral, se abordará el análisis de las muestras donadas al laboratorio para detectar el HPV e identificar los diferentes genotipos, en especial aquellos de alto riesgo, y así contribuir con un buen diagnóstico. Conclusiones La extracción del DNA de HPV es un punto crucial en el desarrollo del presente trabajo, por lo que se enfoca en adquirir las condiciones óptimas de diferentes métodos de extracción del DNA genómico y viral. Los resultados obtenidos permiten contar con la estandarización de condiciones para extraer ácidos nucleicos así como para identificar las ventajas y desventajas de algunos de los métodos probados. Se considera que estas metodologías contribuirán de manera importante en el avance del trabajo y en las recomendaciones que se puedan hacer al sector salud del estado para que las muestras de estudio sean recopiladas en buenas condiciones y así se pueda apoyar con un eficiente diagnóstico molecular del HPV. 7

8 Bibliografía 1. Jansen K.U. and Shaw A. R., Human Papillomavirus Vaccines and Prevention of Cervical Cancer, Rev. Med., 2004, 55: Van Doorn L.J., Molijn A., Kleter B., Quint W., and Colau B., Highly Effective Detection of Human Papillomavirus 16 and 18 DNA by a Testing Algorithm Combining Broad Spectrum and Type Specific PCR en Journal Of Clinical Microbiology, 2006, 44 (9) López Saavedra A., Lizano Soberón M., Cáncer cérvicouterino y el virus del papiloma humano: La historia que no termina en Cancerología : Lewis, Merle J., Análisis de la situación del Cáncer Cervicouterino en América Latina y el Caribe, en Organización Panamericana de la Salud, Washington, D.C Tirado Gómez L., Mohar Betancourt A., López Cervantes M, García Carrancá A., Franco Marina F, Borges G., Factores de riesgo de cáncer cervicouterino invasor en mujeres mexicanas en Salud Pública Mex, 2005, 47: Sáenz de Santamaría J., Detección del ADN del virus del papiloma humano: una técnica complementaria a la citología ginecológica en Rev Esp Patol, 2007, 40, (2): Malinowski DP., Molecular diagnostic assay for cervical neoplasia: emerging markers for the detection of high grade cervical disease en BioTechniques, 2004, 38:S17 S Burd E. M., Human Papillomavirus and Cervical Cancer, en Clinical Microbiology Reviews, 2003, 16 (1): De Villers E., Classification of papillomaviruses en Virology 2004, Canadian Consensus Guidelines on Human Papillomavirus en Journal of Obstetrics and Gynecology Canada, 2007, 29 (8): S7 S15. 8

9 11. Molijn A., Kleter B., Quint W., Doorn L. Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections en Journal of Clinical Virology, : Ng'andwe C., J. Lowe J., J. Richards P., Hausel L., Wood C. and Angeletti P., The distribution of sexually transmitted Human Papillomaviruses in HIV positive and negative patients in Zambia, Africa en BMC Infectious Diseases, 2007, 7: Banerjee SK, Mardisky WF, Weston AP,. Microwave based DNA extraction from paraffin embedded tissue for PCR amplification en Biotechniques 1995, 18: Chan P K S, Chan D P C, To K F, Yu M Y, Cheung J L K, Cheng A F. Evaluation of extraction methods from paraffin wax embedded for PCR amplification of human and viral DNA en J Clin Pathol 2001, 54: Gravitt E P., van Doorn L. J., QWim., Schiffman M., Hildesheim A., G. Glass A., B. Rush B., Hellman J., E. Sherman M., D. Burk R., and S. Wan S. (HPV) Genotyping using paired exfoliated cervicovaginal cells and paraffin embedded tissues to highlight difficulties in attributing HPV types to specific lesions Journal of Clinical Microbiology, (10): Mahony JB, Detection of viral nucleic acid in clinical materials en Mahy BWJ, Kangro H.O., (eds) Virology methods manual, Academy Press, Nueva York, 1996: