Identificación rápida de distintas razas de Botrytis cinerea en cultivos de vid

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1 Identificación rápida de distintas razas de Botrytis cinerea en cultivos de vid C. MUÑOZ, S. GOMEZ TALQUENCA, E.ORIOLANI y F. ARIAS. Estación Experimental Agropecuaria Mendoza INTA RESUMEN Botrytis cinera es un fitopatógeno que causa la enfermedad de la podredumbre gris en una gran variedad de plantas de zonas templadas de todo el mundo y muestra una amplia variabilidad de rasgos genéticos y fisiológicos. Es capaz de actuar como patógeno y saprófito y ha desarrollado resistencia a muchos fungicidas utilizados en su control. Botrytis cinerea es una asociación de dos especies simpátricas: Transposa y Vacuma. Transposa posee los elementos transponibles Boty y Flipper, mientras que Vacuma carece de estos elementos. De acuerdo con esto se desarrollo un método rápido y preciso que permite la identificación de distintas razas de Botrytis cinerea en cultivos de vid. Este consiste en la obtención de cultivos monospóricos y extracción del ADN del hongo. Para evaluar la calidad del ADN se amplifica por PCR utilizando primers para IGS (secuencia espaciadora intergénica ribosomal), Boty y Flipper (elementos transponibles). Esto permite diferenciar ambas razas de Botrytis de acuerdo a la presencia o ausencia de los elementos transponibles. La variabilidad genética se determina por PCR-RFLP. Hasta el momento se han analizado 13 muestras provenientes de distintas zonas de la provincia de Mendoza y dos muestras provenientes de Chile, coleccionadas en distintos estadios fenológicos y tejidos de la vid. Los resultados hasta ahora muestran que todos estos aislamientos son de la raza Transposa y entre ellos presentan una amplia variabilidad genotípica para IGS. Palabras clave: Retrotransposon, PCR-RFLP, Podredumbre gris. INTRODUCCIÓN Botrytis cinerea (teleomorfo de Botryotinia fuckeliana) es un fitopatógeno que causa la podredumbre gris en una amplia variedad de plantas de regiones templadas alrededor del mundo causando importantes perdidas económicas en la cosecha. Este es capaz de actuar como patógeno y como saprofito ha desarrollado resistencia a muchos fungicidas usados en su control. Es aceptado como un hongo que no posee un huésped especifico, debido a que se ha aislado de diferentes plantas y la infección puede ser reproducida en el laboratorio en un amplio rango de hospedantes. La diversidad somática, metabólica y genética reportada por este hongo ha sido atribuida a la heterocariosis y aneuploidia También es aceptado que la recombinación sexual juega algún rol pero esta fase sexual es raramente observada en el campo (Williamsom et al 2007). Botrytis cinerea aparece compuesto por dos genotipos, Transposa y Vacuma los cuales aislados son considerados especies (Giraud et al 1999). Transposa posee los elementos transponibles Boty y Flipper, mientras que Vacuma carece de estos elementos. Sin embargo ambos grupos son simpátricos. Boty, es un retrotransposon gipsy-like de 6 Kb, y Flipper es un elemento de clase II de 1872 pares de bases.estos patógenos poseen un alto grado de diversidad genotípica, 1

2 donde Vacuma es mas diverso que Transposa. Al parecer existe en el patógeno un cierto grado de especialización del huésped, lo cual sugiere que las que los aislamientos de Transposa pueden estar mas adaptados a la infección de vid que Vacuma. También se ha observado que la resistencia a funguicidas por ambas especies es significativamente distinta. MATERIALES Y METODOS Aislamientos fúngicos Se analizaron 9 muestras provenientes de la colección del Laboratorio de Fitopatología de la EEA Mendoza INTA, 2 aislamientos provenientes de la Fundación Ciencia para la Vida (Santiago de Chile, amablemente cedidos por la Dra Silva-Moreno) y dos aislamientos previamente caracterizados biológicamente provistos por la Dra Sanz de Tosetti (Sansone et al. 2000). El detalle de las muestras se presenta en la tabla 1. Tabla1 Procedencia de los aislamientos analizados Aislamiento Procedencia Variedad Estado fonológico Año de colección 1 Vista Flores Pedro Giménez Pasaje Invernal Vista Flores Syrah Pasaje Invernal Tres Uva de mesa Pasaje Invernal Vista Flores Pedro Giménez Pasaje Invernal Vista Flores Pedro Giménez Pasaje Invernal Vista Flores Pedro Giménez Pasaje Invernal Tres Syrah Pasaje Invernal Tres Syrah Pasaje Invernal Chile S/D S/D S/D 10 Chile S/D S/D S/D 11 San Luis S/D S/D S/D 12 San Luis S/D S/D S/D 13 Vista Flores Syrah Pasaje Invernal 2005 Extracción del ADN genómico El ADN genómico fue extraído por el método de Möller et al. a partir de micelio cultivado en agar-papa con glucosa al 1% (PGA) a 25 ºC durante 10 días. Su calidad fue analizada por electroforesis en gel de agarosa al 1% en TBE y teñido con bromuro de etidio y cuantificado por comparación contra un marcador de masa molecular. PCR y PCR-RFLP. RFLP. Detección de los elementos transponibles Boty y Flipper y amplificación de IGS. Las muestras fueron analizadas por PCR para determinar la presencia o ausencia de los elementos Boty y Flipper. Los primers utilizados para detectar Boty (Botty-R TAACCTTGTCTTTGCTCATC y Botty-L CCCAATTTATTCAATGTCAG) fueron diseñados en base a las secuencias disponibles en las bases de datos utilizando el programa Primer 3 (Rozen and Skaletsky 2000). Los primers para el elemento Flipper son los descriptos por Giraud et al.(1999) y para la secuencia espaciadora intergenica (IGS) los reportados por Giraud et.al (1997). El amplicón correspondiente a IGS fue digerido en forma individual por 5 enzimas de restricción ( Hae III, Bam HI, RsaI, Hind III, Hinf I y MvaI) durante 1 hora a 37 ºC. Los fragmentos fueron resueltos en un gel de agarosa al 2 % y teñidos con bromuro de etidio. 2

RESULTADOS Detección de IGS, Boty y Flipper por PCR Las reacciones de amplificación para cada uno de los

Todas las muestras amplificaron los fragmentos correspondientes a IGS y Boty, mientras que todas menos una de las

La restricción del amplicón IGS mostró una variabilidad similar a la ya reportada en trabajos previos (Giraud et

Los perfiles de restricción observados se muestran en la figura 2, y la distribución de las muestras, en la tabla

3 RESULTADOS Detección de IGS, Boty y Flipper por PCR Las reacciones de amplificación para cada uno de los fragmentos rindieron amplicones de los tamaños esperados (Figura 1). Todas las muestras amplificaron los fragmentos correspondientes a IGS y Boty, mientras que todas menos una de las muestras provenientes de Chile resultaron positivas solamente para el elemento Boty. La restricción del amplicón IGS mostró una variabilidad similar a la ya reportada en trabajos previos (Giraud et al. 1997). Los perfiles de restricción observados se muestran en la figura 2, y la distribución de las muestras, en la tabla 2. Figura 1. 1 Amplificación la de secuencia espaciadora intergénica (IGS), Boty (B), Flipper (F). Tabla 2. Patrón de restricción de IGS de Botrytis cinerea Enzima Alelo NUMERO DE MUESTRAS Hae III Tipo 1 Tipo 3 Tipo 4 BamHI Tipo RsaI Tipo 1 13 Hind III Tipo MvaI Tipo

4 Figura 2. Alelos detectados por PCR-RFLP del amplicón IGS. CONCLUSIONES En el presente trabajo se ajustó un método de diagnostico de laboratorio, que permite diferenciar las especies simpátricas Vacuma y Transposa del hongo Botrytis cinerea. Asimismo, se evaluó la técnica de PCR-RFLP para determinar la variabilidad genética de a región IGS. Se ha reportado previamente la asociación de estos marcadores genéticos con marcadores biológicos como son la resistencia o susceptibilidad a diversos funguicidas. La variabilidad observada en este reducido número de muestras sugiere una variabilidad biológica que será evaluada Estas herramientas permitirán evaluar a mayor escala la variabilidad genética local del hongo, y proponer estrategias razonadas de control. REFERENCIAS GIRAUD, T. FORTINI, D. LEVIS, C. LAMARQUE, C. LEROUX, P. LOBUGLIO, K and BRYGOO, Y. (1999). Two sibling species of the Botrytis cinerea complex, transposa and vacuma, are found in simpatry on numerous host plants. Phytopathology (89): GIRAUD, T. FORTINI, D. LEVIS, C. LEROUX, P and BRYGOO Y. (1997). RFLP Markers Show Genetic Recombination in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) and Transposable Elements Reveal Two Sympatric Species. Molecular Biology and Evolution (14): MÖLLER, E. BAHNWEG, G SANDERMANN, H and GEIGER H. (1992).A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plan tissues. Nucleic Acids Research (20): ROZEN S. and SKALETSKY H., (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp SANSONE, G., REZZA, I., CALVENTE, V., BENUZZI, D. and SANZ DE TOSETTI, M.I.,(2005) Control of Botrytis cinerea strains resistant to iprodione in apple with rhodotorulic acid and yeasts. Postharvest Biology and Technology (35): WILLIAMSON, B. TUDZYNSKI, B. TUDZYNSKI, P and VAN KAN, l. (2007). Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology (8):

5 Recibido: Octubre 2007 Aceptado: Octubre 2008 NDLR: Trabajo presentado en el IX Congreso Latinoamericano de Viticultura y Enología, 26 al 30 de Noviembre de 2007, Mendoza, Argentina. Si desea contactarse con alguno de sus autores, comuníquese a enologia@revistaenologia.com. 5

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