Análisis de secuencias

Transcripción

1 Curso Teórico práctico: ANÁLISIS FILOGENETICO Y FUNCIONAL DE COMUNIDADES MICROBIANAS Análisis de secuencias Pieter van Dillewijn Estación Experimental del Zaidín, CSIC

2 Análisis de secuencias 1)Introducción 2)Secuenciación 3)Como utilizar las técnicas de secuenciación 4)Análisis de secuencias

3 Introducción METAGENÓMICA Definición: El estudio de metagenomas: Metagenoma: el conjunto de todos los genomas de todos los (micro)organismos en un medio ambiente determinado Handelsman et al., 1998 Chemistry & Biology. Genoma: Conjunto de los genes de un individuo o de una especie. Gen: Secuencia de ADN que constituye la unidad funcional para la transmisión de los caracteres hereditarios.

4 ADN (ácido desoxirribonucleico) Introducción Transcripción Traducción Proteína adenina A timina T citosina C guanina G

5 Introducción Qué se puede estudiar/averiguar con la metagenómica: 1) Diversidad filogenética: 1.- estructura de comunidades a.- diversidad microbiana i.- identificación de los microorganismos en una comunidad ii.- cuantificación b.- relaciones filogenéticas c.- distribución 2.- dinámica de comunidades a.- cambios de poblaciones en el tiempo y el espacio 3.- biogeografía a.- distribución de microorganismos en el mundo 4.- Búsqueda y caracterización de nuevos organismos a.- utilizar información metagenómica para poder cultivar bacterias anteriormente no cultivables. 2) Metagenómica funcional 1.- Búsqueda de actividades enzimáticas nuevas 2.- Búsqueda de rutas metabólicas nuevas 3.- Búsqueda de productos nuevos 3) Metagenómica comparativa 1.- Secuenciación y comparación de genomas de bacterias 2.- Relacionar especies con funciones 3.- Relacionar función con hábitat (genes mayoritariamente presentes en un hábitat) 4) Evolución de genes

6 Introducción Diversidad filogenética: Que hay allí? Metagenómica funcional Que hace allí? Cómo vive y convive? Enzimas Rutas metabólicas

7 Introducción: Creación de librerías (meta)genómicas Lisis, extracción, purificación y obtención de ADN

8 La muestra Introducción: Creación de librerías (meta)genómicas Problemas y consideraciones Enriquecer? Técnicas Lisis, extracción, purificación y obtención de ADN Tipo de vector La bacteria hospedadora Tamaño de la librería Análisis de las librerías

9 Introducción: Creación de librerías (meta)genómicas Lisis, extracción, purificación y obtención de ADN Secuenciar Secuenciar

10 Secuenciación tipo Sanger Secuenciación: Clásica Precio para lecturas de pb: 6 lectura 8h

11 Introducción: Creación de librerías (meta)genómicas Lisis, extracción, purificación y obtención de ADN Secuenciar

12 Secuenciación Estrategias de secuenciación de librerías metagenómica Cebador del plásmido plásmido ADN desconocida < 1,5 kb Cebador reverso del plásmido Primer walking Cebador del vector ADN desconocida > 1,5 kb Cebador reverso del vector Cósmido, fósmido, BAC

13 Introducción: Creación de librerías (meta)genómicas Lisis, extracción, purificación y obtención de ADN Secuenciar Secuenciar

14 Secuenciación Estrategias de secuenciación Shotgun sequencing Librería (meta)genómica

15 Secuenciación: tamaños Como utilizar las técnicas de secuenciación 1) Cual es el objetivo? 1) Metagenómica filogenética 2) Metagenómica funcional 2) Cual es el mejor estrategia de utilizar? 1) Basada en homología con genes conocidas 2) Secuenciación de librerías metagenómicas previamente ensayadas 3) Secuenciación masiva de librerías o ADN del medio ambiente 3) Cuánto hay que secuenciar? 1) Tamaño de las genomas 2) Tamaños de las librerías 4) Qué método de secuenciación hay que utilizar? 1) Pirosecuenciación 2) Otros 5) Diseño experimental 1) Diseño de cebadores 2) Cuanto ADN, etc.

16 Metagenómica filogenética Objetivo y estrategia: Metagenómica filogenética Identificación y clasificación de bacterias Se basa en genes conservados que pueden ser utilizados como anclas filogenéticos Basada en homología con genes conocidas Estrategia: 1) Crear librerías de genes conservados 2) Buscar en los datos obtenidas tras la secuenciación masiva Basada en la secuenciación masiva 1) Ensamblar genomas enteras 2) Identificar la presencia de organismos según las secuencias obtenidas tras la secuenciación masiva

17 Metagenómica filogenética Genes conservados: Necesarios para el funcionamiento normal de la bacteria Una copia No transferencia horizontal Genes atpd (ATP sintasa) glnii (glutamina sintasa) 16S y 23S rarn (subunidades del ARN ribosomal) rpoa/b (ARN polimerasa factor) dnae (ADN polimerasa) fusa (factor de elongación) phes (fenilalanil tarn sintasa) gyra/b (girasa) reca (recombinasa) rada (proteína de reparación ADN ) hsp70 ( chaperona) Actividad Producción de energía Asimilación de nitrógeno ADN replicación, transcripción y traducción Sistemas de recombinación y reparación de ADN Plegamiento de proteínas

18 Metagenómica filogenética 16S rarn Problemas: 1.- Amplificación preferencial durante PCR a.- primer mismatches b.- hibridación diferencial por oligómeros a ADN molde 2.- Formación de artefactos en el PCR a.- formación de heteroduplexes b.- formación de quimeras 3.- Múltiple secuencias de 16S rarn en un genoma

19 Metagenómica funcional Objetivo y estrategia: Metagenómica funcional Identificación de proteínas, actividades enzimáticas, rutas metabólicas o productos Basada en homología con genes conocidas Estrategia: 1) Crear librerías de genes utilizando cebadores (semi)especificas 2) Buscar en los datos obtenidas tras la secuenciación masiva 3) Buscar en librerías metagenómica mediante sondas (hibridación) Basada en función Estrategia: 1) Analizar librerías metagenómica por la función (escrutinios) 2) Búsquedas de funciones según anotación o profile en los datos obtenidas tras la secuenciación masiva

20 Cuanto hay que secuenciar?

21 Cuanto hay que secuenciar Medidas de tener en cuenta Tamaño medio del genoma bacteriana 5 millones de pares de bases (5 x 10 6 b) Tamaño medio de un gen 900 a 1500 pares de bases Numero medio de genes por bacteria 4000 genes par de bases (b) = letra 1 página 1 gen 1 libro 5 x 10 5 letras/ pares de bases 1 genoma con 4000 genes 10 libros de 400 páginas 1Gb = mil millones de pares de bases 2000 libros 200 genomas

22 Cuanto hay que secuenciar? (Tamaño de la librería metagenómica) Cuanto hay que secuenciar Número de clones necesario = P = probabilidad deseable (90%= 0,9) G = Tamaño medio del genoma z = número de especies/ genomas T = tamaño inserto X = tamaño medio de un gen ln (1-P) ln (1- (T-X/G z))

23 Tamaño de la librería metagenómica Cuanto hay que secuenciar Número de clones necesario = P = probabilidad deseable (90%= 0,9) G = Tamaño medio del genoma z = número de especies/ genomas T = tamaño inserto X = tamaño medio de un gen ln (1-P) ln (1- (T-X/G z)) El factor G Animales Planta Hongo Protozoa Bacteria Archea Tamaño medio 5000 Mb 5000 Mb 10 Mb 1000 Mb 5 Mb 3 Mb 1 1x10 2 1x10 4 1x10 6 Mb Tamaño genómico

24 Tamaño de la librería metagenómica Cuanto hay que secuenciar Número de clones necesario = P = probabilidad deseable (90%= 0,9) G = Tamaño medio del genoma z = número de especies/ genomas T = tamaño inserto X = tamaño medio de un gen ln (1-P) ln (1- (T-X/G z)) El factor z Estimaciones de números de especies y bacterias en distintos medio ambientes 1.- suelo especies o 1x bacteria /g 2.- marino 2000 especies o 1x10 6 bacteria/ml 3.- intestino humano 1000 especies o 1x bacteria

25 Cuanto hay que secuenciar Cuántos clones para cubrir una genoteca de un especie Cuántos clones necesito para poder encontrar un gen en una genoteca de Pseudomonas T = 10 kb X = 1,5 kb G 6x10 3 kb z = 1 ln (1-0,9) ln (1- ((10-1,5)/ (6x10 3 1)) = 1624 clones 16 Mb Cuántos clones para cubrir una comunidad compleja Para encontrar un gen en una muestra marina con un estimada 2000 genomas Incrementa el factor z T = 40 kb X = 1,5 kb G 5x10 3 kb z = 2000 genomas ln (1-0,9) ln (1- ((40-1,5)/ (5x )) = 6,0 x 10 5 clones 24 Gb Contaminación con ADN eucariota? Encontrar un gen en una muestra marino con 2000 especies distintas de bacteria y 20 especies de algas (100 Mb genomas) y 10 especies de protistas (50 Mb genomas) Incrementa el factor G ln (1-0,9) = 7,5 x 10 5 clones 30 Gb ln (1- (((40-1,5)/ ((5x ) + (100x ) + (50x ) )

26 Cuanto hay que secuenciar Microplaca de 384 pocillos 10 4 clones = 26 placas 10 5 clones = 260 placas 10 6 clones = 2605 placas Cuántos clones para cubrir comunidades complejas Se estima que se necesita entre 10 6 y clones BAC con insertos de 100 kb para cubrir todos los genomas presentes en un gramo de suelo que es equivalente a 1x Mb de secuencia de ADN. En escrutinios para detectar actividades se calcula que 1 entre Mb ADN pueden dar positivos lo que significa librerías de millones hasta mil millones de clones. Se estima que si se quiere ensamblar el genoma completo de una bacteria del medio ambiente con shotgun sequencing haría falta secuenciar un mínimo de 6 x10 9 bp y 1000 veces más para obtener las secuencias de 1000 genomas

27 Qué método de secuenciación hay que utilizar?

28 454 Pirosecuenciación (Roche) Secuenciación: Segunda generación ADN muestra Fragmentación y unión a adaptadores Unión a nanopartículas PCR con cebadores con adaptadores Amplificación en emulsión Introducción de las nanopartículas en las microplacas

29 454 Pirosecuenciación Secuenciación: Segunda generación Regiones Numero de lecturas

30 454 Pirosecuenciación Secuenciación: Segunda generación Imagen de las señales luz Se pasan las bases en forma secuencial: todo adenina, todo citosina, todo guanina, todo timina y detecta la luz emitida. La señal de luz es directamente proporcional a la repetición de la base en la secuencia Precio para lecturas de pb: 0,025 a 0,011 / lectura Millón lecturas por microplaca x2 1Gb /1 dia

31 Secuenciación tipo (Solex) Illumina Secuenciación: Segunda generación El ADN es cortado, seleccionado por su tamaño y ligados a un oligo a cada término El flow cell tiene oligos unidos covalentemente El ADN hibrida a los oligos del flow cell Amplificación para formar miles de copias en micro-colonias Se quita la hebra reverso Se añaden un cebador universal (forward primer)

32 Secuenciación: Segunda generación Secuenciación tipo (Solex) Illumina ~ 100 pb por lectura Hasta 25 Gb (25 x10 9 b) = hasta 250 milliones de lecturas 1,5 dia $ para 90 Gb

33 Secuenciación: Segunda generación Secuenciación tipo SOLiD (Applied BioSystems) Fragmentación y unión a adaptadores o librería creados con PCR con cebadores y adaptadores Unión a nanopartículas amplificación en emulsión Escalar Unión de nanopartículas a placa de vidrio

34 Secuenciación tipo SOLiD Secuenciación: Segunda generación Hasta 75 bp por lectura Hasta 300 Gb (300x10 9 bp) = hasta 4000 millones de lecturas $ /exp 1-14 dias

35 Otros tipos de secuenciación Secuenciación: Próxima generación Nanoporos Usar un nanoporo con una apertura apenas lo bastante grande como para pasar una sola hebra de ADN. Aplicando un pequeño corriente de iones a través del nanoporo, las características eléctricas de cada uno de los nucleótidos que constituyen la esencia del ADN genera una "firma" eléctrica distintiva

36 Diseño experimental Técnica Aplicación Pirosecueciación ILLUMINA SOLiD Divisiones posible del placa 1,1/2,1/4,1/8 8 carriles 1, 1/4,1/8 Shotgun librarías Amplicon librarías X X Re-secuenciación ± Secuenciación Transcriptomica ±

37 Diseño experimental Calidad del ADN: - doble cadena, no degradado, y sin partículas - pura (purificado por columna o de gel de agarosa - A260/280 valor de 1,8 o más Cantidad de ADN 1.Pirosecuenciación * Todos las muestras deben tener una concentración de 100ng/µl 2. ILLUMINA (Solex) - 1~5µg de ADN con una concentración de 100 ng/µl (al menos 100 µl de 100ng/µL ) 3. SOLiD HMW(>1.5kb) LMW(70~500bp) Paired End 5~10µg 1~5µg 5~10µg Low Complexity DNA 20ng~2ug High Complexity DNA 2ug or above * Todos las muestras deben tener una concentración de 100ng/µl

38 Metagenómica filogenética V7 V4 V6 V5 V3 V8 Que cebador utilizar? V1 V2 V9 aaattgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtaacaggaagaagcttgctctttgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgt ctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggatt agctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatat tgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtaaagttaatacctttgctcattgacgttacc CGCAGAAgaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtTTGTTAAGTCAGATGTGAAATC V4 V2 CCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcg gccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggctt V1 V3 V5 CCggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaga V6 V7 accttacctggtcttgacatccacggaagttttcagagatgagaatgtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccg caacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagg V8 gctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcg ctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctta V9 ccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctta

39 Secuenciación: Como 454 Pirosecuenciación: Librerías de amplicones 2µg o mas a una concentración de 100 ng/µl Mezcla con cantidades iguales de cada amplicon: 10 µl de 10ng/µl

40 Análisis de secuencias

41 Análisis de datos Analizar secuencias de 16S rarn Limpiar secuencias SANGER PIROSECUENCIACIÓN Ribosomal database Project (RDP) Pyrosequencing Pipeline: 1) Organizar secuencias según su secuencia MID 2) Limpiar secuencias: Eliminar secuencias con tamaños imposibles Eliminar secuencias con bases ambiguos

42 Análisis de datos Analizar secuencias de 16S rarn Cebador del plásmido plásmido gen16s desconocida < 1,5 kb Cebador reverso del plásmido DNA BASER A. Quitar secuencias del plásmido B. Ensamblar secuencias con su secuencia reverso

43 Análisis de datos Analizar secuencias de 16S rarn Herramientas bioinformáticos para 16S rarn: SILVA rrna Database Project: Ribosomal Database Project: GENBANK: BLAST: Procesos: 1) Comprobar secuencias por artefactos: heteroduplexes, quimeras 2) Búsqueda de secuencias idénticas o parecidas en los bases de datos 3) Alineamiento de secuencias

44 Análisis de datos Analizar secuencias de 16S rarn Herramientas bioinformáticos para 16S rarn: Árboles filogenéticos: taxonomía comparativa

45 Análisis de datos Analizar secuencias de 16S rarn Estudios estadísticas: Grado de biodiversidad: 1) Riqueza observada: Curvas de rarefacción DOTUR, MOTHUR, ESPRIT 2) Riqueza especifica: Índice Chao 3) Índice Shannon-Wiener Número de OTUs observado No dif. 3% dif 10% dif. 20% dif. 31 esp. 8 filo OTU= operational taxonomic unit 80% similitud = filo 97% similitud = especie Las curvas de rarefacción se utilizan para predecir el número de especies en una muestra del medio ambiente y en qué medida se han analizado suficientes secuencias (coverage). Número de secuencias mostreados Estudios comparativas (similitud entre muestras) Índice Jaccard Índice Sørensen Índice Theta

46 Análisis de datos Analizar secuencias para secuenciación masiva Herramientas bioinformáticos: Ensamblaje de fragmentos Identificación de genes (anotación): Metagene software: BLAST: GenDB: MicHanThi : JCoast: Información filogenética: Genome DB:

47 Ejemplos Estudios metagenómicos de secuenciación masiva de muestras del medio ambientales y relacionados can la salud animal Human Microbiome Project (HMP) Sedimento marina Varios lagos eg. Lagos de Antártida Varios zonas marinas Varios manantiales geotermales Varios suelos eg. terragenome

48 Ejemplos Estudios metagenómicos Medio ambiente estudiado Lecturas/ bp secuenciado Resultados Referencia Biopelícula en un efluente de minas En primera instancia hicieron una librería de 16S rarn para averiguar si la diversidad que era baja. Luego produjeron una librería con fragmentos de 3,2 kb e hicieron 103,462 lecturas mediante shotgun sequencing para obtener 76.2 millones bp de secuencia. SANGER Lograron ensamblar casi el genoma completo de Leptospirillum group II and Ferroplasma type II, y parcialmente otros 3 genomas. Análisis de cada genoma reveló rutas para la fijación de carbono y nitrógeno y la generación de energía. Tyson et al., 2004 Nature 428: Mar de Sargasso 1,66 millones de lecturas resultaron en mil millones de bp en secuencia SANGER Estimaron la diversidad de 1800 especies distintas incluidos 148 nuevos filotipos. Encontraron 1.2 millones de genes nuevos incluyendo 782 nuevos fotorreceptores. Venter et al 2004 Science 304:66-74 Global Ocean Sampling (41 muestras en 8000 km desde el Norte de Océano Atlántico a a Sur del Océano Pacifico Secuenciaron 7,7 millones de lecturas de 800 bp cada uno (6,3 mil millones de bases) SANGER Consiguieron definir nuevas especies de bacterias y casi consiguieon ensamblar el genoma de una especie dominante e identificaron nuevas familias de proteínas. Rusch et al., 2007 PLoS Biology 5:e16 9 medioambientes: Subterráneo, salino, marino, agua dulce, coral, microbialitos, pescado, animal, mosquito 1,040,665 lecturas bacterianas de 45 muestras distintas y secuencias virales de 41 muestras distintas. Resultó en aproximadamente 150 mil millones de bp de secuencia PIROSECUENCIACIÓN Este estudio comparativo demuestra que aunque la diversidad funcional se mantiene en los distintos medio ambientes existen diferencias relativas que permiten predecir las condiciones biogeoquímicas de cada medio ambiente. Dinsdale et al 2008 Nature 452:

49 Ejemplos Estudios metagenómicos Medio ambiente estudiado Lecturas/ bp secuenciado Resultados Referencia Oceano Ártico, 8 muestras en distintas localizaciones y profundidades lecturas de 16S rarn de archea de 8 muestras con un media de lecturas por muestra. PIROSECUENCIACIÓN Los resultados revela las características biogeográficas de los archea marinas del ártico y como ciertos tipos de archea dominan en las distintas profundidades del océano ártico. Galand et al 2009 ISME J. 3: Piel humano (Skin Microbiome) de 20 sitios en 10 individuos en dos distintos tiempos 112,283 sequencias casi completas del gen 16S rarn SANGER El analisis reveló que habia mucho variabilidad entre individuos y menos dentro el mismo individual. Dependiendo de la localizacion, los comunidades eran más diversos los sitios entre los dedos del pie, axila y umbligo y/o más estable en el tiempo. Grice et al 2009 Science 324: Distintos zonas del cuerpo humano: 18 zonas de piel, heces, boca, nariz, cabello, oreja en distintas adultos tomadas en distintos tiempos >1,070,000 lecturas de 16S rarn para obtener una media de 1315 secuencias por muestra PIROSECUENCIACIÓN Observaron que la biodiversidad microbiana depende de la localización en el cuerpo. Se observaron mucha variabilidad entre individuales en todas las zonas del cuerpo pero relativamente gran estabilidad entre el mismo individual en el tiempo. Zonas de piel como la palma del mano, el antebrazo, dedo índice, detrás del rodilla y en la planta del pie mostraron igual o más biodiversidad que el intestino o boca Costello et al 2009 Science 326, Intestino humano Analysis de 3,3 millones de genes de 576,7 Gb de secuencias de muestras faecales de 124 humanos. ILLUMINA El número de genes es 150 veces mayor que los en el genoma humano. Se detectaron entre 1000 y 1150 especies bacterianas. Qin et al 2010 Nature 464: manantiales geotermales del parque nacional de Yellowstone con distintas propiedades fisicoquímicas a lecturas por muestra. SANGER Los datos revelaron que ciertos filos predominan según las condiciones de cada manantial. Las actividades enzimáticas que encontraron indican cuales son las funciones importantes en cada medioambiente especialmente actividades relacionados con el transporte de electrones. Inskeep et al PLoS ONE 5: e9773

50