Boletín de Actualización. Métodos de diagnóstico de los virus fitopatógenos 3. Dependientes de la proteína viral

Transcripción

1 1 Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales Centro de Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI) Boletín de Actualización Métodos de diagnóstico de los virus fitopatógenos 3. Dependientes de la proteína viral Introducción Estos métodos son los más ampliamente usados en la actualidad para la detección y diagnóstico de virus fitopatógenos. Se basan en el reconocimiento de las proteinas virales, aunque en la mayoría de los casos se trata de la proteína que forma la cápside del virus. Esta puede estar en partículas intactas, en fragmentos de un virus desarmado, o ser producto de la expresión en un sistema experimental. El reconocimiento se realiza utilizando métodos serológicos. Estos se basan en la interacción entre estas proteínas, que constituyen los antígenos, y unos anticuerpos específicos producidos contra ella en un vertebrado. Antisueros y anticuerpos Los reactivos básicos usados para el reconocimiento de las proteínas virales, son los antisueros conteniendo los anticuerpos capaces de reaccionar (unirse) específicamente con las proteínas de un patógeno en una muestra problema. Los mismos se obtienen aprovechando la respuesta inmune de los vertebrados ante moléculas extrañas (anticuerpos), Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulinas (proteínas) producidas por los linfocitos B en la sangre ante el estímulo de un antígeno (molécula extraña). Se encuentran en el suero sanguíneo. Cada molécula de anticuerpo tiene sitios capaces de reconocer al antígeno que le dio origen y pegarse a él (Fig 1.. Existen cinco clases de inmunoglobulinas, de las cuales la más abundante es la IgG (Fig. 1). El antígeno puede estar constituído por: partículas virales, proteínas virales, células bacterianas o algunos de sus componentes, el o alguno de los constituyentes del talo de los hongos, péptidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lípidos, etc. El fundamento de esta disciplina es el reconocimiento de lo que se designa como epitope del antígeno (porción formada generalmente por cinco aminoácidos) por parte del anticuerpo cuya zona capaz de realizarlo se llama paratope. 1

2 2 Para la obtención de estos anticuerpos se debe inyectar a un animal de sangre caliente el antígeno purificado (un patógeno o alguno de sus componentes), que provocará la aparición de los anticuerpos específicos en el suero. Ese antisuero servirá como una herramienta para detectar la presencia del fitopatógeno en una muestra problema y establecer de esta manera el diagnóstico de una enfermedad, como así también para una variedad de estudios cuali y cuantitativos. La virología es la rama de la fitopatología que más se ha beneficiado de los adelantos en materia de técnicas serológicas. En la actualidad las técnicas de diagnóstico de virus más específicas, sensibles, simples y baratas para analizar gran número de muestras en poco tiempo, son las técnicas serológicas con anticuerpos específicos. La serología actual ofrece posibilidades que no existían hace dos décadas atrás. La aplicación de las técnicas inmunoenzimáticas - ELISA - a los virus de plantas en 1977 y posteriormente la obtención de anticuerpos monoclonales específicos, usados por primera vez en virología vegetal en 1982, ampliaron significativamente las posibilidades de la serología, al resolver los dos grandes requerimientos de un sistema de diagnóstico: la sensibilidad y la especificidad. La condición limitante de la serología es la posibilidad de producir anticuerpos de buena calidad a partir de una antígeno, aunque sin embargo esto ofrece cada vez menos dificultades en el caso de casi todos los patógenos conocidos. Esquema de la obtención de antisueros para virus de plantas: - Multiplicación del virus en plantas susceptibles en condiciones controladas. - Purificación del virus (separación entre las partículas virales y los componentes normales de la planta, por clarificación, centrifugaciones diferenciales y gradientes). La eficacia de este proceso determinará en gran medida la calidad del antisuero obtenido. - Inyección de virus purificado (antígeno) en un vertebrado. ( Se debe seguir un esquema de inmunización determinado en cada caso, por ejemplo 4 inyecciones intramusculares semanales seguidas de tres inyecciones endovenosas y sangrado una semana después de la última). - Sangrado del animal y coagulación de la sangre. - El suero que debe contener los anticuerpos específicos se titula (se determina cuál es la última dilución que reacciona con el antígeno correspondiente) y se 2

3 3 determina si reacciona con componentes de la planta sana. Estas dos características nos definirán su calidad. - El suero se almacena a -20ºC con 0,01% de azida sódica (veneno que impide el crecimiento de contaminantes durante el desarrollo de los análisis). Anticuerpos Monoclonales Los antisueros policlonales contienen una población de anticuerpos diferentes, producidos cada uno por un linfocito B determinado, que en conjunto son capaces de reconocer diferentes epitopes del antígeno que le dio origen. Cada uno de estos linfocitos B, productor de un solo tipo de anticuerpo, puede ser inmortalizado y de esta manera producir anticuerpos (monoclonales) que reaccionan sólo con un epitope del antígeno en particular. En 1975, Milstein y Kohler propusieron una técnica para inmortalizar células formadoras de anticuerpos específicos (linfocitos B) por fusión con células de mieloma, creando así un método para producir reactivos inmunológicos homogéneos y bioquímicamente definidos, llamados anticuerpos monoclonales. La hibridización de los linfocitos B con células de mieloma maligno dan como resultado células nuevas, llamadas hibridomas, que combinan la capacidad de producir anticuerpos específicos con el crecimiento continuo en un medio de cultivo adecuado. El cultivo y la selección de estos hibridomas permite el desarrollo de anticuerpos monoclonales de idéntica especificidad y actividad dirigida a un solo epitope del antígeno que se usó en la inmunización inicial (Fig. 2). A partir del cultivo de estas líneas celulares, la presencia de los anticuerpos en el líquido sobrenadante es continua. Los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que pueden hacerse a partir de antígenos no muy purificados, pudiendo obtenerse en cantidades practicamente ilimitadas, a lo largo del tiempo. Son muy específicos, permitiendo detectar razas de virus. Sin embargo su preparación es muy trabajosa y cara y no siempre contituyen el instrumento más apropiado para el diagnóstico por su alta especificidad. Los anticuerpos monoclonales se utilizan con los mismos métodos que los policlonales. Constituyen una valiosa herramienta para muchos estudios, aunque no los reemplazan sino que tienen una aplicación complementaria. 3

4 4 Prácticamente todos los reactivos específicos y generales para las pruebas serológicas pueden obtenerse comercialmente, previéndose un amplio desarrolo y un uso mucho más generalizado de estas técnicas en el futuro. Técnicas Serológicas Cuando se ponen en contacto una muestra problema y el antisuero, el antígeno presente en la misma se combinará con los anticuerpos. Sin embargo, esta reacción no es posible de constatar a simple vista. Para detectarla se han diseñado diversas técnicas, describiéndose a continuación las más usadas para diagnóstico de virus y bacterias en Fitopatología : microprecipitación difusión en agar - doble difusión en agar (Ouchterlony) técnicas inmunoenzimáticas - ELISA, ensayo de inmunoabsorción conjugado a enzima (enzime-linked immunosorbent assay) - DIA, inmuno ensayo sobre membranas (dot immunobinding assay) técnicas de Inmunofluorescencia: - directa - indirecta - tinción de colonias por inmunofluorescencia inmunoelectromicroscopía inmunoaislamiento Las técnicas serológicas más usadas para diagnóstico de bacterias son Inmunofluorescencia, ELISA e inmunoaislamiento. Las técnicas de aglutinación y doble difusión permiten identificar bacterias en cultivos puros, pero su sensibilidad es muy baja. Para diagnóstico de virus se usan preferentemente las técnicas inmunoenzimáticas, donde la reacción se detecta por la aparición de color. 4

5 5 1 - DOBLE DIFUSION EN AGAR (OUCHTERLONY). Se basa en la precipitación visible de antígenos y anticuerpos cuando se encuentran en las concentraciones adecuadas en un soporte de agarosa. Se usa para determinar el título de un antisuero y para establecer relaciones entre aislamientos de un patógeno. Su utilidad para el diagnóstico ha disminuído desde la aparición de las técnicas inmunoenzimáticas. 2 - ELISA El ensayo inmunoenzimático conocido como ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) se desarrolló a partir de la demostración de que la unión covalente de una molécula de anticuerpo a una enzima conservaba la inmunoespecificidad del anticuerpo y el poder catalítico de la enzima. Por otro lado, se aprovecha la capacidad de las moléculas de anticuerpos, en particular de la inmunoglobulina G, de pegarse a la superficies de poliestireno. La técnica consiste en disponer sucesivas capas de reactivos, que culminan en la hidrólisis enzimática de un sustrato, que pasa de sustancia incolora a coloreada, cuya intensidad de color se puede medir en un espectrofotómetro. Existen distintas combinaciones de los reactivos, es decir distintos tipos de ELISA, según las conveniencias y disponibilidades en cada caso. Los anticuerpos monoclonales han mejorado las condiciones de la prueba en muchos casos. Existen algunas empresas que ofrecen una amplia selección de anticuerpos mono y policlonales, así como el resto de los reactivos usados en la prueba. Como ya hemos dicho, es la prueba más rápida, simple y sensible para el diagnóstico de los virus. Sin embargo, ELISA es mucho menos sensible que otros métodos para detectar bacterias. Tiene también problemas de falta de especificidad. Se usa como técnica de diagnóstico sólo para algunas especies de bacterias fitopatógenas y para fitoplasmas, siendo posible en estos casos detectar al patógeno en tejidos de plantas, en la rizósfera y en semillas, sin necesidad de aislar y cultivar al patógeno previamente. Tiene la ventaja sobre todos los otros métodos de diagnóstico de permitir el análisis de gran número de muestras en poco tiempo. Aquí se describe la forma original de esta prueba: DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich) (Fig. 3) 5

6 6 1 - Colocar en cada celdilla µl de antisuero diluído en buffer de cubierta. La dilución será la establecida en cada caso por la prueba de calibración de cada partida de antisuero. Incubar 4 hs a 37ªC 2 - Lavar 3 veces con buffer PBS (buffer fosfato salino) ½, 0,05% Tween 20, 3 minutos cada vez. 3 - Agregar la muestra, en una relación 1:10 P:V, en buffer PBS con el agregado de 3% leche descremada. Incubar toda la noche a 4ºC. 4 - Lavar como en Agregar el antisuero conjugado a la fosfatasa alcalina, en una concentración dada por la calibración, en el mismo buffer que la muestra. Incubar 4 horas a 37ºC. 6 - Lavar como en Agregar el sustrato, p-nitrofenil fosfato, en una concentración entre 0,6 y 1 mg/ml, en buffer con dietanolamina. Esperar la aparición de color amarillo en los testigos positivos. Leer en espectrofotómetro a A DOT IMMUNOBINDING ASSAY Se aprovecha en esta técnica la capacidad de las proteínas (antígenos) de pegarse a membranas de nylon o nitrocelulosa. Se siembran gotas de jugo de plantas enfermas sobre estas membranas, para luego sumergirlas en una solución con el antisuero específico. A continuación sigue una reacción enzimática semejante a la descripta en el caso de DAS ELISA. En el caso de una reacción positiva, se visualiza sobre la membrana el color del sustrato modificado en el lugar donde se sembró el jugo. 4 - TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA La detección del antígeno se hace por medio de pigmentos fluorescentes unidos a los anticuerpos. a - Inmunofluorescencia Directa: El pigmento fluorescente se pega al antígeno específico para el patógeno que se quiere detectar (anticuerpo primario). La muestra se coloca sobre un portaobjetos, luego se pone en contacto con el antisuero marcado, el cual luego de un período de incubación, se unirá al antígeno. La observación en un microscopio con la iluminación adecuada, mostrará al antígeno fluorescente sobre un fondo oscuro (Fig. 4). 6

7 7 b- Inmunofluorescencia Indirecta: el pigmento fluorescente se pega a un anticuerpo preparado contra el anticuerpo primario. (Si el anticuerpo primario - específico para reconocer un virus- está preparado en conejo, el secundario es un anticuerpo anti-conejo, que se pegará a ese anticuerpo específico de conejo). De esta manera se mejora la sensibilidad de la prueba (Fig. 5). Virus - Esta técnica se usan para ubicar los virus en los tejidos de las plantas, o de los insectos, para medir el progreso de la infección viral en las plantas, establecer formas de movimiento de los virus en los tejidos, etc. Si bien existen técnicas de diagnóstico de virus por este método, no pueden competir en sensibilidad y especificidad con las técnicas inmunoenzimáticas. Bacterias - La inmunofluorescencia directa e indirecta se usa para diagnóstico de bacterias y para detectar bacterias en semillas u otros tejidos vegetales, como así también para determinar razas. Es particularmente útil por su gran sensibilidad y porque permite observar directamente la morfología de la bacteria teñida, lo cual facilita la detección de falsos positivos. Sin embargo, al igual que ELISA, no permite distinguir bacterias viables de las que no lo son. c- Tinción de Colonias por Inmunoaislamiento. Esta técnica, usada exclusivamente para bacterias, se basa en la posibilidad de teñir colonias bacterianas que desarrollan en un medio de cultivo con anticuerpos marcados con un colorante fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína), de modo que después de identificadas puedan ser reaisladas. Las placas sembradas con la suspensión bacteriana problema incorporada al agar cuando aún está licuado (45 C) se incuban durante horas hasta observar el desarrollo de pequeñas colonias individuales. Se incorpora entonces el antisuero diluido conjugado con un colorante fluorescente y se incuba. Se observa la placa con microscopio de fluorescencia a muy bajo aumento. Las colonias se seleccionan por morfología y fluorescencia bajo UV. 5 - INMUNOELECTROMICROSCOPIA Este método combina la posibilidad de observación directa del microscopio electrónico, con la capacidad de pegado de las proteínas virales a anticuerpos específicos. Las grillas usadas en microscopía se sensibilizan con anticuerpos, luego se siembra la muestra y posteriormente se hace la tinción negativa clásica. Si la 7

8 8 muestra contiene el antígeno compatible con el antisuero usado, las partículas virales aparecerán en una densidad mucho mayor que en grillas sin sensibilizar. Otra posibilidad es la decoración. En este caso, el antisuero se aplica luego de la muestra, dando un contorno más notable a las partículas ya captadas por la grilla. Puede combinarse el uso del antisuero antes de la muestra y luego de ella. Si los anticuerpos que se aplican luego de la muestra están unidos a esferas de oro, las partículas identificadas por el antisuero aparecerán al microscopio marcadas con círculos negros (electrodensos). Las técnicas de inmunoelectromicroscopía son sensibles y útiles para ciertos estudios, aunque no son apropiadas cuando hay que analizar gran número de muestras. 6 - INMUNOAISLAMIENTO. El objetivo del inmunoaislamiento es "atrapar" a la bacteria buscada a partir de una mezcla de bacterias, antes de sembrarlas en un medio de cultivo específico que permita el crecimiento y posterior reconocimiento de la bacteria problema. En su forma más simple la técnica consiste en recubrir varillas de vidrio con esmalte de uñas en acetona (33%V/V) y luego ponerla en contacto con anticuerpos (preparados contra antígenos bacterianos superficiales). La varilla así tratada se emplea para macerar una muestra de tejido vegetal o semillas en estudio. Luego de incubar la varilla se la lava para eliminar otros microorganismos y se siembran las bacterias "pegadas" sobre una placa de Petri con medio de cultivo. Esta se incuba en condiciones adecuadas para detectar si se desarrollan las colonias de la bacteria "problema". (Fig. 6) Su ventaja reside en que detecta sólo células viables, capaces de desarrollar en la placa de cultivo. 8

9 9 BIBLIOGRAFIA - Dal Bó E., M.E. Sánchez, G. Chiarrone y L. Ronco Detección del virus del bronceado del tomate (TSWV) mediante un ensayo inmunoenzimático sobre improntas de tejidos. Invest. Agr.:Prod.Prot. Veg. 10: - Clark A. and A. Adams Characteristics of the Microplate Method of Enzymelinked Immunosorbent Assay for the Detection of Plant Viruses. J. Gen Virol. 34: Duncan J.M. and L. Torrance Techniques for the rapid Detection of Plant Pathogens. Br. Society for Plant Pathology, Blackwell Scientific Pub.,Oxford, 235pp. - Hampton R., E. Ball E. y H. de Boer, eds Serological Methods for the Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant Pathogens. APS Press, 390 pp. - Hyatt A. and B. Eaton, eds Immuno-gold Electron Microscopy in Virus Diagnosis and Research. CRC Press. 448 pp. - Klement Z., K. Rudolf and D.C. Sands Methods in Phytobacteriology, Academiei Kiado, Budapest, 568pp. - Llacer G. M.M.López, A. Trapero y A. Bello, eds Patología Vegetal, Tomo I. Sociedad Española de Fitopatología 820pp. - Matthews R.E.F Plant Virology, third Edition, Ac. Press, Inc., 835 pp. - Milne R. y D. Leseman Immunoabsorbent electron microscopy in plant virus studies. Methods Virol. 8,

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11 11 Figura 4 - Esquema de Inmunofluorescencia directa Figura 5 - Esquema de inmunofluorescencia indirecta Figura 6 - Inmunoaislamiento 1 - Pegado de los anticuerpos contra antígenos bacterianos de superficie a una varilla de vidrio. Luego se lava vigorosamente. 2- Incubación de la varilla sensibilizada en la muestra para atrapar la bacteria "problema". 3 - Rotura mecánica de la reacción antígeno anticuerpo sobre la superficie del agar para preparar cultivos de la bacteria "atrapada" 11