LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR) Ponentes: Maritza González-Hoyuela Mª Eugenia Barbero López

Transcripción

1 LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR) Ponentes: Maritza González-Hoyuela Mª Eugenia Barbero López

2 I-GENERALIDADES DEL LCR II-PROTEINAS DEL LCR Y SU IMPORTANCIA III-ANALISIS MICROBIOLÓGICO DEL LCR IV-CASO CLÍNICO

3 ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA Formación: Plexos coroideos, a través de procesos de ultrafiltración y secreción activa. Volumen: o Adultos: ml o Neonatos: ml Funciones: o Colchón protector para el tejido nervioso central o Recogida de productos de desecho o Circulación de nutrientes BHE: o Epitelio de plexos coroideos o Endotelio de los capilares en contacto con el LCR

4 INTERES CLINICO DEL LCR Infecciones del SNC Procesos vasculares Enfermedades desmielinizantes Tumores del Sistema Nervioso Central Identificar la naturaleza del líquido en fístulas nasales u óticas

5 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA La Presión normal del LCR es: Adultos: 90 a 180 mm Hg Niños: mm Hg

6 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Con presiones normales, pueden extraerse hasta 20 ml de LCR sin ningún peligro. Si la presión inicial es >200 mm Hg, no deben extraerse más de 2 ml. Alícuotas Tubo 1: estudios bioquímicos e inmunológicos Tubo 2: exámen microbiológico Tubo 3: recuento de leucocitos y su contaje diferencial.

7 EXAMEN MACROSCÓPICO DEL LCR El LCR es claro y sin color. En presencia de alteraciones, el líquido puede adquirir diferentes aspectos: o TURBIDEZ Presencia de gérmenes: > 10 5 UFC Pleocitosis: más de 200 leucocitos / µl Existencia de hematíes: más de 400 / µl Nivel elevado de proteínas

8 EXAMEN MACROSCÓPICO DEL LCR o Coágulos por fibrinógeno: Punción traumática o meningitis purulenta. No aparece en Hemorragia Subaracnoidea o Viscosidad aumentada: Meningitis criptococcica o metástasis meníngea o Existencia de glóbulos de grasa de diversos tamaños en el LCR: o embolismo graso en el cerebro o Color : Rojizo: hematíes Verdoso: liberación de mieloperoxidasa Amarillo: liberación de bilirrubina

9 XANTOCROMIA Color amarillo, naranja o rosáceo del LCR tras su centrifugación? Lisis de hematíes? Hemorragia subaracnoidea 4-6 horas 12 h 6-10 días

10 DIFERENCIAS ENTRE HSA Y PUNCIÓN TRAUMÁTICA Determinaciones Aspecto tubo 1,2,3 Coágulos Sobrenadante Espectrofotometría Entre 370 y 530 nm Punción traumática Desigual A menudo Incoloro Negativo Hemorragia subaracnoidea Igual No se observa Xantocrómico Pico a 415(oxiHb). Pico a nm (Bb)

11 EXAMEN MICROSCÓPICO DEL LCR Células: Escasas, de tipo monocítico. Lisis de 40% en 2 horas a temperatura ambiente. Neonatos: Hasta células. Niños y adultos: Hasta 5-10 células. Punción traumática: Corregir en número de células restando un leucocito por cada 700 hematíes. La cifra total de hematíes tiene escaso valor. Su principal aplicación es corregir el recuento leucocitario o la concentración de proteínas (1mg por cada 1000 hematíes)

12 LEOCITOSIS POR EUTRÓFILOS PLEOCITOSIS PLEOCITOSIS POR LINFOCITOS ugiere diagnóstico de meningitis acteriana. omienzo de las meningitis víricas emorragia cerebral ármacos intratecales LEOCITOSIS POR OSINOFILOS e observa rara vez con recuentos iscretos en procesos flamatorios sistémicos o sociados a infecciones Se asocia a meningitis vírica Micobacteria Tb o micótica Neurosífilis Meningitis por Listeria Esclerosis múltiple PLEOCITOSIS POR CÉLULAS TUMORALES Tumor primario o metástasis Diseminación meníngea de Leucemia o linfomas

13 ANALISIS BIOQUÍMICO DEL LCR GLUCOSA Procede de la glucosa sanguínea por mecanismos de transporte activo y difusión por gradiente de concentración. Glucorraquia: 60 % de la concentración plasmática. Neonatos: Cociente: LCR/Sangre 0.4 y 2.5 Hiperglucorraquia: Por hiperglucemia. Hipoglucorraquia: Por meningitis bacteriana cociente < 0.4 LACTATO Es independiente de la concentración plasmática. (Valores: 1-3 mm/l). Refleja el metabolismo cerebral anaerobio por hipoxia. Aumenta: Infarto cerebral,edema, trauma o meningitis.

14 ESTUDIO DE LAS PROTEÍNAS DEL LCR Diagnóstico y seguimiento de las distintas enfermedades neurológicas que cursan con alteraciones de la concentración y de la composición proteica en el LCR 1) Evaluación del grado de afectación de la BHE consecutivo a inflamación. 2) Detección de procesos que impliquen una RI en el SNC. 3) En procesos degenerativo-destructivos del SNC.

15 PROTEÍNAS DEL LCR O R I G E N Plasma LCR: ~ 80% Mecanismos: difusión pasiva, transporte activo. Características de paso: o Constantes físico-químicas o Concentración en el plasma o Estado funcional BHE Síntesis intratecal: ~ 20% F I S I O P A T O L O G Í A Alteraciones en la Concentración de proteínas en el LCR : 1) Aumento del paso de las proteínas del plasma al LCR por : Alteración de la BHE. Obstrucción a la libre circulación del LCR 2) Aumento de la síntesis o liberación de proteínas in situ.

16 Valores de referencia de la Concentración de proteína en el LCR PROTEÍNA TOTAL Según origen Ventricular Cisternal Lumbar Según la edad 1 30 días 1 90 días 3 6 meses 0,5 10 años años años años >60 años Según el método Modificación del Biuret (36) Turbidimetría (TCA) Lowry g / L 0,050 0,150 0,150 0,250 0,150 0,450 0,200 1,500 0,200 1,000 0,150 0,500 0,100 0,300 0,150 0,450 0,200 0,500 0,250 0,550 0,300 0,600 0,140 0,620 0,150 0,300 0,250 0,450

17 CAUSAS DEL AUMENTO DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LCR POR AUMENTO DEL PASO DE PROTEÍNAS DESDE EL PLASMA Hemorragia g / L Hemorragia cerebral 0,3-1,5 Alteración de la BHE Meningitis bacterianas 0,8 5,0 Meningitis víricas 0,3 1,0 Obstrucción a la libre circulación del LCR Tumor espinal 1,0 20,0 POR AUMENTO DE SÍNTESIS INTRATECAL Neurolúes 0,5 1,5 Esclerosis múltiple 0,25 0,5 POR COMBINACIÓN DE LAS DOS SITUACIONES ANTERIORES Meningitis tuberculosas 0,5 3,0 Síndrome Guillain-barré 1,0 4,0

18 PROTEÍNAS DEL LCR ALBÚMINA Buen marcador del intercambio ntre el LCR y el plasma Cuantificable por métodos specíficos y con buena calidad etrológica. VR: mg/l Síntesis hepática Integridad de la BHE: QAlb = Alb Albs LCR ( mg / l) ( g / l) PREALBÚMINA Origen: plasma y ss. en los plexo coroideos ventriculares. Concentración relativa mayor en el LCR que en plasma u otros líquidos biológicos. Confirmar las pérdidas de LCR Desplazada por la transferrina-τ.

19 INMUNOGLOBULINAS ORIGEN o Plasma o Ss. intratecal muy baja CONCENTRACIÓN o IgG < 40 mg/l o Otras Ig muy inferior Aumento CIg en LCR o Aumento Ig en suero o Alteración de la BHE o Aumento de ss. local PROCEDENCIA : Razón de IgG y diversos índices o Permiten conocer si existe un ss. Intratecal de las Ig. o IgG: presencia y actividad de LB locales (E. desmielinizantes). o IgM: aparición más precoz en la RI: diagnóstico y seguimiento de procesos infecciosos e inflamatorios del SNC. o IgA: ofrece poco valor clínico en enfermedades neurológicas.

20 TRANSFERRINA DESIALIZADA TRF nativa: isoforma tetrasializada mayoritaria en suero y en LCR. TRF- τ: isoforma desializada presente en LCR (C 15-20% del total). Separación por electroforesis o β 1 TRF: nativa o β 2 TRF: : TRF- τ Secreción: TRF-τ»posible contaminación por LCR. Concentración elevada en ciertas E. neurológicas.

21 PROTEÍNA BÁSICA DE LA MIELINA ORIGEN: degradación de las vainas de mielina. Es liberada al espacio extracelular LCR: CUANTIFICACIÓN 1) Seguir la actividad de la EM 2) Ayudar en el diagnóstico de la EM 3) Asistir en el diagnóstico de la EM en el 5-10% pacientes en los cuales las bandas oligoclonales no aparecen nunca.

22 OTRAS PROTEÍNAS Proteína β-traza: diagnóstico diferencial de rinorreas y otorreas Proteína C reactiva: diagnóstico diferencial de meningitis bacterianas y víricas Cistatina (proteína γ-traza) β 2 -microglobulina: situaciones asociadas con activación o proliferación de linfocitos en SNC (linfoma metastásico) Astroproteína na: tumores gliales Fibronectina Ferritina Proteína precursora del amiloide- β Péptidos

23 ESPÉCIMEN La medición debe realizarse de manera inmediata después de la recepción de la muestra. Si se emplea electroforesis convencional para el estudio cualitativo, el LCR debe concentrarse entre 50 y 100 veces (ultrafiltración) hasta C g/l. Conservación: hasta 3 días a 2 8 ºC Obtención de muestras simultáneas de suero y LCR : Investigar la presencia de bandas oligoclonales Para calcular los distintos índices

24 RELACIÓN ENTRE LAS PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DE LCR Y DEL SUERO o o o o Existen varias fórmulas que permiten evaluar el estado de la BHE y la ss. intratecal de Ig: Cociente de albúmina. Razón de IgG Indice de Link o de IgG Indice de Tourtellotte Máxima utilidad cuando no queda demostrada la presencia de bandas oligoclonales en el LCR mediante estudios electroforéticos.

25 RECOMENDACIONES Y CONCLUSIONES Medición de la Cp en LCR: o Escasamente útil para establecer un diagnóstico diferencial entre E. neurológicas. o Diagnóstico diferencial situaciones que conducen a inflamación meníngea o a alteraciones del libre flujo de LCR. o Diagnóstico diferencial Meningitis M.Bacterianas: C proteína >1,5 g/l (LCR) M.Víricas: sólo 1% C proteína >1,7 g/l (LCR) La C proteína (LCR) puede no estar elevada al inicio de distintos tipos de meningitis.

26 La detección de B. Oligoclonales en LCR: o Imprescindible para confirmar la ss. intratecal de Ig que se producen en la EM (método separación proteica) o La EEF convencional del LCR concentrado: detección de b. oligoclonales. o Inmunofijación: confirmación de B.oligoclonales e identificación de Ig. Para confirmar la ss.intratecal de Ig: o Estudio electroforético o Análisis cuantitativos de Ig : - específicos - calidad metrológica

27 MÉTODOS DE SEPARACIÓN PROTEICA. Finalidad: detección de bandas oligoclonales. Procedimientos más utilizados para su fraccionamiento: Electroforesis en acetato de celulosa o el gel de agarosa seguida de inmunofijación- o en gel de poliacrilamida. Isoelectroenfoque en gel de agarosa o en gel de poliacrilamida. Electoctroforesis capilar

28 ELECTROFORESIS Fracción Prealbúmina Albúmina α1-globulina α2-globulina β-globulina γ-globulina % respecto a proteína total Proteinograma LCR Intervalos de referencia electroforesis de proteínas en LCR.

29 ELECTROFORESIS Proteinograma normal en LCR Proteinograma patológico en LCR

30 INMUNOFIJACIÓN Inmunonefelometría / Inmunoturbidimetría Gammapatías monoclonales: Un solo clon de célulasc lulas. de plasma produce elevados niveles de Ig de una sola clase o tipo: o Benignas o Malignas: mieloma múltiple, macroglobulinemia Waldeström Gammapatías policlonales: Debido a desórdenes clínicos (E. crónica del hígado, desórdenes de colágenos, artritis reumatoide e infecciones crónicas).

31 En la Esclerosis múltiple: El patrón de B. Oligoclonales en el LCR, es característico de cada paciente y permanece inalterable en el tiempo. La concentración de Ig en el LCR, puede afectarse por efectos del tratamiento. Pérdida de LCR en rinorreas u otorreas: Demostrar presencia de transferrina-τ : m.separación n proteica. Procesamiento en paralelo del LCR y del suero del paciente. Electroforesis bidimensional: Péptidos (LCR) cuadros neuropsiquiátricos. Etiología Mejoran dignóstico y seguimiento.

32 Causas de meningitis MICROBIOLOGÍA más frecuentes DEL LCR según la edad S. agalactiae. 30 S. Pneumoniae 25 N. Meningitidis 20 E. coli. 15 H. influenzae 10 L. monocytogenes 5 0 Neonatos 1mes - 5años 5-19 años <= 65 años > 65 años

33 ANALISIS MICROBIOLÓGICO TINCIONES: -Tinción de GRAM: % sensibilidad Neisseria meningitidis Neumococos

34 OTRAS TINCIONES: - Ziehl-Nielsen o Auramina para Mycobacterium Tb - Tinta China para criptococo. CULTIVOS EN MEDIOS ADECUADOS: Permite un uso adecuado de antibióticos y de determinar su patrón de sensibilidad. (AGS, AG Chocolate y Schaedler) PRUEBAS SEROLOGICAS: - No dependen de bacterias viables para resultados positivos - Son especialmente útiles cuando el GRAM es negativo - Test simples con gran disponibilidad en los laboratorios. - Latex o pruebas de aglutinación: Ej. Cripto-Latex en LCR, VDRL en LCR para neurosífilis, Latex para Brucella, etc

35 PRUEBAS MOLECULARES: Pruebas de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de: o Virus: Herpes: Simplex, V. Zoster, Epstein Barr; enterovirus, adenovirus, citomegalovirus o Bacterias: N. meningitidis, H influenzae, Micobacterium Tb, o de MO de recuperación difícil con los métodos convencionales VENTAJAS vs DESVENTAJAS: Sensibilidad y Especificidad mayor de 90%. Posibilidad de detectar varios MO por una PCR múltiple Métodos comerciales Métodos de extracción no automatizados Dificultades para la estandarización y cuantificación Ausencia de gran disponibilidad debido a su coste.

36 LCR en diversas patologías Patología Aspecto Células Proteína Glucosa Meningitis Turbio <40 *90% bacteriana 10000* Polis Meningitis vírica Claro o ligeramente turbio Monos Normal 24 a 36h predominio Polis Meningitis Claro <45 tuberculosa Meningitis fúngica Ligeramente <45 Polis turbio Xantocrómico Hemorragia Subaracnoidea Aumenta Normal o Aumenta Espectrofotometría

37 ANÁLISIS BÁSICO DEL LCR Relación al diagnóstico patológico en las demencias Robinson-Agramonte MA, Hernández Díaz E, Robinson Agramonte J, Macías Betancourt R, Galvizo R. (Rev Mex Neuroci 2003)

38 RESUMEN La RI humoral (SNC) muestra patrones de respuesta de síntesis intratecal de Ig: Causa de la enfermedad Fisiopatología de la enfermedad Localización de la enfermedad Patrones de respuesta para las 3 clases de Ig en 15 pacientes con distintos tipos de demencia. Análisis: Estimación cuantitativa Ig y albúmina en suero y LCR Reibergrama: razón albúmina y síntesis intratecal Utilidad del análisis básico del LCR en diagnóstico patológico de E. neurológicas.

39 ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA) Es la más común y devastadora enfermedad neurodegenerativa Características: Demencia progresiva entre quinta y sexta décadas de la vida Historia familiar de HAD EA esporádica de comienzo tardío Diagnóstico clínico: Exclusión de otras enfermedades demenciales Marcadores neuroquímicos: estadíos tempranos, información. Vías que facilitan el análisis de marcadores neuroquímicos.

40 ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA) Vías que facilitan el análisis de marcadores neuroquímicos 1. Neuroimagen 2. Marcadores sistémicos (sangre o células sanguíneas) 3. Líquido cefalorraquídeo: exclusión diagnóstica de otras demencias Evaluación en la funcionalidad de BHE Síntesis intratecal de Inmunoglobulina: incremento del índice de IgG e IgM presencia de bandas oligoclonales específicas en LCR

41 MATERIALES Y MÉTODOS Evaluación de LCR y suero de 15 pacientes con dignóstico de demencia PACIENTES 8 E.Alzheimer (EA) (4 M, a; 4 H, a) 6 Demencia vascular (DV) (5 M, a; 1 H, 59 a) 1 Demencia 2ª neurosífilis (DSNS) (47 a) 8 Sujetos controles (4 M, a; 4 H, a) (sometidos a intervención quirúrgica por enfermedades no neurológicas) En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado para su inclusión en el estudio

42 MATERIALES Y MÉTODOS Criterios Diagnóstico Diagnóstico EA probable : criterios internacionalmente aceptados de la NICDS-ADRDA Work Group Diagnóstico D.Vascular probable : criterios internacionalmente aceptados Diagnóstico DSNS: estudios serológicos y del LCR (serología reactiva 1:128 y VDRL LCR 1:512) Criterios de exclusión Pacientes o controles excluídos: historia de trastornos cognitivos o enfermedad orgánica crónica con repercusión sobre el SNC o niveles elevados de PCR

43 PROCEDIMIENTO ANALITICO CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Determinación de la concentración de albúmina, IgG, IgA e IgM en LCR y suero (Inmunonefelometría). Detección de bandas oligoclonales (Focalización isoeléctrica en agarosa). Síntesis intratecal IgA, IgG, IgM: Incremento fracción intratecal de Ig sintetizada en SNC (Reibergrama) Detección de bandas oligoclonales restringida al LCR: indicativo de síntesis intratecal (criterios Grupo de Expertos de Europa )

44 REIBERGRAMA Formulación más integral para la determinación cuantitativa de Ig localmente sintetizadas en SNC QIgG (IgG LCR/Suero) QAlb (Albúmina LCR/Suero) Evaluación de la función de la barrera LCR/sangre QAlb EDAD 5,0x10-3 4meses-15años 6,5x años 8,0x años Diferencia la fracción de IgG del cerebro de la IgG presente en el LCR de la sangre. Síntesis intratecal: FI>10%

45 REIBERGRAMA En el diagrama se representan 5 rangos 1. Rango normal 2. Disfunción pura de la barrera 3. Disfunción de la barrera sangre/lcr más síntesis de IgG en SNC 4. Síntesis intratecal IgG en SNC sin disfunción de la barrera sangre LCR Valores en el área 5 indican error metodológico

46 Respuesta para las diferentes clases de inmunoglobulinas RESULTADOS E.A D.V. DSNS E.A. y D.V no mostraron ss. intratecal Ig; sí DSNS Incremento de la razón albúmina en D.V. (QAlb = 12.6 x10-3 ) en ausencia de ss. Intratecal D. 2ª Neurosífilis (DSNS): o Ss. intratecal IgG: 63% o Ss. intratecal IgM: 90% o Presencia B.O.de IgG en LCR. o Patrón de comportamiento de la forma parenquimatosa de la enfermedad Patrón del Reibergrama para cada tipo de demenc

47 DISCUSION Patrones de ss. Ig Dependen de causa, fisiopatología y localización enfermedad Asocian patrón de respuesta con fisiopatología, y no con curso agudo o crónico de la enfermedad Reciente herramienta adicional para el diagnóstico de E. neurológicas, incluídas las demencias. El patrón de respuesta observado en este trabajo concuerda con reportes de otros autores.

48 Análisis inmunológico del LCR útil en diagnóstico de exclusión en el síndrome demencial complementario al estudio in vivo de otros marcadores más específicos detectables en este fluído

49 Gracias

50 VALORES DE REFERENCIA PARA EL LCR